导读:本文包含了脑片培养论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:冰冻切片,脑片培养,海马神经元
脑片培养论文文献综述
钟磊,谢燕萍,杨娟,冯伟伟,游宇[1]（2017）在《小鼠海马神经元冰冻切片和脑片培养方法的比较》一文中研究指出目的:通过冰冻切片和脑片培养方式比较获得更适合脑片实验研究的方法。方法:分别运用急性切片和脑片培养方法,结合全细胞膜片钳技术比较两种脑片处理方法对小鼠海马神经元细胞形态、细胞膜封接难易程度、细胞电生理特性等的差异,获得更适合细胞研究的脑片获取方法。结果:冰冻切片方法切断部分神经纤维,脑片表层出现肿胀或坏死细胞,2-3层细胞可用于膜片钳记录,但不易封接破膜。脑片培养后可使纤维再生,整个脑片细胞形态清晰可见,容易封接破膜,电生理记录波形及基本特性与冰冻切片一致,但脑片培养方法的细胞突触后电流幅度更大、频率更高。结论:脑片培养可修复受损纤维和细胞膜柔韧性,且不改变膜特性,但脑片培养重建了一定数量的细胞间信号连接,使细胞反应性增强,脑片培养方法更适合脑片神经元研究。(本文来源于《现代生物医学进展》期刊2017年28期）
董梅,程树彬,郭彦芳,李钊,李世平[2]（2017）在《器官型脑片培养OGD复氧复糖模型中丁苯酞对于bcl-2/bax、及bim蛋白的调节作用》一文中研究指出目的观察正丁基苯酞(NBP)对乳大鼠大脑皮质器官型脑片的氧糖剥夺模型(OGD)中细胞凋亡bcl-2、bax及bim蛋白的调节作用。方法用生后7 d的SD乳大鼠制备大脑皮质运动区器官型脑片,将培养2 w的脑片随机分为对照组(C组)、模型组(M组)、溶剂对照组(Sc组)和实验组(T组),T组在OGD干预30 min后给予NBP 10μM。将脑片制备OGD模型30 min,部分脑片在NBP干预前后不同时间点(0 h、1 h、24 h、72 h)进行PI染色;部分脑片在NBP干预后6 h用戊二醛固定,做石蜡切片,行HE染色及bcl-2、bax、bim免疫组化染色。结果 PI染色可见C组在不同时间点荧光强度无明显变化,M组、Sc组和T组荧光强度均随时间有不同程度增强,M组和Sc组各时间点荧光强度无明显差异,T组荧光强度较前两者降低,随时间延长,降低幅度增大,尤其是72 h时间点。HE染色C组可见皮质运动区特有的大锥体细胞,结构清晰,M组和T组可见细胞肿胀,细胞核溶解,M组相对明显。免疫组化染色可见在3种染色中M组和T组阳性细胞数均较C组增多,其中bcl-2染色中T组阳性细胞增多更明显,bax和bim染色中M组阳性细胞增多更明显,3种染色中C、M、T各组之间差异均有统计学意义。结论NBP对OGD后的细胞损伤具有保护作用,可能是通过对bcl-2、bax以及bim蛋白的调节减少细胞凋亡。(本文来源于《中风与神经疾病杂志》期刊2017年01期）
韦朝霞[3]（2016）在《BDNF-TrkB通路在海马脑片培养中的神经再生研究》一文中研究指出研究背景和目的在哺乳动物大脑,可增殖的神经祖/神经干细胞在适当的情况下可产生新的神经元并将其整合到现有的神经元环路,这一过程的存在称为神经再生,它可通过操纵内源性神经祖细胞的增殖和分化来提高细胞替代治疗各种神经退行性疾病的可能性。因此破解出调节神经再生的“合适条件”,使得内源性神经替代系统转化为治疗干预措施显得格外重要。生长因子是神经干细胞发挥功能的重要影响因素。在活体和培养系统内,多种细胞外生长因子已被证明可促进神经祖细胞的增殖和神经再生。神经营养因子属于生长因子家族,包括神经生长因子(NGF),脑源性神经营养因子(BDNF), neurotrophin-3(NT-3)和neurotrophin 4/5(NT-4/5),可参与神经祖细胞的生存和增殖,在新生神经元的分化和迁移过程中的自我修复中起重要作用。其中,BDNF因为是中枢神经系统中含量最丰富、分布最广泛的神经营养因子而最为引人关注。BDNF几乎调节了神经元发育和功能的所有方面,包括诱导、增殖及分化。