导读:本文包含了重组血凝素论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:H7N9亚型禽流感病毒,HA,重组杆状病毒,Sf9细胞
重组血凝素论文文献综述
孙一,李如梦,李军,马春喜,赵以恒[1]（2019）在《表达高致病性H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组杆状病毒疫苗候选株的构建与免疫效果评估》一文中研究指出为了有效防控H7N9亚型禽流感疫情,研制能够预防高致病性H7N9亚型禽流感的疫苗非常必要。研究基于昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS),构建并拯救了一株表达高致病性H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)的重组杆状病毒rBac-GD15HA。间接免疫荧光试验及免疫印迹试验鉴定结果表明rBac-GD15HA的HA蛋白在Sf9细胞中成功表达;重组病毒细胞传代试验结果表明rBac-GD15HA在传代过程中能保持较高的病毒滴度,且遗传稳定;鸡的免疫试验结果显示,重组疫苗在一次免疫后即能诱导较高水平的针对H7N9 AIV的抗体应答,并能提供针对高致病性H7N9 AIV 100%的临床保护。因此,研究结果可作为H7N9亚型禽流感疫苗研发策略的参考,为其防控提供一种安全有效的方法,也为今后广谱流感疫苗的研发奠定一定的基础。(本文来源于《中国家禽》期刊2019年18期）
楚电峰[2]（2018）在《表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验》一文中研究指出H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)对鸡的致病性低,仅引起轻微的呼吸道症状和短时间产蛋下降,但混合感染或继发感染其他病原可导致较高的发病率和死亡率。H9亚型禽流感对养鸡业危害较大,免疫接种是防控该病的主要策略之一。目前生产上常用的H9亚型禽流感疫苗为全病毒灭活疫苗,这类疫苗仅能诱导产生高水平的循环抗体,而不能有效地激发细胞免疫和黏膜免疫应答。近年来,以火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkey,HVT)为载体的重组病毒活疫苗已经成为研究热点。一方面,HVT具有较多的复制非必需区可供外源基因插入;另一方面HVT是常用的家禽疫苗,可供1日龄雏鸡免疫或18日龄胚内注射免疫,能够更早地诱导免疫应答。本研究旨在以HVT为载体,构建能稳定表达H9亚型AIV血凝素(HA)的重组病毒活疫苗候选毒株,与现有灭活疫苗组合使用,以提供更加有效的免疫保护。1.rHVT-YBF003株的构建及其遗传稳定性与安全性评价重组病毒构建:对近年分离的21株H9亚型AIV进行HA基因测序和遗传进化分析,发现这些毒株处于h9.4.2.5分支,为目前H9亚型AIV的优势流行毒株。因此,本研究选取其中的YBF003株,用于重组病毒的构建。采用RT-PCR扩增H9亚型AIV YBF003株的HA基因,将HA基因插入到含HVT FC-126疫苗株同源臂和CMV启动子的载体,构建转移载体pFR-H9。将pFR-H9与表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组HVT(rHVT-EGFP)基因组共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),以同源重组的方式将rHVT-EGFP的EGFP基因替换为HA基因表达盒,获得重组病毒rHVT-YBF003株。在CEF单层上反复纯化rHVT-YBF003株,直至所有重组病毒空斑均不带绿色荧光。经PCR鉴定,HA基因表达盒正确插入到HVT基因组;进一步进行Western-blot和IFA鉴定,rHVT-YBF003株能够表达HA蛋白。分别用rHVT-YBF003株和HVTFC-126株感染CEF,两者的生长特性并无显着差异。将rHVT-YBF003株在CEF上连续传20代,再接种于CEF单层,待形成典型空斑后,通过PCR从随机挑选的20个空斑中均能检测到HA基因表达盒;将第20代rHVT-YBF003株接种于CEF单层,通过间接免疫荧光试验(IFA)证明rHVT-YBF003株能够稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。