导读:本文包含了多功能淀粉酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:海藻附着微生物,异源表达,酶学性质,多功能淀粉酶
多功能淀粉酶论文文献综述
潘爱红[1]（2019）在《印尼大型海藻附着微生物产多功能淀粉酶Amy2587的性质研究》一文中研究指出分布于印度尼西亚Halmahera岛的热泉主要受火山影响形成,热泉周边水域中生存着许多大型海藻,海藻表面附着着数量庞大的微生物,而这些微生物是发掘潜在的新型生物活性物质和酶类的重要源泉,已引起越来越多研究人员的关注。本研究主要以从印尼热泉采集的叁种海藻样品附着微生物为研究对象,通过宏基因组分析手段来筛选活性高、稳定性好的淀粉酶序列进行表达及酶学性质研究,为工业应用寻找合适的淀粉酶产品。首先,本文提取了从印尼采集的叁种大型海藻附着微生物的基因组DNA并对其进行了宏基因测序和分析,叁个样品共获得了148464条基因序列。物种注释丰度信息结果显示,印尼大型海藻表面附着微生物优势菌群为弧菌属(Vibrio)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、发光杆菌属(Photobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter);功能注释信息结果显示,海藻样品附着微生物碳水化合物活性酶(CAZymes)基因主要以GT(糖基转移酶)基因为主,其次为GH(糖苷水解酶)和CBM(碳水化合物结合模块)基因。通过进一步筛选分析,共获得了116条淀粉酶编码基因,分属于GH13、GH57、GH15、GH66、CBM20、CBM25、CBM26、CBM35、CBM48家族。其次,选取其中一条含GH66家族功能域的淀粉酶基因amy2587进行了基因表达。淀粉酶基因amy2587,核酸序列全长1785 bp,编码587个氨基酸,理论分子量为67.46 kDa。将淀粉酶基因amy2587与表达载体pET-30a进行连接,构建重组质粒pET-30a-amy2587,将pET-30a-amy2587转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中。含有重组质粒的工程菌在IPTG浓度为0.5 mM条件下,16℃诱导培养16 h,菌体进行细胞破碎,破碎上清液经Ni-NTA层析柱纯化,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白在咪唑洗脱液浓度为80 mM获得单一目的条带,分子量为70 kDa,与理论分子量一致,该结果证实了目的基因amy2587在大肠杆菌中实现了正确表达,并获得了纯化的重组蛋白Amy2587。然后,对重组淀粉酶Amy2587进行了酶学性质研究。试验结果表明:重组淀粉酶Amy2587不但具有降解淀粉的能力,还能够降解琼胶、卡拉胶、褐藻胶和羧甲基纤维素钠,其中以降解淀粉能力最强,其酶活力达到63.38 U/mL,表明Amy2587是一种多功能淀粉酶。多功能淀粉酶Amy2587与不同底物反应,最适作用温度为50℃,且具有良好的热稳定性,在50℃条件下保温1-4 h,酶活性可维持在85%以上,随着保温时间的增加,酶活性逐渐降低,保温24 h以后,残余酶活仍为60%以上;最适pH为10.0,其淀粉酶和琼胶酶活性在pH 6.0-10.0之间,残余酶活保持在77%,表明Amy2587具有较强的碱耐受性;Mn~(2+)、Fe~(2+)、K~+、和Na~+金属离子对Amy2587的多重底物活性具有不同程度的促进作用,但在Cu~(2+)的作用下,所有酶活性几乎丧失。Amy2587对淀粉、琼胶、卡拉胶、褐藻胶和羧甲基纤维素钠底物的K_m值分别为:4.06、10.10、12.25、11.54、14.91 mg/mL,表明Amy2587与淀粉底物的亲和力最好。最后,本文对Amy2587的多功能机制进行了初步研究。采用基因敲除手段将Amy2587序列中叁个功能域进行了敲除,并将敲除基因后的序列进行表达和活性研究。