BDNF通过特异性结合和激活酪氨酸激酶受体(TrkB),或一个单一的泛神经营养因子受体(p75NTR)发挥作用。目前认为BDNF-TrkB信号在神经再生中起重要作用。在大脑的不同区域,BDNF或TrkB通过遗传或化学方法发生功能性变化积极参与神经再生的过程。体外,BDNF促进神经祖细胞的增殖,在神经细胞球培养中可增加神经元含量。尽管如此,BDNF如何促进神经再生,以及BDNF是如何影响神经前体细胞的增殖和分化目前仍未能达成共识。与之前的报道不同的是,我们用海马组织型切片培养(OHSCs)来探明BDNF对神经再生的影响。与传统的离体神经再生研究的神经元细胞培养相比,OHSCs似乎更适合研究体外新生和成年期的神经再生,因为OHSCs包含各种神经元和非神经元物质,与生理条件更相近；此外,OHSCs可在数周内保留大部分解剖通路、纤维联系和内在功能活性,可维护内源性神经元祖细胞自发生成新的神经元,可以更好的模拟在体生理功能。与在体研究相比,用OHSCs可以以在体无法达到的BDNF浓度进行精确的实验操作,并避免体内BDNF不能通过血脑屏障的缺点更直观的观察其药理作用,是很适合研究研究神经再生的载体。因此,在本研究中我们应用OHSCs研究BDNF对神经再生的影响。目前为止,只有少数生长因子,诸如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)在OHSCs上显示出对神经再生的复杂影响。此外,现有研究强烈提示BDNF和其关联的受体TrkB参与调节了神经再生过程。因此,我们使用OHSCs来研究BDNF对神经再生的影响,用5-溴脱氧鸟苷(BrdU)标记法研究培养海马脑片的神经再生能力。神经细胞的神经元成熟由两个神经元标记物双肾上腺皮质激素(DCX)和神经元特异性核蛋白(NeuN)表示。通过计算由这两个标记物标记的阳性细胞,我们试图在OHSCs系统中重新评估BDNF对神经再生的影响,并探讨BDNF-TrkB的浓度及时长选择是否为神经再生的关键因素之一。在成年哺乳动物大脑的神经生长中心中,有自我更新能力的神经干细胞(NSCs)聚集于室管膜下区(SVZ)和海马颗粒下层(SGZ)。最近的研究表明,BDNF-TrkB对脑缺血可发挥神经保护作用,可显着促进由缺血诱导的神经再生,尤其是在海马SGZ。脑缺血可引起海马神经元死亡,也可引起反应性细胞增殖和神经再生增加,这被认为是神经元丢失的补偿机制。缺血诱导的神经再生机制仍不甚明了,需更多证据阐明。OHSCs系统是研究缺血诱导的神经再生的方便而可靠的工具。离体研究中,可以用氧葡萄糖剥夺技术(OGD)对OHSCs造成类似于缺血引起的损伤。本研究中,我们首次设计了一系列实验来证实OGD诱导的神经再生。缺血诱导损伤的强度与神经再生程度是否有关仍未确定,我们对培养脑片施以不同持续时间的OGD来诱导出正常、轻度及重度损伤,试图明确损伤强度和缺血诱导神经再生之间的关系。鉴于BDNF-TrkB信号对控制缺血诱导神经再生的重要性,我们进一步监测了OGD诱导损伤后BDNF和TrkB在OHSCs的表达,了解神经元损伤后BDNF-TrkB信号的变化及其与神经再生的相关性。方法动物本研究所用C57BL小鼠来自于广东省实验动物中心。所有操作及饲养均遵循人道原则尽量减少动物的痛苦及使用数量。符合广东省实验动物管理条例并通过实验动物伦理委员会审核。脑片培养海马脑片培养准备如既往研究所述,并稍做改进。取产后6天幼鼠,断头取脑,分离海马,迅速置于预冷的人工脑脊液(aCSF)中,此液配方为：NaCl 118mM,KCl2.5 mM, MgSO43 mM, NaH2PO4 1.1mM, NaHCO326 mM, CaCl2 1 mM和葡萄糖11 mM(所有试剂购自美国Sigma公司),置于95%02/5% C02饱和气体中。随后,用切片机(MA752,Campden仪器公司)切400μm厚冠状切片,取相邻的背侧海马冠状切片,每个培养板中放入1-2片以待培养。