重组病毒的遗传稳定性:1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103 PFU/只;21日龄时,从血液中分离淋巴细胞,再接种于另一批次1日龄SPF鸡(3.0×106个淋巴细胞/羽份)。如此反复传代6次,经PCR检测传代后的rHVT-YBF003株中均存在HA基因,IFA证明传代后的重组病毒仍能稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103PFU/羽份;每隔7天采血分离淋巴细胞,再接种于CEF单层,进行病毒分离和计数。结果显示,rHVT-YBF003株在鸡体内的病毒载量不断提高,至9周龄时,病毒载量达到峰值,此后呈下降趋势,直到第20周龄时仍能检测到少量重组病毒存在,说明该重组病毒可在鸡体内维持较长时间。重组病毒的安全性:以5.0X 104PFU/羽份的rHVT-YBF003株接种1日龄SPF鸡,对鸡群进行连续8周的临床观察、生长状况监测,结果显示接种重组病毒的试验鸡精神、采食、饮水均正常,剖检和组织切片检查均未发现病理变化。以5.0×104PFU/头份的rHVT-YBF003株接种4周龄ICR小鼠,接种后ICR小鼠的采食、精神均正常;接种后14天,对小鼠内脏器官检查并称重,显示接种重组病毒对小鼠无不良影响。因此,重组病毒对易感动物和非易感动物均具有良好的安全性。2.rHVT-YBF003株的免疫效力评价对SPF鸡的免疫保护效力试验:试验分为4组,分别为胚内免疫组、1日龄免疫组、灭活疫苗组和空白对照组;分别对18日龄SPF鸡胚胚内注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、1日龄SPF雏鸡皮下注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、14日龄SPF雏鸡肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗(YBF003株)、1日龄SPF雏鸡皮下注射0.5 mLPBS/只。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒(静脉注射1.0X 1 07 5 EID50/羽份)。28日龄时,胚内免疫组和1日龄免疫组的HI抗体效价分别为4.7±0.60和4.5±0.30,胚内免疫组比1日龄免疫组的HI抗体最大提高0.3±0.62个滴度,两组均能提供一定的早期保护;灭活疫苗组的HI抗体效价为6.5±0.75,攻毒保护率为50%;空白对照组的抗体为1.3±0.12,攻毒保护率为0%。对商品鸡的免疫保护效力试验:对商品鸡的分组及处理方式同SPF鸡。另外,增加重组病毒与灭活疫苗联合免疫组,该组于1日龄时颈部皮下注射5.0×103PFU/羽份的rHVT-YBF003株,14日龄时经肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗(YBF003株)。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒(静脉注射1.0×107.5EID50/羽份)。28日龄时,胚内免疫组、1日龄免疫组和灭活疫苗免疫组的HI抗体效价分别为4.3±0.49、4.1 ±0.89和6.2±0.34,攻毒保护率均为50%以上,差异不显着;而联合免疫组的抗体效价为7.8±0.45,攻毒保护率为70%;空白对照组的抗体为1.0±0.74,攻毒保护率为10%。3.重组病毒种子批建立与大规模培养工艺研究培养工艺研究:为提高重组病毒的效价,同时获得规模化生产条件下的重组病毒培养技术参数。我们对采用细胞工厂进行大规模培养的方法进行了研究。结合该病毒的培养特性,分别从宿主细胞的接种密度、种毒接种剂量和收毒时间等方面对培养工艺进行摸索,最终制定了最优的病毒培养技术工艺:即采用十层细胞工厂(总面积为6335 cm2,培养液为1200mL),CEF密度为2.5×106个/mL时,接种3.0×106PFU的重组病毒,培养72 h,收获感染细胞,按照每个细胞工厂分装50支冻存管的标准进行收获,每支冻存管分装量为1.8mL,其收获的病毒效价可达5.0×106PFU/支以上,即成品疫苗可达5000 PFU/羽份以上,远高于2000 PFU/羽份的国家标准。种子批建立:将所收获的重组病毒分为原始种子、基础种子和生产种子。原始种子包括重组病毒的F1～F6代,基础种子包括F7～F12代,生产种子包括F13～F17代。并在各级种子批中随机选取一个代次的种子进行无菌检验、支原体检验、鉴别检验、安全性检验、免疫原性检验和外源病毒检验。