结果表明,敲除相应功能域后,重组酶的活性有不同程度的减小,说明这些功能域对该酶的多重底物活性具有一定作用,但并不能改变其多重底物活性的特性。此外,还研究了脂肪酸和脂肪酸甲酯(亚油酸甲酯、油酸甲酯、硬脂酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸)对Amy2587多重底物活性的影响,结果表明亚油酸对Amy2587的多重底物活性有明显的抑制作用,油酸对Amy2587的淀粉酶、褐藻胶裂解酶和羧甲基纤维素钠酶活性有一定的抑制作用,而对琼胶酶和卡拉胶酶活性几乎没有影响。而有关Amy2587的多功能机制仍需要进一步深入研究。(本文来源于《青岛科技大学》期刊2019-06-02）
夏莹,曹昊,张应玖[2]（2015）在《多功能淀粉酶固定化中的底物保护效应》一文中研究指出以壳聚糖为载体,通过正交实验确定了用壳聚糖凝胶微球固定多功能淀粉酶OPMA-N的最适条件:以20 mg/m L戊二醛交联,在25℃及p H=6.5条件下固定1.5 h,但需在引入底物淀粉介导的保护效应后,才能获得良好稳定性的固定化OPMA-N(IOPMA-N),显示了底物保护效应在催化部位占分子中较大区域的酶(如OPMA-N)固定化过程中的重要性.对比分析游离酶与固定化酶的性质与功能发现,在50℃及p H=6.0~7.0条件下,IOPMA-N的表观比活力比游离酶OPMA-N提高3倍以上,催化效率(kcat/Km)提高4倍以上,对弱酸性至中性及常温(30~50℃)环境的耐受性明显高于OPMA-N,并具有良好的操作稳定性和储存稳定性,重复使用15次后,酶活力仍然能够保持75%,在4℃下储存半衰期达31 d,而OPMA-N在4℃下储存5 d后活力基本丧失.催化产物的对比分析结果表明,OPMA-N固定化后,水解活性明显提高,但同时转苷活性有所下降,这与已报道的OPMA-N分子中2种催化活力存在平衡机制的结论一致,同时也表明在OPMA-N的固定化中底物淀粉对其水解活性有明显的保护作用,但对其转苷活性几乎无贡献.(本文来源于《高等学校化学学报》期刊2015年02期）
王苗,李园园,岳昌武,邵美云,吕玉红[3]（2015）在《链霉菌Streptom yces olivaceusFXJ7.023多功能葡糖淀粉酶SoGA的克隆、表达及鉴定》一文中研究指出根据海洋来源链霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023基因组测序结果设计特异引物,通过PCR扩增获得1条全长为1 788 bp的糖苷水解酶15家族蛋白新成员完全编码区DNA片段,该片段编码1个595个氨基酸残基、分子量为66.2 k D的预测蛋白。利用基因工程技术将该片段重组入原核表达质粒p ET32a并转化宿主菌BL21(DE3)ply Ss,IPTG诱导融合蛋白表达,表达的包涵体融合蛋白经纯化、复性后利用DNS法测定其在不同温度、p H条件下催化不同底物产生还原糖的活性。结果表明,该酶能够水解纤维素、淀粉等多种底物产生还原糖活性,且对不同底物表现不同的最适p H和最适反应温度。(本文来源于《生物技术通报》期刊2015年02期）
夏莹[4]（2014）在《壳聚糖微球的制备及其固定化多功能淀粉酶OPMA-N的研究》一文中研究指出多功能淀粉酶是α-淀粉酶家族中的一员，同时具有多种催化活性，包括水解α-1,4糖苷键或α-1,6糖苷键，转糖苷形成α-1,4糖苷键或α-1,6糖苷键。目前已经发现的多功能淀粉酶亚家族的成员多数是嗜热酶或中温酶，它们的催化性质比较接近，分子量一般在60kD～70kD。多功能淀粉酶对人类的健康生活具有重要的意义，在工业生产中可最大限度地节约资源，催化淀粉降解、转化，生成异麦芽低聚糖和麦芽低聚糖产物，具有重要的生理功能和药用价值，但在实际应用中，多功能淀粉酶的催化活性受到很多因素的限制，使其不利于应用和生产。酶工程领域的固定化技术是上世纪中期发展起来的一项技术，它针对酶在催化过程中的诸多缺点进行改良，在保留酶催化高效性的同时也提高了它的稳定性和重复使用性，大大节约了反应的成本，使酶在工程领域的应用得到了极大的发展，得到了人们的广泛关注。