在体视显微镜下,将浸泡于预冷、氧合Hank's平衡盐溶液(Gibco, Invitrogen公司)中的海马切片仔细分离,将没有明显损坏的脑片移至无菌多孔滤膜Millicell(Millipore公司),无血清培养基由50%MEM,18% HBSS,4mM L-谷酰胺,12 mM葡萄糖,4.5mM NaHCO3,20 mM蔗糖,100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素组成(所有试剂均购自Gibco或Sigma公司)。从每个海马中挑选部位匹配的脑片,随机分配到不同的培养条件组。由培养液中所用重组人BDNF(Immunological Sciences公司)和BDNF拮抗剂K252a(50 nM,Sigma公司)或TrkB-IgG(2ng/mL,R&D系统,)的不同浓度进行分组。碘化丙啶(PI)标记碘化丙啶(PI)是经典的细胞活性探针,在细胞膜破裂后进入细胞与DNA结合发出红色荧光。OGD处理后24小时,培养基内给予20μg/mLPI,5分钟后在荧光显微镜下观察并照相,以观察神经元受损死亡程度。BrdU处理为即时标记有丝分裂后细胞,我们对DNA合成标记物BrdU的处理方法大致遵照传统方式并略做改进。为确定合适的BrdU方案我们使用两种改进办法：第一种方法为在脑片制备30分钟前对活体动物进行单次的给药,将BrdU溶解在0.9% NaCl中,以50 mg/kg的剂量腹腔注射到幼鼠体内,此后脑片无需进行二次BrdU处理。第二种方法为BrdU处理两次。先将BrdU注射到老鼠体内,然后在在脑片体外培养阶段给予0.5 uMBrdU处理3天(DIV 0至DIV 3)。氧葡萄糖剥夺(OGD)处理常规OGD处理：OGD处理液由10 mM的甘露醇代替原有的培养基。在OGD处理前,OGD培养基加入6孔板,用95%N2和5%C02混合气体预饱和,并37℃预热。在正常培养的第8天(DIV 8),将海马脑片从无菌室中转移至预热的OGD培养基,并置于一个密封箱内,予95%N2和5%C02混合气体通气10分钟。箱密封后置于37℃孵育40分钟。40分钟后,重新置于原有培养基中继续培养。对照组使用正常培养基。免疫组织化学染色在体外培养第16天(DIV),在室温条件下将培养脑片固定在4%PFA 1小时,然后转移到30%蔗糖溶液中孵育24小时。随后将脑片置于37℃ 2 M HCl30分钟,在硼酸(0.1 M,pH 8.5)液中冲洗10分钟。然后将脑片在PBS中彻底洗净,用5%山羊血清与5%牛血清白蛋白封闭30分钟。做免疫组化：将脑片与羊抗BrdU抗体(1：50,Sigma公司),鼠抗NeuN抗体(1：50,Chemicon公司)或鼠抗GFAP (1:200, Sigma公司)抗体、或鼠抗DCX抗体(1：100,Sigma公司)双抗体在0.1%的Triton PBS孵育过夜,后在PBS彻底清洗3次共10分钟；之后在PBS中用羊抗兔TRITC(1:50, Chemicon公司)和羊抗鼠Alexa 488 (1:50, Chemicon公司)二抗孵育双染。对应的阴性对照组未见特异性的二抗染色。脑片在PBS多次洗脱后,用DPX(Sigma公司)封片。免疫印迹体外培养的切片(每同一实验条件下收集8个脑片)置于冷冻的RIPA缓冲液中匀浆。使用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific公司)做蛋白定量分析。从整个组织匀浆提取15ug蛋白置于SDS-PAGE(4-20%凝胶,Bio-Rad公司),并转移到PVDF转移膜(Millipore公司),分别用不同抗体标记,用增强化学发光剂(ECL)显色。使用Image J对免疫阳性条带进行光学密度测量并定量分析。统计学处理在徕卡DMRA2显微镜下用徕卡DFC300FX摄像头仔细观察,对整个切片进行计数。为确保每张切片细胞总数类似,只选择DAPI核染色平均密度及大小均近似的切片。量化实验中,每个脑片的编码和细胞计数由实验人员双盲检测及处理。统计分析和图形制作使用SPSS19.0软件(美国)。使用Excel绘图,结果用均值士标准差(mean±SD)表示。