无菌检验和支原体检验中,叁个代次种毒的检验结果均为阴性;鉴别检验中,对HVT鉴定部分采用间接免疫荧光试验,结果显示,叁个代次种毒形成的病毒空斑均呈现绿色荧光,说明形成的病毒空斑为HVT,对HVT表达的HA蛋白鉴定采用Western-blot方法鉴定,结果显示,叁个代次种毒均能表达HA蛋白;安全性检验中,叁个代次的种毒接种1日龄SPF鸡,免疫剂量为3.0×104PFU/羽,免疫后观察90天,所有免疫鸡均未观察到临床症状;外源病毒检验中,分别于1日龄和21日龄时,采用滴鼻、点眼(剂量为3.0×104PFU/羽份)和肌肉注射(剂量为3.0×104PFU/羽份)叁种途径同时接种重组病毒,42日龄时采集血清,均未检测到外源病毒的抗体。结果显示,叁个代次的重组病毒均符合种毒质量标准。综上所述,本研究构建了一株表达H9亚型AIV HA蛋白的重组HVT(rHVT-YBF003株)。在体内和体外传代过程中,rHVT-YBF003株所插入的HA基因均能稳定表达。在安全性评价方面,该重组病毒对易感和非易感动物均不具有致病性。该重组病毒可用于1日龄雏鸡和18日龄鸡胚内的早期免疫,虽然HI抗体低于灭活疫苗,但对H9亚型AIV的保护率等同于灭活疫苗。重组病毒与灭活疫苗联合使用具有协同效应,对H9防控效果更好。本研究还建立了种子批,并制定了符合大规模生产的重组病毒培养工艺,为将来工厂化生产打下了基础。(本文来源于《扬州大学》期刊2018-12-01）
楚电峰,张小荣,丁园,蒋叶林,侯玉超[3]（2018）在《表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组HVT活疫苗免疫效力评价》一文中研究指出为在SPF鸡和商品蛋鸡上评价一株表达H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素基因的重组HVT(r HVT-H9)活疫苗的免疫保护效力,试验将1日龄SPF鸡分为r HVT-H9疫苗组、灭活疫苗组和空白对照组,共3组(n=60,每组20只);1日龄商品蛋鸡除上述叁组外另增加r HVT-H9疫苗与禽流感灭活疫苗(H9亚型,F株)联合免疫组,共4组(n=80,每组20只)。免疫后,通过血凝抑制试验检测血清中针对H9亚型AIV的抗体效价;并于免疫后28 d,将全部试验组及空白对照组以H9亚型AIV F株进行静脉注射攻毒。攻毒后第3、5天分别采集喉头、泄殖腔棉拭子检测排毒情况;并于攻毒后第10天将全部试验鸡进行剖检。结果显示:SPF鸡r HVT-H9疫苗组能达到100%免疫保护,而灭活疫苗组仅能达到80%保护;商品蛋鸡r HVT-H9疫苗组保护率为40%,灭活疫苗组保护率为70%,但联合免疫组能达到100%的免疫保护。因此,该重组病毒r HVT-H9疫苗可作为H9亚型禽流感的有效疫苗候选株,与现有商品化禽流感H9亚型灭活疫苗联合使用,效果更佳,为其防控提供一定的技术支持。(本文来源于《中国家禽》期刊2018年15期）
胡增垒,刘晓文,胡娇,顾晗,石磊[4]（2018）在《表达分泌型与膜结合型HH7N9 AIV血凝素蛋白重组NDV载体疫苗的免疫原性比较》一文中研究指出研究以新城疫病毒(NDV)弱毒株LX为载体,构建了一株表达H7N9亚型禽流感病毒(H7N9 AIV)血凝素(HA)胞外区的重组病毒(LXs HA),并与一株前期构建的表达膜结合型HA的重组病毒(LXHAF)进行比较。生物学特性评价显示,两株病毒均为弱毒且在鸡胚中的繁殖性能较强。此外,LXs HA主要以分泌形式表达HA蛋白,而LXHAF则以膜结合形式表达HA。鸡的免疫试验显示,两株重组病毒在一次免疫后均能诱导针对NDV载体的血凝抑制抗体,但LXHAF能够诱导较高水平的H7N9 AIV特异性Ig Y抗体,而LXs HA不能诱导H7N9 AIV抗体应答。结果表明,表达膜结合型HA的重组病毒具有针对H7N9 AIV较好的免疫原性,而表达分泌型HA的重组病毒免疫原性较差。这为研发H7N9亚型禽流感载体疫苗提供新的信息与参考。(本文来源于《中国家禽》期刊2018年14期）
