导读:本文包含了大肠杆菌硝基还原酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:硝基还原酶,定点突变,大肠杆菌,2,4,6-叁硝基甲苯
大肠杆菌硝基还原酶论文文献综述
白敬[1]（2015）在《大肠杆菌硝基还原酶NfsB的分子改造及其催化特性》一文中研究指出硝基还原酶是一类分布广泛的黄素蛋白酶,与辅基FMN或FAD分子结合,以NAD(P)H作为电子供体催化硝基基团生成相应的羟胺或氨基基团。因此,该类酶在污染物环境修复、芳香羟胺类药物中间体的生物合成和癌症前药激活等诸多领域具有重要应用价值。本论文以大肠杆菌硝基还原酶NfsB作为研究对象,以环境污染物2,4,6-叁硝基甲苯(TNT)、芳香羟胺合成原料2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT)和癌症治疗前药CB1954作为底物,利用HPLC、MS和酶动力学等方法分析NfsB催化不同硝基化合物还原的产物、催化活性及区位选择性。结合定点突变、结晶学和分子对接模拟等手段探讨了NfsB催化活性和区位选择性的结构基础,并改造获得催化活性或区位选择性更好的突变体酶。本论文主要结果如下：(1) NfsA和NfsB对TNT表现出类似的催化活性,经HPLC-MS产物分析表明二者催化TNT还原生成2,4-二羟胺-6-硝基甲苯(2,4-DHANT)的途径相同。当氧气存在时,TNT还原过程中的4-羟胺-2,6-二硝基甲苯(4-HADNT)和亚硝基中间产物可缩合生成相应的氧化偶氮化合物。基因定点突变研究表明,残基F123对酶催化活性影响较大。突变体F123A对污染物TNT及其氨基衍生物2-氨基-4,6-二硝基甲苯(2-ADNT)和4-氨基-2,6-二基甲苯(4-ADNT)的催化活性较野生型酶分别提高了1.4倍、3.6倍和4.0倍。(2)基因改造NfsB实现对2,4-DNT的区位选择性还原的改变。野生型NfsB能够专一性还原2,4-DNT的4位硝基。为了获得2位硝基的还原活性,对可能影响区位选择性的位点(T41、F70、N71和F124)进行单点突变和组合突变。叁突变体T41L/N71S/F124W可以实现2,4-DNT的2位硝基还原,并解析获得其晶体结构。与野生型NfsB晶体结构比较,我们发现叁突变体与野生型酶在整体结构上十分相似,但在活性口袋内部存在明显的结构差异：突变体中L41能够与W124相互作用,从而在FMN异咯嗪环的上方形成一个疏水性更强的底物结合区域；F70和W124的芳环侧链朝向活性口袋外侧发生翻转,入口处较野生型酶更宽。(3)分子对接结果显示,底物2,4-DNT在野生型NfsB和突变体T41L/N71S/F124W活性口袋中结合方式完全不同。在野生型NfsB中,2,4-DNT仅呈现一种构象,即4位硝基插入由T41、E165、G166和F124形成的口袋中,在FMN的N5原子上方实现还原反应；而在突变体酶中,底物2,4-DNT采用了一种与野生型酶中完全不同的结合模式,即1位甲基与L41、W124形成疏水相互作用插入活性口袋内部,从而使其邻近的2位硝基位于FMN的N5原子上方实现还原反应。(4)为了提高NfsB对癌症前药CB1954的催化活性并实现对酶区位选择性的改变,对影响酶催化活性和区位选择性的位点(T41、N71、F123和F124)进行单点突变和组合突变。结果表明,单突变体F124W可实现对CB1954的4位硝基的专一性还原：同时突变N71或F123可与F124W协同增加催化活性,而对其区位选择性没有影响；叁突变体N71S/F123A/F124W除实现对CB1954的4位硝基的专一性还原外,催化活性也较野生型酶提高了21.1倍。(5)解析获得突变体N71S/F123A/F124W的晶体结构。与已知晶体结构比较,我们发现突变体中W124较大的吲哚环可以实现与CB1954中氮杂环较强的堆积作用,使其邻近的4位硝基位于FMN的N5原子上方位置,从而实现其专一性还原；F123A突变为W124残基侧链提供了更大的活动空间,有利于催化过程中构象变化,且N71S突变使得邻近F70的芳香侧链偏转、活性口袋入口处变宽,有利于底物的进入,从而提高突变体酶对CB 1954的催化活性。(本文来源于《大连理工大学》期刊2015-06-01）