多组样本比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),两两比较或组间比较采用Bonferroni, LSD, Student-Newman-Keuls(在结果中已注明)。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.海马脑片培养中的神经再生为寻找一个更加优化的BrdU标记方法,本研究对文献报道的BrdU标记方法进行比较。我们应用两种方案给予BrdU:1)方案1,仅在取脑前对活体动物进行单次的给药(BrdU,50mg/kg);2)方案2,在方案1的基础上在脑片体外培养阶段给予0.5 uMBrdU处理3天(DIV 0至DIV 3)。两种方案均在DIV 16后进行脑片固定,利用抗BrdU抗体进行免疫荧光标记,结合神经元标志物DCX、NeuN和星型胶质细胞标志物GFAP进一步分析新生细胞的类型。用方案1标记BrdU,大于70%BrdU+细胞分布于齿状回的颗粒细胞层(GCL),其余细胞主要散在分布于门区、CA1和CA3区；用方案2标记BrdU, BrdU+细胞弥散于整个脑片,阳性细胞数大量增加。为了证实我们的推测,我们应用星型胶质细胞标志物GFAP与BrdU进行双重标记。应用标记方案2,每个脑片大约有213+29个BrdU+细胞,大量BrdU+(>85%)细胞表现为GFAP阳性。因此,BrdU+/GFAP+细胞可反应胶质细胞的增殖水平。我们进一步利用成熟神经元的标记物NeuN与BrdU进行双重标记,仅有极少数细胞(平均8±2.3,n=6)表现为NeuN+/BrdU+,阳性细胞主要分布在齿状回颗粒细胞层,在CA1和CA3区数量极少。这些NeuN+/BrdU+细胞的BrdU信号表现为染色质的斑点样改变。与之相区别,GFAP+/BrdU+细胞的BrdU信号表现为均匀的片状深度染色。这些染色特征对快速判断新生神经元具有重要作用。2. BDNF-TrkB信号与神经再生的关系目前,BDNF在海马脑片中的神经再生作用尚未见报道。因此,为了阐明BDNF在细胞增殖与分化的作用,我们应用上述BrdU标记方案2,在培养过程中加入梯度浓度的BDNF (1,10,20,40,80,160,320ng/mL),在培养16天后(DIV16)进行免疫荧光双标记鉴定,以研究BDNF对神经元的影响。不同的免疫标志物(NeuN, DCX, GFAP)分别与BrdU进行双重标记,对双重标记的细胞进行计数。BDNF的补充导致BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+细胞数增加,呈现一定的浓度依赖性。与对照组相比,高浓度(40～320 ng/mL)补充BDNF导致的新生神经元细胞数增加有统计学意义(P<0.05,n=6),峰值响应在80 ng/mL. BrdU+/DCX+细胞数量是BrdU+/NeuN+细胞数量的3～4倍。分析新生的BrdU+/GFAP+星形胶质细胞的数量,在不同浓度BDNF补充的培养基中没有看到显着变化(P>0.05,n=6)。我们进一步用特异性酪氨酸激酶TrkB抑制剂K252a和BDNF清除剂TrkB-IgG阻断BDNF-TrkB信号以明确BDNF的作用。结果表明,BDNF-TrkB信号的双封闭虽然不能完全消除补充BDNF的影响(与对照组相比P<0.05,n=6),但可削弱新生神经元数量的增加(将BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+细胞数汇总,与80 ng/mL BDNF相比p<0.05,n=6)。为了解内源性BDNF在神经再生的重要性,我们用K252a和TrkB-IgG处理脑片,并且不补充外源性BDNFo结果表明K252a对脑片的存活没有影响,但与对照组相比可显着降低神经再生。3.在海马脑片培养中外源性BDNF补充的时机选择鉴于BDNF-TrkB信号的增强可以促进神经再生,我们进一步研究了在培养过程中BDNF和TrkB表达的动态变化。