蒋叶林[5]（2017）在《表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其免疫效力试验》一文中研究指出H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)自1992年首次在我国鸡群中被发现并报道以来,迅速在各地流行,严重危害养禽业的发展。研究表明,H9N2亚型AIV不经适应即可感染人和哺乳动物,也可为感染人的流感病毒提供内部基因,具有重要的公共卫生意义。在我国,独特的地理环境、养殖模式及活禽市场的存在为H9N2亚型AIV的传播提供了有利条件,而免疫压力更是病毒发生重组和变异的重要因素。通过对我国2010年-2015年间H9N2亚型AIV分离毒株的血凝素(HA)基因序列分析显示,近年来的分离毒株主要集中于h9.4.2.5分支上,而常用的灭活疫苗的毒株并不属于此分支,且灭活疫苗不能有效地诱导细胞免疫应答和黏膜免疫应答。因此,灭活疫苗的免疫保护率有时不高。火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkey,HVT)疫苗是预防鸡马立克氏病的常用疫苗,具有较多的复制非必需区可供外源基因的插入,被广泛应用于重组病毒活疫苗的构建。本研究拟以HVTFC126疫苗株为载体,构建表达h9.4.2.5分支H9N2亚型AIVHA的重组病毒,研制新型H9亚型AIV活疫苗。本研究通过PCR扩增出h9.4.2.5分支H9亚型AIV(YZ1406毒株)的HA基因,与人巨细胞病毒早期启动子(CMV)和TKpolyA组成表达盒。将该表达盒插入到HVTFC126疫苗株的US2非必需区片段中,构建转移载体pHVT-H9HA。将pHVT-H9HA与表达EGFP基因的重组HVTFC126病毒(rHVT-EGFP)基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经同源重组,将位于rHVT-EGFP US2区内的EGFP标记基因替换为HA基因表达盒,获得重组病毒rHVT-H9HA。通过PCR、Southern-blot、Western-blot和间接免疫荧光试验对rHVT-H9HA进行鉴定,并对其在CEF上的生长特性进行检测。结果显示:rHVT-H9HA中,HA基因表达盒已正确插入到US2复制非必需区内,并能成功表达出大小85kD左右的目的蛋白;同时,rHVT-H9HA在CEF上表现出与HVTFC126疫苗毒株相同的复制水平。本研究对重组病毒rHVT-H9HA进行了免疫效力的初步评价。将80只1日龄SPF鸡随机分成四组:rHVT-H9HA免疫组、灭活苗免疫组、攻毒对照组和空白对照组。其中rHVT-H9HA免疫组于1日龄经颈部皮下接种5000空斑形成单位(PFU)的rHVT-H9HA,灭活苗免疫组于14日龄时经肌肉注射0.25 mL/鸡的禽流感病毒H9亚型灭活苗。在7、14、21、28日龄,分别通过血凝抑制试验(HI)检测各组试验鸡的血清中H9亚型AIV的抗体效价。除空白对照组外,其余各组于28日龄均采用点眼/滴鼻方式以108EID50/鸡的YZ1406毒株攻毒。攻毒后的第3d、5d,采集喉头、泄殖腔拭子,进行病毒分离,检测各组试验鸡的排毒情况。结果显示:rHVT-H9HA免疫组的试验鸡在疫苗接种后抗体水平呈持续上升趋势;在攻毒后的第5d,病毒分离率显着降低,而攻毒对照组病毒分离率较高,表明重组病毒rHVT-H9HA对H9亚型AIV的攻击具有较好的保护作用。(本文来源于《扬州大学》期刊2017-06-01）
孟令楠,任志广,冀显亮,李元果,李胜楠[6]（2016）在《重组H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)的表达及鉴定》一文中研究指出目的为了获得H7N9HA蛋白,利用昆虫杆状病毒表达系统表达了H7N9HA基因并获得重组H7N9亚型流感病毒HA蛋白。方法将H7N9亚型流感病毒的HA蛋白基因扩增并克隆到pFastBacⅠ载体中,构建重组穿梭质粒,转染昆虫sf9细胞后获得重组杆状病毒,对大量培养后表达的H7N9HA蛋白进行SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光检测。分别在0d和14d用纯化的表达产物HA蛋白免疫小鼠。结果测序鉴定重组表达载体构建正确;SDS-PAGE显示纯化的表达蛋白分子质量为67ku;Western blot分析该蛋白能够被鸡抗流感病毒IgG识别;鸡抗流感病毒抗体间接免疫荧光法测定HA蛋白的表达,在感染HA的昆虫细胞中出现特异性荧光。结论成功的表达了H7N9的HA蛋白,并且此HA蛋白能成功的诱导小鼠体内的免疫反应,并起到良好的保护作用。(本文来源于《中国病原生物学杂志》期刊2016年05期）
胡潇,温国元,王红琳,罗青平,邵华斌[7]（2016）在《表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白重组新城疫病毒耐热株的构建》一文中研究指出应用反向遗传操作技术,将H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白基因替换重组新城疫病毒耐热rTS-GFP/M株的绿色荧光蛋白基因,构建表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组新城疫病毒rTS-HA/M株.蛋白表达检测和病毒特性分析结果表明,该重组病毒能够在BHK-21细胞中高效表达HA蛋白,具有与亲本毒株类似的增殖能力、耐热特性和低致病性.(本文来源于《武汉大学学报(理学版)》期刊2016年04期）