研究中，除了根据酶的性质选择合适的固定化方法以外，载体的选择尤为重要。壳聚糖是一种常见材料，它是从甲壳类动物、昆虫外壳或真菌的细胞壁中提取的一种氨基多糖（2-氨基-2,4-β葡聚糖），来源丰富、制备简单、价格低廉，并具有诸多优良特性，如生物兼容性、生理惰性、无毒副性、抗菌性、良好的机械性、可天然降解并且降解产物亦无毒等，因此长期以来备受关注。本文以壳聚糖为载体，通过中和滴定法制备壳聚糖凝胶微球，对实验室保存的多功能淀粉酶OPMA-N进行固定化。通过改变壳聚糖凝胶微球制备过程中的一些成球条件，选择最佳的成球组合。设计正交实验，确定固定化过程中的主要限制因素，确定最佳固定化条件的组合。以最佳条件进行固定化后，我们对该固定化多功能淀粉酶OPMA-N进行酶学性质的测定与分析，与其游离形式进行比较，观察固定化后性质的变化。实验后我们发现，固定化多功能淀粉酶OPMA-N性质优越，比活力较其游离形式提高了近3倍；在重复使用15次以后，酶活力较初始相比仍然能够保持75%；游离多功能淀粉酶OPMA-N在4℃条件下储存5天后，活力基本丧失，而固定化多功能淀粉酶OPMA-N在4℃条件下的储存半衰期达到了31天；pH稳定性也得到了明显的提高。综上所述，本文通过中和滴定法得到了壳聚糖凝胶微球，利用正交设计得到了固定化的最佳方案，在此方案的基础上我们得到了性能稳定的固定化多功能淀粉酶OPMA-N。这种固定化多功能淀粉酶OPMA-N不再局限于均一相的反应中，对反应条件的适应能力也得到了明显提高，该制备方法简单，成本低，具有很大的应用前景。(本文来源于《吉林大学》期刊2014-05-01）
李雁飞,夏莹,梁小博,张应玖[5]（2014）在《多功能淀粉酶OPMA在枯草杆菌中的分泌表达及发酵条件优化》一文中研究指出构建多功能淀粉酶OPMA-N和OPMA-G的分泌表达载体pMA5-OPMA-N和pMA5-OPMA-G,应用枯草杆菌表达系统实现了多功能淀粉酶OPMA-N与OPMA-G的表达与分泌,并分别对其发酵工艺进行优化.实验结果表明:OPMA-N适宜的表达与分泌条件为:质量分数为1%的MgSO4、质量分数为0.3%的尿素和质量分数为0.5%的酵母粉为培养液,pH=6.5,培养液装液量为16%,37℃发酵培养48h;OPMA-G的最适分泌表达条件为:质量分数为1%的NaCl、质量分数为1%的淀粉和质量分数为0.8%的酵母提取物为培养液,pH=7.0,培养液装液量为32%,37℃发酵培养36h;在上述条件下,OPMA-N和OPMA-G的分泌水平分别为发酵液中总蛋白的45%和58%,分泌酶的比活力分别为每毫克4.57和4.65酶活力单位.(本文来源于《吉林大学学报(理学版)》期刊2014年02期）
曹昊[6]（2013）在《多功能淀粉酶OPMA-N功能集成性的机制研究》一文中研究指出糖苷水解酶家族13是一类专门作用于α糖苷键的酶，也称作α淀粉酶家族，这个家族拥有数量庞大的成员，它们具有不同类型的催化性质，包括α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键的水解和转糖苷活性。其中，糖苷水解酶家族13中的第20亚家族（新普鲁蓝酶亚家族）因为同时具有上述2种或4种催化活性，而被作为多功能淀粉酶成为研究热点。我们之前发现了一株来自于Bacillus sp.ZW2531-1菌株的嗜热多功能淀粉酶，命名为OPMA-N，它可以经水解和转糖苷反应将廉价的淀粉催化生成麦芽糖，麦芽叁糖，异麦芽叁糖和异麦芽四糖，而异麦芽低聚糖作为一种双歧因子具有较高的经济价值和药用价值。近年来，随着对蛋白质结构信息了解的加深，以及计算机软硬件技术的发展，蛋白质的合理设计技术得到了较快发展和应用。结合蛋白质工程手段对蛋白质进行改造，不光有利于得到功能更优的蛋白质（酶），还可以更深入地研究蛋白质结构和功能之间的内在关系。