刘培瑜[2]（2015）在《大肠杆菌硝基还原酶可控合成芳香羟胺的性质研究》一文中研究指出芳香羟胺是合成许多农药、医药、精细化合物等的重要有机中间体。不同于化学催化,生物酶催化法制备芳香羟胺反应条件温和、选择性高且环境友好。大肠杆菌硝基还原酶NfsA和NfsB依赖于烟酰型辅酶NAD(P)H,对芳香硝基化合物的硝基还原存在选择性,反应能得到羟胺终产物。研究其在可控合成芳香羟胺,尤其是硝基羟胺化合物的催化性质,可促进硝基还原酶在制备芳香羟胺中的应用。因此本论文展开以下工作：(1)利用大肠杆菌硝基还原酶NfsA,NfsB及NfsB突变体F123A的纯化酶,以1,2-DNB,1,3-DNB和1,4-DNB为还原底物,检测酶活力,并进行HPLC, MS分析以及动力学常数测定,发现NfsA和NfsB对叁种底物均表现出催化活性,还原产物均为单羟胺产物；NfsB对1,2-DNB,1,3-DNB和1,4-DNB的Kcat/Km值分别为NfsA的13%,33%和50%；NfsB突变体F123A对二硝基苯化合物的催化效率明显提高,kcat/Km值为野生型NfsB的2-5倍,与野生型NfsA的催化活性相当。NfsA和NfsB均表现出对1,2-DNB的优先还原,对1,4-DNB的还原效率最差；分子对接分析推测1,2-DNB的硝基能更有效的定位于酶活性口袋以保证更好地结合。(2)为研究取代基-NH2,-COCl,-COOH,-CH3的性质对二硝基苯底物反应活性的影响,选择3,5-DNA,3,5-DNT,DNBC和DNBA为底物进行实验,发现NfsA和NfsB对DNBC和DNBA表现出较好的还原活性,是不含其他取代基的1,3-DNB kcat/Km值的3-17倍,对3,5-DNA和3,5-DNT的活性仅为1,3-DNB的63%-72%,说明苯环上取代基的性质会影响酶对底物的反应活性；NfsB突变体F123A对四种底物的kcat/Km值显着提高,是野生型NfsB的2-3.6。(3)基于结构的氨基酸序列比对,分析了与NfsA和NfsB辅酶偏好性相关的残基位点,设计NfsA突变体为R15E,D165R,K167E,Y199A,Y200A,R225H和R225Q, NfsB突变体为K14R,K14S,T41L, N71S,N71T,F123A,F124A比较酶以呋喃西林为模式底物,利用不同辅酶时的酶活力发现,NfsA突变体R15E,R225H和R225Q的辅酶偏好性进一步向NADPH转变,D165R和Y200A利用NADH为辅酶时的催化活性提高,辅酶偏好向NADH转变；NfsB突变体K14R,K14S,N71S,N71T利用两种辅酶时的活性明显降低,辅酶偏好性向NADH转变,表明上述残基可能参与辅酶的相互作用。(本文来源于《大连理工大学》期刊2015-05-01）
战君菲[3]（2013）在《大肠杆菌中硝基还原酶NfsA的表达纯化与催化性质研究》一文中研究指出大肠杆菌硝基还原酶是一种以FMN为辅基且依赖于NAD(P)H的氧不敏感型黄素蛋白,能够催化多种硝基底物的还原,在生物转化、生物修复和前药激活等方面应用广泛。目前已获得3种大肠杆菌硝基还原酶,分别为NfsA、NfsB和YdjA,其中NfsA与研究较为深入的NfsB底物谱和结构特点类似,但它们分属硝基还原酶Group A和Group B家族,氨基酸序列一致性很低,在辅酶偏好和底物区位选择性还原等方面表现出明显的差异。为了解NfsA的催化性质,本论文开展以下工作(1)利用NCBI中提供的NfsA的序列(GenBank:BAA07425.1)设计引物,从E.coli K12菌株中获取nfsA基因,将其克隆至pET28a,转化至E.coli BL21(DE3)中,经表达条件优化,获得高表达的重组酶,利用亲和层析获得纯化酶。(2)比较NfsA和NfsB的晶体结构,发现Phe42在NfsA中存在,在NfsB中缺失。为了探索Phe42对NfsA的作用,通过PCR定点突变获得叁个突变体F42Y、F42N和F42A。以呋喃西林为底物检测突变体的酶活力变化,发现活力较野生型分别下降51.7%、96.3%和98.7%。测定了NfsA与突变体对辅酶NADPH以及底物NFZ、CB1954、TNT和2,4-DNT的动力学数据,其中NfsA对于NFZ的亲和力最大,Km,值为12μM,其次是TNT,Km值为29μM。比较野生型和叁个突变体的动力学数据,发现突变体的Km基本不变,而Kcal显着降低,并导致Kcat/Km显着降低。通过远紫外圆二色谱分析突变体与NfsA的二级结构,发现F42N和F42A在波长208nm到222nm之间,椭圆度显着改变,说明螺旋含量减少,酶的二级结构改变,而F42Y基本不变。上述研究表明,Phe42对于维持NfsA的酶活力和二级结构发挥很重要的作用。(3)比较Group A家族和Group B家族的氨基酸序列,结合晶体结构和氨基酸性质分析,推测Arg15、Lys167和Arg203可能是NfsA中与NADPH结合的关键氨基酸。对其分别进行突变,获得突变体R15A、K167A、R203A和R203D。测定了突变体利用两种辅酶NADH和NADPH时催化活性和动力学常数。结果表明,四个突变体利用NADPH的催化活性显着降低,且K167A、R203A和R203D降低了酶对NADPH的亲和力,说明它们与NADPH的结合有关。K167A提高了酶利用NADH的催化活性,推测其可能影响辅酶偏好性。综上,本论文克隆表达了大肠杆菌硝基还原酶NfsA,并初步确定了影响其催化活性、辅酶结合及偏好性的关键氨基酸。(本文来源于《大连理工大学》期刊2013-05-01）