侯玉超[8]（2016）在《表达H5亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其免疫效力试验》一文中研究指出H5亚型高致病性禽流感(／vian Influenza, AI)是由A型流感病毒引起禽类的一种急性、高度接触性传染病。H5亚型禽流感病毒的HA基因变异频繁,目前已鉴定出很多分支。近年来,在我国流行的毒株主要集中于Clade2.3.2.1、Clade7.2 和 Clade2.3.4.4分支,因此迫切需要研制与目前流行毒株抗原性相一致的新型疫苗用于H5亚型禽流感的防控。基因重组活载体疫苗因其可以有效的诱导细胞免疫和粘膜免疫应答而被广泛关注。火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT)是一种具有广阔应用前景的病毒载体,由于HVT可以冻干保存、使用方便、对鸡无致病性和不影响其生产性能等优点而作为载体被广泛应用于重组病毒的构建。本研究利用同源重组原理,以火鸡疱疹病毒(HVT) FC126疫苗毒株为载体,以其复制非必需区US2为插入位点,构建含EGFP表达盒的转移载体pFR-EGF P,将转移载体pFR-EGFP和HVT基因组共转染CEF,经同源重组获得表达EGFP标记基因的重组病毒rHVT-EGFP。本研究选择叁株分别位于Clade2.3.2.1、Clade7.2和Clade2.3.44分支的H5亚型AIV,选择人巨细胞病毒早期启动子(CMV),构建包含HA基因的转移载体pFR-HA-R6、 pFR-HA-R7、pFR-HA-R8。将转移载体与重组病毒rHVT-EGFP的基因组共转染CEF,经同源重组,用HA基因表达盒替换US2区标记基因EGFP,最终获得表达HA基因的重组病毒rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8。重组病毒经PCR和Western-blot试验鉴定,结果表明,叁株重组病毒的基因组中均已正确插入HA基因并能够表达HA蛋白。对重组病毒在CEF上的生长特性进行检测,结果显示,重组病毒与HVT FC126疫苗毒株具有相同的复制水平。本研究评价了重组病毒(rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8)针对相应Clade分支H5亚型AIV的免疫保护效果。将200只1日龄SPF鸡随机分成8组。依次为：rHVT-HA-R6组、rHVT-HA-R7组、rHVT-HA-R8组、禽流感病毒H5亚型叁价灭活疫苗组、Re-6攻毒对照组、Re-7攻毒对照组、Re-8攻毒对照组和空白对照组,禽流感病毒H5亚型叁价灭活疫苗组60只SPF鸡,其余各组均20只。前叁组于1日龄时,经颈部皮下接种5000空斑形成单位(PFU)的相应疫苗,灭活疫苗组于14日龄时,肌肉注射0.25 mL/羽禽流感病毒H5亚型叁价灭活疫苗组。分别于7、14、21、28日龄时通过血凝抑制试验(HI)检测H5亚型AIV的抗体效价。除空白对照组外,其余各组于28日龄经滴鼻点眼途径攻毒,rHVT-HA-R6免疫组、Re-6攻毒对照组、从禽流感病毒H5亚型叁价灭活疫苗组取20只SPF鸡用HJ-14株AIV进行攻毒,rHVT-HA-R7免疫组、从禽流感病毒H5亚型叁价灭活疫苗组取20只SPF鸡用JA-14株AIV进行攻毒,rHVT-HA-R8免疫组、Re-8攻毒对照组、从禽流感病毒H5亚型叁价灭活疫苗组取20只SPF鸡用YZ-14株AIV进行攻毒,攻毒剂量均为105EID50。攻毒后继续观察7天,统计各试验组临床症状、发病率、死亡率、抗体消长及排毒规律。结果表明,在整个试验期内,叁个重组疫苗免疫组试验鸡的抗体水平呈持续上升的趋势,而攻毒对照组在攻毒之前均未检测到抗体。在H5亚型AIV强毒株攻毒之后,与对照组相比,叁个重组疫苗免疫组试验鸡的抗体水平迅速上升。rHVT-HA-R6、 rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8免疫组的攻毒保护率均为100%,所有结果均表明重组病毒对与H5亚型AIV抗原性相一致的强毒株攻击可以提供完全的免疫保护。(本文来源于《扬州大学》期刊2016-06-01）