在本文的研究中，我们首先利用同源建模的方法得到了OPMA-N的初始结构模型，然后利用分子力学和分子动力学方法对初始模型进行了优化，多种评估软件证明了OPMA-N模型的合理性。通过对模型的分析，并结合家族基因的同源序列的比对，本文选定了两个重要的氨基酸残基（Trp358，Val328）进行定点突变，并选择了以N端结构域为核心模块的多种重组酶进行结构域重组以及模块组合的研究。本研究首先模拟构建了358位点不同氨基酸的20种3D结构模型，并把它们与底物分子进行对接，结合分子对接结果和氨基酸侧链极性、电荷、位阻等因素，将这些氨基酸分为5类，进而选取了7种突变株进行研究，它们分别是W358K，W358R，W358N，W358T，W358G，W358D，W358E。在利用分子生物学手段构建突变载体，表达纯化得到7种突变株的纯酶之后，我们通过对它们进行性质测定发现，将此位点的W突变成具有正电荷侧链的K和R之后，它们的产物以葡萄糖为主，其比例达到了83.6%和80.2%，同时伴有少量的麦芽糖，而野生型和其它突变性的催化产物是没有葡萄糖的，这个结果说明W358K和W358R已经丧失了绝大多数转糖苷活性，成为了完全的淀粉水解酶。相反，W358N/T，W358D/E的产物中低聚异麦芽糖比例有提高，说明它们的转糖苷活性得到了提高。另外一个比较明显的变化是，W358K/R的酶活力提升了近40%，其Km值较野生型下降，同时kcat值升高，这样的突变提升了酶与底物的亲和力以及酶的催化效率。突变体W358E的酶活力比野生型提高了近一半，而其Km值和kcat值均升高，说明这样的突变在提升酶催化效率的同时却降低了酶与底物的结合能力。W358N/T的活力、动力学数值与野生型相近，而W358G在催化效率上远低于野生型OPMA-N。W358K/R和W358D/E突变体的热稳定性要略好于野生型，可能是这些引入的带电荷且具有一定空间位阻的氨基酸残基增加了此位点与附近氨基酸残基的相互作用，从而增加了酶分子的稳定性。酶分子寡聚化的实验结果显示，不同的突变体，从单体到五聚体的比例也不相同，尤其是单体与二聚体的比例、单体与二聚体之和所占的比例有可能影响着酶分子的催化形式和性质。最后，我们试图通过研究计算机模拟分子对接结果来找到突变酶催化性质变化的分子机理，野生型中W358残基在底物结合口袋+2亚位点处形成了很强的空间位阻，这样的结构导致了OPMA-N水解和转糖苷活性的平衡，而突变体中底物结合的方向和位置都发生了改变，N/T358和D/E358与底物+3和+2位点分别形成了氢键，它们与底物以及E356的相互作用也发生了很大变化。而K/R358与底物以及催化残基E356形成了很强的相互作用网络，G358的突变则丧失了此位点的原有位阻和与周围残基的相互作用。本文选择的另一个重要氨基酸突变靶点是V328，同时根据已有的研究报道，我们想研究一下此位点氨基酸侧链位阻的大小是否决定多功能淀粉酶OPMA-N的催化类型，因此设计了叁种突变体分别是V328I，V328A和V328G。实验结果显示，此位点处过大的侧链I和过小的侧链G都会显着降低催化活性。而当V突变成大侧链的I后，产物中异麦芽低聚糖的含量明显下降，而反之V328A和V328G中其含量略有升高。另外一个比较显着的变化是，将V突变成A之后，此酶对β-CD有了一定的催化活性，产物以麦芽糖和麦芽叁糖居多。此位点突变对酶的pH、温度性质影响不大，而对酶分子的寡聚化程度有影响。分子对接结果显示，此位点对邻近的N330、受体糖结合位点E331及催化残基D327的位置和取向有一定影响，尤其是V328A突变体中N330与底物+2亚位点形成两根氢键，明显将底物拉向受体糖结合口袋方向，或许这就是它底物特异性和产物比例变化的原因。另一方面，本文围绕新普鲁兰酶亚家族的核心N端结构域构建了OPMA-NN、OPMA-TNT、OPMA-NTN克隆，加上原有的OPMA-N和OPMA-NT，我们对不同结构域重组体以及不同模块的等分子数组合进行酶学性质检测发现，它们的产物比例并不发生明显变化。模块组合的活力和组合之前基本差别不大，OPMA-TNT的活力略高于野生型。一个比较明显的结果是，具有两个N端结构域的重组体OPMA-NTN的热稳定性较野生型提高了20℃，结合OPMA-N和OPMA-NT的对比，我们发现N端结构域对酶的热稳定性有着很大贡献。综上，本文通过对多功能淀粉酶OPMA-N关键氨基酸残基的合理性定点突变实验，及以N端结构域为核心的模块重组实验，并结合计算机模拟分子对接结果，在一定程度上揭示了OPMA-N催化功能集成性的机制。同时得到了一些具有工业应用价值和潜力的突变酶如OPMA-N/W358N，OPMA-N/V328A，OPMA-NTN。(本文来源于《吉林大学》期刊2013-12-01）