王亚龙[4]（2011）在《原核表达大肠杆菌硝基还原酶及其多克隆抗体的制备》一文中研究指出用限制性内切酶EcoRI单切已经构建好的含有NTR基因的T-easy/NTR质粒,将切出的NTR基因片段克隆入原核表达载体pRSET B中,经过EcoRI单酶切和HindIII/XbaI双酶切鉴定以及测序表明序列均正确。以IPTG诱导NTR-pRSET B/BL21表达出相对分子质量( M r)约为27kDa的可溶性融合蛋白。和硝基还原酶的大小相等。使用Ni~+-NTA亲和沉析纯化后得到的可溶性蛋白,免疫家兔得到了特异识别融合蛋白的抗体,同时该抗体能检测出真核表达的硝基还原酶NTR。免疫印迹的结果显示原核表达的NTR融合蛋白具有较好的免疫学活性;自制抗NTR兔免疫血清可为进一步研究NTR基因在真核细胞中的表达及用于治疗提供了一种有用的试剂。(本文来源于《吉林大学》期刊2011-12-01）
大肠杆菌硝基还原酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
芳香羟胺是合成许多农药、医药、精细化合物等的重要有机中间体。不同于化学催化,生物酶催化法制备芳香羟胺反应条件温和、选择性高且环境友好。大肠杆菌硝基还原酶NfsA和NfsB依赖于烟酰型辅酶NAD(P)H,对芳香硝基化合物的硝基还原存在选择性,反应能得到羟胺终产物。研究其在可控合成芳香羟胺,尤其是硝基羟胺化合物的催化性质,可促进硝基还原酶在制备芳香羟胺中的应用。因此本论文展开以下工作：(1)利用大肠杆菌硝基还原酶NfsA,NfsB及NfsB突变体F123A的纯化酶,以1,2-DNB,1,3-DNB和1,4-DNB为还原底物,检测酶活力,并进行HPLC, MS分析以及动力学常数测定,发现NfsA和NfsB对叁种底物均表现出催化活性,还原产物均为单羟胺产物；NfsB对1,2-DNB,1,3-DNB和1,4-DNB的Kcat/Km值分别为NfsA的13%,33%和50%；NfsB突变体F123A对二硝基苯化合物的催化效率明显提高,kcat/Km值为野生型NfsB的2-5倍,与野生型NfsA的催化活性相当。NfsA和NfsB均表现出对1,2-DNB的优先还原,对1,4-DNB的还原效率最差；分子对接分析推测1,2-DNB的硝基能更有效的定位于酶活性口袋以保证更好地结合。(2)为研究取代基-NH2,-COCl,-COOH,-CH3的性质对二硝基苯底物反应活性的影响,选择3,5-DNA,3,5-DNT,DNBC和DNBA为底物进行实验,发现NfsA和NfsB对DNBC和DNBA表现出较好的还原活性,是不含其他取代基的1,3-DNB kcat/Km值的3-17倍,对3,5-DNA和3,5-DNT的活性仅为1,3-DNB的63%-72%,说明苯环上取代基的性质会影响酶对底物的反应活性；NfsB突变体F123A对四种底物的kcat/Km值显着提高,是野生型NfsB的2-3.6。(3)基于结构的氨基酸序列比对,分析了与NfsA和NfsB辅酶偏好性相关的残基位点,设计NfsA突变体为R15E,D165R,K167E,Y199A,Y200A,R225H和R225Q, NfsB突变体为K14R,K14S,T41L, N71S,N71T,F123A,F124A比较酶以呋喃西林为模式底物,利用不同辅酶时的酶活力发现,NfsA突变体R15E,R225H和R225Q的辅酶偏好性进一步向NADPH转变,D165R和Y200A利用NADH为辅酶时的催化活性提高,辅酶偏好向NADH转变；NfsB突变体K14R,K14S,N71S,N71T利用两种辅酶时的活性明显降低,辅酶偏好性向NADH转变,表明上述残基可能参与辅酶的相互作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
大肠杆菌硝基还原酶论文参考文献
[1].白敬.大肠杆菌硝基还原酶NfsB的分子改造及其催化特性[D].大连理工大学.2015
[2].刘培瑜.大肠杆菌硝基还原酶可控合成芳香羟胺的性质研究[D].大连理工大学.2015
[3].战君菲.大肠杆菌中硝基还原酶NfsA的表达纯化与催化性质研究[D].大连理工大学.2013
[4].王亚龙.原核表达大肠杆菌硝基还原酶及其多克隆抗体的制备[D].吉林大学.2011