童彦军[9]（2013）在《表达A型H5N1血凝素的重组副流感病毒5能使小鼠抵抗高致病性禽流感病毒H5N1的攻击》一文中研究指出安全有效的疫苗是阻止高致病性(HPAI)禽流感病毒H5N1在人群中大规模暴发的最好方法。目前FDA批准的H5N1疫苗有明显的局限性,因此,迫切需要更加有效的H5N1疫苗问世。副流感病毒5(PIV5)是一种副黏病毒,在人群中不引起任何疾病,因此是一种可行的疫苗载体。在我们的研究中,用单剂量的表达有来自一H5N1亚型病毒血凝素(HA)的重组活PIV5(rPIV5-H5)免疫小鼠,发现对致死剂量的HPAI H5N1攻击具有免疫作用。另外,(本文来源于《微生物学免疫学进展》期刊2013年06期）
王义敏[10]（2013）在《表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组马立克氏病毒构建及其免疫效力试验》一文中研究指出H9亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)可引起鸡的呼吸道疾病和产蛋下降,在混合感染或继发感染其它病原的情况下有较高的发病率和死亡率,给我国养禽业造成严重的经济损失。H9亚型AIV的变异速度较快,但近年来我国分离的流行毒株大多属于Y280-1ike亚系。本研究将以马立克病毒(MDV) CVI988/Rispens疫苗毒株为载体,构建表达H9亚型AIV血凝素(HA)的重组病毒,并对其免疫效力进行初步评价,为H9亚型禽流感的防控提供新型疫苗。本研究以MDV CVI988/Rispens疫苗毒株的复制非必需片段sorf1-sorf2为插入位点,选择网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)作为启动子,构建了含H9亚型AIV Y280-like亚系毒株(A/Chicken/Anhui/1/2010) HA基因及EGFP标记基因的转移载体质粒(pMDV-HA/GFP)。以MDV CVI988/Rispens疫苗毒株的基因组DNA和pMDV-HA/GFP共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),获得带有EGFP标记基因的重组病毒rMDV-HA/GFP。然后用Cre酶去除rMDV-HA/GFP中的EGFP标记基因,得到仅有LTR启动子和HA基因的重组病毒rMDV-HA。经PCR和Western-blot试验鉴定,H9亚型AIV HA基因已正确插入到rMDV-HA基因组中,并且得到稳定表达。本研究评价了MDV-HA对H9亚型AIV Y280-like亚系毒株的免疫保护效果。将100羽1日龄SPF鸡随机分成5组,即rMDV-HA免疫组、rMDV-HA二次免疫组、rMDV-HA与H9亚型AIV灭活疫苗联合免疫组、H9亚型AIV灭活疫苗免疫组和CVI988/Rispens免疫组。前叁组与CVI988/Rispens免疫组分别颈部皮下接种5000空斑形成单位(PFU)的相应疫苗；rMDV-HA二次免疫组于10日龄时加强免疫5000PFU的相应疫苗；联合免疫组和灭活疫苗组14日龄时分别肌肉注射0.25mL/羽H9亚型AIV灭活疫苗。于7、14、21、28、35日龄通过血凝抑制试验(HI)检测H9亚型AIV抗体效价。35日龄时,全部试验鸡用2×106EID50剂量的H9亚型AIV攻毒,于攻毒后第3天、5天采集喉头、泄殖腔棉拭子测定排毒规律。攻毒后第10天处死全部试验鸡,进行剖检和组织学检查。结果表明,在5个试验组中,rMDV-HA与H9亚型AIV灭活疫苗联合免疫组最早产生具有保护作用的抗体滴度,早于H9亚型AIV灭活疫苗免疫组约7天；该组喉头、泄殖腔的排毒率最低,而且剖检和组织学病理变化轻微。试验表明,rMDV-HA与H9亚型AIV灭活疫苗联合免疫所产生的应答更加全面和快速。本研究还评价了重组病毒rMDV-HA对MDV RBIB超强毒株攻击的免疫保护作用。将60羽1日龄SPF鸡随机分成叁组：rMDV-HA免疫组、CVI988/Rispens免疫组和攻毒对照组,rMDV-HA免疫组和CVI988/Rispens免疫组的1日龄雏鸡分别颈部皮下接种5000PFU的相应疫苗。7日龄时,全部试验鸡腹腔接种500PFU的MDV超强毒株RB1B。观察6周,记录各组鸡的发病和死亡情况。经统计,攻毒对照组90%的鸡死于马立克氏病(MD),rMDV-HA免疫组和CVI988/Rispens免疫组对MD的保护率均为100%。试验表明,rMDV-HA可对MDV超强毒株的攻击能产生足够的保护力。(本文来源于《扬州大学》期刊2013-05-01）