梁小博[7]（2012）在《多功能淀粉酶OPMA-G模块重组体的结构与功能研究》一文中研究指出多功能淀粉酶OPMA-G模块重组体的结构与功能研究多功能淀粉酶(multifunctional amylases, MFA),包括新普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶和环麦芽糊精酶,作为α-淀粉酶家族的一类新成员,可以用廉价的淀粉作为原料,生成具有重要生理功能的异麦芽低聚糖。异麦芽低聚糖已被公认为是双歧杆菌的生长促进因子,简称“双歧因子”。本课题组从土壤中筛选并分离出一种产淀粉酶菌株Bacillus sp.ZW2531-1,它可将淀粉转化为麦芽低聚糖和异麦芽低聚糖,包括麦芽糖、麦芽叁糖、异麦芽叁糖和异麦芽四糖,但不产生葡萄糖。本论文以本课题组筛选出的野生型多功能淀粉酶OPMA-G基因和已构建的C端截短突变体OPMA-GT基因为基础,分别构建了模块重组体OPMA-GFG基因和C端结构域OPMA-GC基因,并构建重组表达载体pET28a-OPMA-GC和pET28a-OPMA-GFG,转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达,经SDS-PAGE检测OPMA-G、OPMA-GT和OPMA-GC表达率均为40%,OPMA-GFG表达率为23%。表达产物均以包涵体形式存在。用变性剂8M尿素将包涵体溶解,Ni2+-NTA柱亲和层析纯化后,SDS-PAGE检测纯度均在95%以上。用硫酸铵盐析法沉淀目的蛋白,用lOmM pH10PBS缓冲液溶解沉淀,得到可溶性蛋白质。在酶摩尔数相等的条件下分别测定OPMA-G、OPMA-GFG、OPMA-G+OPMA-GT、OPMA-GT+OPMA-GC OPMA-GT和OPMA-GC的酶活力并进行相互比较,OPMA-G、OPMA-GT与本课题组以往测得的结果基本相符,而模块重组体OPMA-GFG较野生型OPMA-G有所提高,OPMA-GT+OPMA-GC较OPMA-G略有下降,OPMA-G+OPMA-GT活性相对最高,OPMA-GC未显示出活力。通过测定各重组体的最适温度和温度稳定性,我们发现,OPMA-GFG和OPMA-GT+OPMA-GC的最适反应温度与野生型OPMA-G相同,为50℃,OPMA-GT和OPMA-G+OPMA-GT则下降为40℃和30℃。3080℃温度范围内孵育1h测得的残余活力,OPMA-G、OPMA-GT、OPMA-GFG和OPMA-GT+OPMA-GC在30℃50℃之间都保持在70%以上的活力,模块重组体OPMA-G+OPMA-GT在30℃60℃之间都保持在40%以上的活力。OPMA-G、OPMA-GT和OPMA-GT+OPMA-GC的最适pH为7.5,OPMA-GFG最适pH为7.0,而OPMA-G+OPMA-GT最适pH为8.0,另外,OPMA-G、 OPMA-GT和OPMA-GT+OPMA-GC在pH6.0-8.0之间,残余活力均保持在50%以上,而OPMA-GFG和OPMA-G+OPMA-GT在pH3.0-8.0范围内均可保持50%以上的活力,说明此范围内较稳定。通过分析钙离子对淀粉酶影响,发现五种酶均为非钙离子依赖性酶。底物、产物特异性分析表明,OPMA-G、OPMA-GT、OPMA-GFG、 OPMA-G+OPMA-GT和OPMA-GT+OPMA-GC具有相同的底物、产物特异性,最适底物均为可溶性淀粉,催化淀粉反应产物均为麦芽糖、麦芽叁糖、异麦芽叁糖和异麦芽四糖,均不产生葡萄糖。