本文主要研究内容
作者李佳仪（2019）在《氨苄青霉素单链抗体的构建及间接竞争ELISA方法的建立》一文中研究指出：为了提高畜牧业生产水平,兽药作为畜牧业的基础物质,被大量的使用,同时也对人们的身体造成了巨大的危害。因此兽药残留问题已经成为研究热点。兽药残留检测目前最常用的方法是免疫分析法,对于免疫分析法来说最具关键的就是抗体,抗体的稳定性对最终结果起着关键的作用,本论文利用基因工程技术成功获得了氨苄青霉素的单链抗体,并在此基础上建立了间接竞争ELISA检测方法,为氨苄青霉素残留检测提供一种经济、灵敏、快速的检测方法。从氨苄青霉素抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,利用RT-PCR反转录技术合成第一链cDNA。以针对鼠源重链可变区（VH）及轻链可变区（VL）基因的特异性引物,扩增获得VH基因和VL基因片段,通过扩增后,得到VH基因片段大小为340 bp左右,扩增的VL基因片段大小为320 bp,采用重叠延伸PCR（SOE-PCR）的方法,用柔性多肽Linker接头（Gly4Ser）3将VH基因和VL基因拼接成单链抗体基因（scFv）片段,得到的scFv片段大小为750 bp,然后将单链抗体基因（scFv）进行Sfi I﹑Not I限制性内切酶双酶切,同样将原核表达载体PLIP6/GN进行双酶切,双酶切后将scFv和PLIP6/GN连接在一起,再将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,对scFv进行重组表达,37℃过夜振荡培养,0.1 mmol/L的IPTG进行诱导,继续培养8 h-12 h。成功获得抗氨苄青霉素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白（AMP scFv-AP）。Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化。利用纯化后的蛋白,通过对间接竞争ELISA条件的优化,建立了一种快速、简单、灵敏的氨苄青霉素间接竞争检测方法,优化后的检测条件为:包被抗原最佳工作浓度为0.25μg/mL,最理想单链抗体稀释倍数为1:32 000,抗原包被时间为37℃1 h。封闭液为5%羊血清,封闭时间为37℃2 h,抗原抗体反应时间为37℃1 h,抗His-tag抗体的浓度为1:4000,显色时间为15 min。在以上条件下,该方法的最低检测限(IC15)为0.83 ng/mL,灵敏度(IC50)为18.43 ng/mL,线性回归方程为y=-14.619x+68.623,R2=0.9887,平均回收率为92.392%。选择5种兽药进行特异性分析,结果表明,与阿莫西林、青霉素的交叉反应率分别为46.63%和44.38%,与氯霉素、四环素和卡那霉素的交叉反应率均小于0.01%。本研究成功制备了scFv抗体并通过优化一系列条件建立了间接竞争EISA检测方法,为ELISA快速检测试剂盒奠定了基础,在食品安全检测方面具有重大的意义。
Abstract
wei le di gao chu mu ye sheng chan shui ping ,shou yao zuo wei chu mu ye de ji chu wu zhi ,bei da liang de shi yong ,tong shi ye dui ren men de shen ti zao cheng le ju da de wei hai 。yin ci shou yao can liu wen ti yi jing cheng wei yan jiu re dian 。shou yao can liu jian ce mu qian zui chang yong de fang fa shi mian yi fen xi fa ,dui yu mian yi fen xi fa lai shui zui ju guan jian de jiu shi kang ti ,kang ti de wen ding xing dui zui zhong jie guo qi zhao guan jian de zuo yong ,ben lun wen li yong ji yin gong cheng ji shu cheng gong huo de le an bian qing mei su de chan lian kang ti ,bing zai ci ji chu shang jian li le jian jie jing zheng ELISAjian ce fang fa ,wei an bian qing mei su can liu jian ce di gong yi chong jing ji 、ling min 、kuai su de jian ce fang fa 。cong an bian qing mei su kang ti de za jiao liu xi bao zhong di qu zong RNA,li yong RT-PCRfan zhuai lu ji shu ge cheng di yi lian cDNA。yi zhen dui shu yuan chong lian ke bian ou （VH）ji qing lian ke bian ou （VL）ji yin de te yi xing yin wu ,kuo zeng huo de VHji yin he VLji yin pian duan ,tong guo kuo zeng hou ,de dao VHji yin pian duan da xiao wei 340 bpzuo you ,kuo zeng de VLji yin pian duan da xiao wei 320 bp,cai yong chong die yan shen PCR（SOE-PCR）de fang fa ,yong rou xing duo tai Linkerjie tou （Gly4Ser）3jiang VHji yin he VLji yin pin jie cheng chan lian kang ti ji yin （scFv）pian duan ,de dao de scFvpian duan da xiao wei 750 bp,ran hou jiang chan lian kang ti ji yin （scFv）jin hang Sfi I﹑Not Ixian zhi xing nei qie mei shuang mei qie ,tong yang jiang yuan he biao da zai ti PLIP6/GNjin hang shuang mei qie ,shuang mei qie hou jiang scFvhe PLIP6/GNlian jie zai yi qi ,zai jiang chong zu zhi li zhuai ru da chang gan jun BL21zhong ,dui scFvjin hang chong zu biao da ,37℃guo ye zhen dang pei yang ,0.1 mmol/Lde IPTGjin hang you dao ,ji xu pei yang 8 h-12 h。cheng gong huo de kang an bian qing mei su chan lian kang ti -jian xing lin suan mei rong ge dan bai （AMP scFv-AP）。Ni2+-NTAqin he ceng xi zhu jin hang chun hua 。li yong chun hua hou de dan bai ,tong guo dui jian jie jing zheng ELISAtiao jian de you hua ,jian li le yi chong kuai su 、jian chan 、ling min de an bian qing mei su jian jie jing zheng jian ce fang fa ,you hua hou de jian ce tiao jian wei :bao bei kang yuan zui jia gong zuo nong du wei 0.25μg/mL,zui li xiang chan lian kang ti xi shi bei shu wei 1:32 000,kang yuan bao bei shi jian wei 37℃1 h。feng bi ye wei 5%yang xie qing ,feng bi shi jian wei 37℃2 h,kang yuan kang ti fan ying shi jian wei 37℃1 h,kang His-tagkang ti de nong du wei 1:4000,xian se shi jian wei 15 min。zai yi shang tiao jian xia ,gai fang fa de zui di jian ce xian (IC15)wei 0.83 ng/mL,ling min du (IC50)wei 18.43 ng/mL,xian xing hui gui fang cheng wei y=-14.619x+68.623,R2=0.9887,ping jun hui shou lv wei 92.392%。shua ze 5chong shou yao jin hang te yi xing fen xi ,jie guo biao ming ,yu a mo xi lin 、qing mei su de jiao cha fan ying lv fen bie wei 46.63%he 44.38%,yu lv mei su 、si huan su he ka na mei su de jiao cha fan ying lv jun xiao yu 0.01%。ben yan jiu cheng gong zhi bei le scFvkang ti bing tong guo you hua yi ji lie tiao jian jian li le jian jie jing zheng EISAjian ce fang fa ,wei ELISAkuai su jian ce shi ji he dian ding le ji chu ,zai shi pin an quan jian ce fang mian ju you chong da de yi yi 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自河北北方学院的李佳仪，发表于刊物河北北方学院2019-11-18论文，是一篇关于氨苄青霉素论文,单链抗体论文,重组表达论文,间接竞争论文,河北北方学院2019-11-18论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自河北北方学院2019-11-18论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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