重组血凝素论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)对鸡的致病性低,仅引起轻微的呼吸道症状和短时间产蛋下降,但混合感染或继发感染其他病原可导致较高的发病率和死亡率。H9亚型禽流感对养鸡业危害较大,免疫接种是防控该病的主要策略之一。目前生产上常用的H9亚型禽流感疫苗为全病毒灭活疫苗,这类疫苗仅能诱导产生高水平的循环抗体,而不能有效地激发细胞免疫和黏膜免疫应答。近年来,以火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkey,HVT)为载体的重组病毒活疫苗已经成为研究热点。一方面,HVT具有较多的复制非必需区可供外源基因插入;另一方面HVT是常用的家禽疫苗,可供1日龄雏鸡免疫或18日龄胚内注射免疫,能够更早地诱导免疫应答。本研究旨在以HVT为载体,构建能稳定表达H9亚型AIV血凝素(HA)的重组病毒活疫苗候选毒株,与现有灭活疫苗组合使用,以提供更加有效的免疫保护。1.rHVT-YBF003株的构建及其遗传稳定性与安全性评价重组病毒构建:对近年分离的21株H9亚型AIV进行HA基因测序和遗传进化分析,发现这些毒株处于h9.4.2.5分支,为目前H9亚型AIV的优势流行毒株。因此,本研究选取其中的YBF003株,用于重组病毒的构建。采用RT-PCR扩增H9亚型AIV YBF003株的HA基因,将HA基因插入到含HVT FC-126疫苗株同源臂和CMV启动子的载体,构建转移载体pFR-H9。将pFR-H9与表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组HVT(rHVT-EGFP)基因组共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),以同源重组的方式将rHVT-EGFP的EGFP基因替换为HA基因表达盒,获得重组病毒rHVT-YBF003株。在CEF单层上反复纯化rHVT-YBF003株,直至所有重组病毒空斑均不带绿色荧光。经PCR鉴定,HA基因表达盒正确插入到HVT基因组;进一步进行Western-blot和IFA鉴定,rHVT-YBF003株能够表达HA蛋白。分别用rHVT-YBF003株和HVTFC-126株感染CEF,两者的生长特性并无显着差异。将rHVT-YBF003株在CEF上连续传20代,再接种于CEF单层,待形成典型空斑后,通过PCR从随机挑选的20个空斑中均能检测到HA基因表达盒;将第20代rHVT-YBF003株接种于CEF单层,通过间接免疫荧光试验(IFA)证明rHVT-YBF003株能够稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。重组病毒的遗传稳定性:1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103 PFU/只;21日龄时,从血液中分离淋巴细胞,再接种于另一批次1日龄SPF鸡(3.0×106个淋巴细胞/羽份)。如此反复传代6次,经PCR检测传代后的rHVT-YBF003株中均存在HA基因,IFA证明传代后的重组病毒仍能稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103PFU/羽份;每隔7天采血分离淋巴细胞,再接种于CEF单层,进行病毒分离和计数。结果显示,rHVT-YBF003株在鸡体内的病毒载量不断提高,至9周龄时,病毒载量达到峰值,此后呈下降趋势,直到第20周龄时仍能检测到少量重组病毒存在,说明该重组病毒可在鸡体内维持较长时间。重组病毒的安全性:以5.0X 104PFU/羽份的rHVT-YBF003株接种1日龄SPF鸡,对鸡群进行连续8周的临床观察、生长状况监测,结果显示接种重组病毒的试验鸡精神、采食、饮水均正常,剖检和组织切片检查均未发现病理变化。以5.0×104PFU/头份的rHVT-YBF003株接种4周龄ICR小鼠,接种后ICR小鼠的采食、精神均正常;接种后14天,对小鼠内脏器官检查并称重,显示接种重组病毒对小鼠无不良影响。因此,重组病毒对易感动物和非易感动物均具有良好的安全性。2.rHVT-YBF003株的免疫效力评价对SPF鸡的免疫保护效力试验:试验分为4组,分别为胚内免疫组、1日龄免疫组、灭活疫苗组和空白对照组;分别对18日龄SPF鸡胚胚内注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、1日龄SPF雏鸡皮下注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、14日龄SPF雏鸡肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗(YBF003株)、1日龄SPF雏鸡皮下注射0.5 mLPBS/只。