最后,我们进行了几种重组体的酶反应动力学实验,结果显示,与野生型相比OPMA-GT、OPMA-GFG和OPMA-GT+OPMA-GC的Km值升高,OPMA-G+OPMA-GT没有变化；OPMA-GT和OPMA-GT+OPMA-GC的kcat值反而下降,OPMA-GFG的kcat值有一定程度的升高。通过对多功能淀粉酶OPMA-G以及其不同模块重组体的各种酶相关参数的测定,我们得出以下结论：①C端结构域对酶的稳定性、底物结合能力以及酶的催化效率都有贡献,但这种贡献主要体现在C端结构域与淀粉酶催化结构域共价相连的基础上,而游离的C端结构域对上述作用影响较小；②一个酶分子上存在两个催化中心的OPMA-GFG分子与底物淀粉的结合能力有所下降,我们推测这可能是因为OPMA-G分子中又添加了一个以TIM筒状结构为主体的催化域,导致这两个催化域之间可能在空间上互相靠近或拥挤造成了一定的空间障碍,影响了他们各自与底物的结合效率所致,也可能是因为这种结构进一步形成的寡聚化形式与OPMA-G相比不利于底物的结合所致,另一方面,OPMA-GFG的kcat值较OPMA-G增高,显然这与分子中增加了一个催化域是一致的,综合以上两方面的影响,最终OPMA-GFG的催化效率与OPMA-G相似。③OPMA-G+OPMA-GT在亚分子单位上与OPMA-GFG是一样的,但是OPMA-G和OPMA-GT是分开的,所以这种外组合的动力学参数与野生型基本相似,但与OPMA-GFG有差异,这也证明了通过共价相连的OPMA-GFG重组体在底物结合时存在着一定的阻碍。④这五种重组体无论催化效率还是酶学特征发生了怎样的变化,他们的底物和产物特异性都没有发生明显的变化,这说明模块重组的形式对他们的催化效率以及结构稳定性有影响,但对酶分子本身的催化性质却没有产生明显影响。随着对分子酶学研究手段的不断丰富,以及结构生物学的飞速发展,我们对已有酶分子结构和功能的了解与研究也将不断深入和全面,这必将对未来更好地开发新酶以及对已有酶分子进行定向分子改造有着重要作用。(本文来源于《吉林大学》期刊2012-05-01）
郝倩[8]（2011）在《多功能淀粉酶OPMA-G的结构与功能研究》一文中研究指出α-淀粉酶(EC 3.2.1)是一类能够降解淀粉的酶,其中一部分既具有水解酶的活性又具有转苷酶的活性,被称为多功能淀粉酶。本实验室克隆并表达了多功能淀粉酶OPMA-G,在结构上它具有α-淀粉家族共有的4个保守的区域,同时功能上又兼有水解酶和糖苷转移酶的催化活性,其催化淀粉降解的产物为麦芽糖、麦芽叁糖、异麦芽叁糖、异麦芽四糖,但不产生葡萄糖,其中异麦芽叁糖和异麦芽四糖属于异麦芽低聚糖。异麦芽低聚糖具有双歧因子功效,相对于传统糖而言,他们具有改善肠道微生物菌群的功能,并能够预防龋齿。因此,对OPMA-G结构与功能的研究可为此类酶的分子改造和功能优化提供理论指导。为了阐明OPMA-G的特异C端结构域的功能,本论文基于本室保留的OPMA-G基因获得了C端截短的ΔOPMA-G的基因,构建了重组表达载体pET28a-ΔOPMA-G,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了有效表达,表达产物以包涵体形式存在,表达率为42%。对表达的包涵体采用脲素浓度梯度透析的方法进行完全复性,复性的ΔOPMA-G经SDS-PAGE检测纯度达85%以上。通过对比分析OPMA-G与ΔOPMA-G的性质与功能,结果显示：OPMA-G与ΔOPMA-G的比活力分别为8.22 U/mg,6.53 U/mg,最适温度分别为50℃,40℃,最适pH均为7.5。OPMA-G与ΔOPMA-G均只特异性识别和水解淀粉,但不作用普鲁兰和p-环糊精,酶促生成产物也均为麦芽糖、麦芽叁糖、异麦芽叁糖及异麦芽四糖,产物比例无差异。此外,OPMA-G与ΔOPMA-G均表现为非钙离子依赖性酶,Zn2+Ni2+和K+对两者均有激活作用,而Fe3+,Fe2+,Cu2+及EDTA均有抑制作用。非变性电泳结果显示：ΔOPMA-G仍以单聚体、二聚体、叁聚体等多聚体的状态存在,说明C端对OPMA-G寡聚化无影响。相对于OPMA-G的淀粉吸附率(8.5%),ΔOPMA-G降低为5.8%,由此推测OPMA-G的C端与底物的吸附相关,C端的缺失引起了底物吸附率的降低,进而影响了酶活力的降低。为了进一步研究OPMA-G的结构与功能的关系,本论文对多功能淀粉酶OPMA-G进行同源建模及序列分析,选定V200进行定点突变来研究V200位点对于酶的影响。实验采用重迭PCR方法得到OPMA-G的两个点突变体OPMA-GM3 (V200G)和OPMA-GM4 (V200K)基因,并构建了重组表达载体pET28a-OPMA-GM3和pET28a-OPMA-GM4。两个突变体分别在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了有效表达,表达率分别为37%和38%。表达产物OPMA-GM3、OPMA-GM4均为可溶性表达,经Ni2+-NTA柱纯化后,SDS-PAGE检测纯度均在95%以上。与野生型OPMA-G的比活力8.22 U/mg相比,突变体OPMA-GM3、OPMA-GM4的比活力分别为9.51,8.63U/mg。酶学性质研究结果表明：突变体OPMA-GM3、OPMA-GM4同样只特异性的识别和水解淀粉底物,OPMA-GM4同OPMA-G一样水解淀粉产物为麦芽糖、麦芽叁糖、异麦芽叁糖及异麦芽四糖,OPMA-GM3产物除上述低聚糖外还有葡萄糖,而且麦芽糖明显增多,而OPMA-GM4的催化产物中异麦芽叁糖的比例增多。两种突变体酶的最适温度仍为50℃,在30℃-70℃孵育1h后仍能保持70%以上的活力。OPMA-GM4的最适pH未发生变化,仍为7.5,pH稳定性也无变化,但OPMA-GM3的最适pH则降低为7.0,其pH稳定性也发生了酸移。此外,各种离子对突变体酶的影响与野生酶OPMA-G相同。以上实验结果表明：位点V200的空间位阻与电荷对酶的催化性质可能均有影响,较大的空间位阻和正电荷有利于分支产物的生成。迄今为止,人们对多功能淀粉酶的结构与功能的关系仍未了解透彻,其水解、转苷的催化机制也未完全阐明。近几十年来,研究者不断的通过分子改造技术来研究多功能淀粉酶的结构与功能的关系。由于计算机模拟技术的提高,定点突变技术更多的应用于多功能淀粉酶的分子改造。本课题着重分析了多功能淀粉酶OPMA-G的C端片段及V200位点对酶催化功能的影响,为进一步优化OPAM-G的功能提供了理论依据,为其工业应用奠定了基础。(本文来源于《吉林大学》期刊2011-05-01）
谷艳芹[9]（2010）在《多功能淀粉酶OPMA-G的表达与性质研究》一文中研究指出本实验室从土壤中筛选得到产淀粉酶菌株Bacillus sp.ZW2531-1。从Bacillus sp.ZW2531-1基因组扩增获得了OPMA-G基因(其序列已提交GenBank,登录号为EU740389),并构建了重组表达载体pET28a-OPMA-G。本论文以OPMA-G基因为研究对象,运用蛋白质工程的合理设计—定点突变技术对OPMA-G进行分子改造,获得了突变体OPMA-GM1(S203E,S205D)和OPMA-GM2(V200P)基因,并构建了表达载体pET28a-OPMA-GM1和pET28a-OPMA-GM2,分别在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物用Ni2+-NTA柱进行亲和层析纯化。经SDS-PAGE检测显示单一条带,分子量大约为66kD。分别对叁种酶进行酶学性质的研究,结果表明,叁种酶的最适温度均为50℃,最适pH均为7.5,且均为非钙离子依赖性淀粉酶。叁种酶均能降解淀粉产生麦芽糖,麦芽叁糖,异麦芽叁糖及异麦芽四糖,但不作用于普鲁兰和β-环糊精。突变体OPMA-GM1的水解活力和转苷能力有一定的提高,突变体OPMA-GM2催化淀粉反应产物中含α-1,6糖苷键的低聚糖的比例增加了。(本文来源于《吉林大学》期刊2010-05-01）