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒(静脉注射1.0X 1 07 5 EID50/羽份)。28日龄时,胚内免疫组和1日龄免疫组的HI抗体效价分别为4.7±0.60和4.5±0.30,胚内免疫组比1日龄免疫组的HI抗体最大提高0.3±0.62个滴度,两组均能提供一定的早期保护;灭活疫苗组的HI抗体效价为6.5±0.75,攻毒保护率为50%;空白对照组的抗体为1.3±0.12,攻毒保护率为0%。对商品鸡的免疫保护效力试验:对商品鸡的分组及处理方式同SPF鸡。另外,增加重组病毒与灭活疫苗联合免疫组,该组于1日龄时颈部皮下注射5.0×103PFU/羽份的rHVT-YBF003株,14日龄时经肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗(YBF003株)。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒(静脉注射1.0×107.5EID50/羽份)。28日龄时,胚内免疫组、1日龄免疫组和灭活疫苗免疫组的HI抗体效价分别为4.3±0.49、4.1 ±0.89和6.2±0.34,攻毒保护率均为50%以上,差异不显着;而联合免疫组的抗体效价为7.8±0.45,攻毒保护率为70%;空白对照组的抗体为1.0±0.74,攻毒保护率为10%。3.重组病毒种子批建立与大规模培养工艺研究培养工艺研究:为提高重组病毒的效价,同时获得规模化生产条件下的重组病毒培养技术参数。我们对采用细胞工厂进行大规模培养的方法进行了研究。结合该病毒的培养特性,分别从宿主细胞的接种密度、种毒接种剂量和收毒时间等方面对培养工艺进行摸索,最终制定了最优的病毒培养技术工艺:即采用十层细胞工厂(总面积为6335 cm2,培养液为1200mL),CEF密度为2.5×106个/mL时,接种3.0×106PFU的重组病毒,培养72 h,收获感染细胞,按照每个细胞工厂分装50支冻存管的标准进行收获,每支冻存管分装量为1.8mL,其收获的病毒效价可达5.0×106PFU/支以上,即成品疫苗可达5000 PFU/羽份以上,远高于2000 PFU/羽份的国家标准。种子批建立:将所收获的重组病毒分为原始种子、基础种子和生产种子。原始种子包括重组病毒的F1～F6代,基础种子包括F7～F12代,生产种子包括F13～F17代。并在各级种子批中随机选取一个代次的种子进行无菌检验、支原体检验、鉴别检验、安全性检验、免疫原性检验和外源病毒检验。无菌检验和支原体检验中,叁个代次种毒的检验结果均为阴性;鉴别检验中,对HVT鉴定部分采用间接免疫荧光试验,结果显示,叁个代次种毒形成的病毒空斑均呈现绿色荧光,说明形成的病毒空斑为HVT,对HVT表达的HA蛋白鉴定采用Western-blot方法鉴定,结果显示,叁个代次种毒均能表达HA蛋白;安全性检验中,叁个代次的种毒接种1日龄SPF鸡,免疫剂量为3.0×104PFU/羽,免疫后观察90天,所有免疫鸡均未观察到临床症状;外源病毒检验中,分别于1日龄和21日龄时,采用滴鼻、点眼(剂量为3.0×104PFU/羽份)和肌肉注射(剂量为3.0×104PFU/羽份)叁种途径同时接种重组病毒,42日龄时采集血清,均未检测到外源病毒的抗体。结果显示,叁个代次的重组病毒均符合种毒质量标准。综上所述,本研究构建了一株表达H9亚型AIV HA蛋白的重组HVT(rHVT-YBF003株)。在体内和体外传代过程中,rHVT-YBF003株所插入的HA基因均能稳定表达。在安全性评价方面,该重组病毒对易感和非易感动物均不具有致病性。该重组病毒可用于1日龄雏鸡和18日龄鸡胚内的早期免疫,虽然HI抗体低于灭活疫苗,但对H9亚型AIV的保护率等同于灭活疫苗。重组病毒与灭活疫苗联合使用具有协同效应,对H9防控效果更好。本研究还建立了种子批,并制定了符合大规模生产的重组病毒培养工艺,为将来工厂化生产打下了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
重组血凝素论文参考文献
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标签：H7N9亚型禽流感病毒; HA; 重组杆状病毒; Sf9细胞;