李雁飞[10]（2010）在《多功能淀粉酶OPMA在枯草杆菌中的分泌表达与性质研究》一文中研究指出本论文研究了OPMA基因在枯草杆菌表达系统中的分泌表达及表达产物的酶学性质。分别将OPMA-N和OPMA-G基因克隆到表达载体pMA5中,构建了分泌表达载体pMA5-OPMA-N和pMA5-OPMA-G,分别转化枯草杆菌BS168,获得了分泌表达OPMA-N和OPMA-G的工程菌。为了进一步提高分泌酶的活力,分别对工程菌进行了发酵工艺优化。结果表明:BS168/pMA5-OPMA-N的最适发酵条件为:0.5%酵母粉,0.3%尿素,1% MgSO4,pH6.5,培养基的装液量为16%,发酵培养48h;BS168/pMA5-OPMA-G的最适发酵条件为:1%的淀粉,0.8%酵母提取物,1% NaCl, pH7.0,培养基的装液量为32%,发酵培养36h。在上述最适产酶条件下,OPMA-N和OPMA-G分泌水平分别达到发酵液中总蛋白的45%、58%,活力分别达到了4.57U/mg和4.65U/mg。对分泌表达的OPMA-N和OPMA-G进行了酶学性质表征。结果表明,两种酶均只能作用淀粉,产生多种低聚糖,包括麦芽糖,麦芽叁糖,异麦芽叁塘,异麦芽四糖,但不产生葡萄糖,然而,两者均不催化降解β-环糊精和普鲁兰。为了探索信号肽序列对目标酶分泌量的影响,在获得编码淀粉酶E(amyE)信号肽的DNA序列基础上,成功构建了重组有信号肽的表达载体pMA5-OPMA-SN和pMA5-OPMA-SG,并分别在枯草杆菌BS168中实现了高效分泌表达。与OPMA-N、OPMA-G的分泌水平相比,两者的分泌量均有提高,但不十分显着。比活力分析表明,OPMA-S与OPMA-N相比,有所提高;OPMA-SG与OPMA-G相比,有所降低但均不显着。底物、产物特异性分析表明,OPMA-SN、OPMA-SG与OPMA-N、OPMA-G具有相同的底物和产物特异性。以上结果表明,信号肽的引入只提高了OPMA-N,OPMA-G的分泌水平,但不影响酶的催化特性。(本文来源于《吉林大学》期刊2010-05-01）
多功能淀粉酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
以壳聚糖为载体,通过正交实验确定了用壳聚糖凝胶微球固定多功能淀粉酶OPMA-N的最适条件:以20 mg/m L戊二醛交联,在25℃及p H=6.5条件下固定1.5 h,但需在引入底物淀粉介导的保护效应后,才能获得良好稳定性的固定化OPMA-N(IOPMA-N),显示了底物保护效应在催化部位占分子中较大区域的酶(如OPMA-N)固定化过程中的重要性.对比分析游离酶与固定化酶的性质与功能发现,在50℃及p H=6.0~7.0条件下,IOPMA-N的表观比活力比游离酶OPMA-N提高3倍以上,催化效率(kcat/Km)提高4倍以上,对弱酸性至中性及常温(30~50℃)环境的耐受性明显高于OPMA-N,并具有良好的操作稳定性和储存稳定性,重复使用15次后,酶活力仍然能够保持75%,在4℃下储存半衰期达31 d,而OPMA-N在4℃下储存5 d后活力基本丧失.催化产物的对比分析结果表明,OPMA-N固定化后,水解活性明显提高,但同时转苷活性有所下降,这与已报道的OPMA-N分子中2种催化活力存在平衡机制的结论一致,同时也表明在OPMA-N的固定化中底物淀粉对其水解活性有明显的保护作用,但对其转苷活性几乎无贡献.
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
多功能淀粉酶论文参考文献
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[8].郝倩.多功能淀粉酶OPMA-G的结构与功能研究[D].吉林大学.2011
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[10].李雁飞.多功能淀粉酶OPMA在枯草杆菌中的分泌表达与性质研究[D].吉林大学.2010