使用不补充外源性BDNF、其他培养条件不变的培养脑片作为对照组,我们研究了培养脑片BDNF和TrkB蛋白水平的改变。BDNF的表达在培养后第二天先是减少到35%,然后反弹约60%(P<0.05,n=4)。与BDNF不同的是,TrkB的蛋白水平随培养脑片的逐渐成熟不断上调,从培养第二天开始即有显着性升高(P<0.05,n=4)。在海马脑片培养中,随时间依赖的BDNF和TrkB表达的动态演变提示BDNF-TrkB的信号强度在神经元成熟过程中有动态调节过程。随后,我们探讨了上调BDNF信号强度对神经再生的影响是否与神经元成熟有关。内源性的BDNF和TrkB表达水平的变化可能影响外源性BDNF的促神经再生作用。正如前面实验证实,在培养期间,内源性的BDNF和TrkB表达水平呈现一定的特征性改变。我们推测,外源性BDNF的补充需要一定的时机选择。根据海马脑片培养期间内源性的BDNF和TrkB表达特征,我们将脑片培养分为培养早期(DIV0-8)和培养后期(DIV9-16),2个时期内均有外源性BDNF补充,分别比较外源性BDNF在不同时间段补充对新生神经元的促进作用。在第16天(DIV 16)计数BrdU+/DCX+细胞,结果显示在培养后期给予外源性BDNF并未显着促进神经再生。然而在培养早期给予相同剂量的外源性BDNF,BrdU+/DCX+细胞数量显着增多(与对照组相比,P<0.05,n=5),具有显着的促神经再生的效应。在培养早期补充BDNF组新生神经元的平均数量与前16天全程持续补充BDNF组的新生神经元平均数相似。早期补充BDNF与晚期补充所致的神经发生数量有显着差异(P<0.05,n=5)。结合内源性的BDNF和TrkB表达特征,结果提示外源性BDNF的补充与内源性的BDNF和TrkB表达水平有关,适度的BDNF-TrkB信号强度可能是神经元再生的重要影响因素。4海马脑片培养氧糖剥夺(OGD)模型诱导新生神经元的产生尽管既往报道在海马脑片培养中氧糖剥夺(OGD)可诱导新生神经元的产生,然而我们第一章研究结果发现海马脑片培养本身有一定数量的新生神经元。因此,在OGD处理后鉴定的新生神经元可能是与脑片培养本身有关。为了进一步证实OGD可诱导或促进新生神经元的生成,本研究设计4个实验组：对照组1,BrdU处理时间在培养前3天(DIV0-3)；对照组2,给予两次BrdU,分别在DIV0-3及DIV8-11；OGD处理1组,在对照组1的基础上于DIV8给予氧糖剥夺；OGD处理2组,在对照组2的基础上于DIV8给予氧糖剥夺(图2-1a)。在海马脑片培养DIV16用DCX与BrdU抗体进行荧光双标记,对DCX+/BrdU+细胞(新生神经元)计数。如图2-1b所示,在OGD处理前给予BrdU仅能标记脑片培养过程中自发发生的新生神经元,OGD 1组与对照组1并无显着差异,提示OGD处理对自发发生的新生神经元的存活和分化影响不显着。在OGD处理后给予BrdU能标记在OGD发生后发生增殖的神经祖细胞。比较OGD 2组和对照组2,可见DCX+/BrdU+细胞数有显着差异(P<0.05),OGD处理可增高新生神经元的数量。同样,OGD 2组的DCX+/BrdU+细胞数显着高于OGD 1组,提示OGD处理可能主要通过诱导神经祖细胞增殖。5新生神经元的产生依赖于海马脑片培养氧糖剥夺(OGD)损伤程度上述结果显示OGD可能通过诱导神经祖细胞的增殖促进新生神经元的产生。我们推测,神经元的受损程度可能与OGD的诱导增殖能力有关。因此,实验中设计叁种OGD处理时间,以文献报道的OGD处理时间定义为1)常规OGD组,OGD持续时间50分钟；2)轻度OGD处理组,处理时间为常规时间的一半,25分钟；3)重度OGD组,OGD持续时间100分钟。在DIV 9,即OGD处理后1天给予PI染色鉴定培养脑片的细胞损伤程度。结果显示,细胞损伤水平与OGD处理时间成正相关。在培养前叁天用BrdU处理的脑片中,在OGD处理后立即检查BrdU+细胞,可测定OGD诱导的细胞增殖和神经再生。以对照组2的BrdU给予方法,比较叁种OGD处理时间对培养的海马脑片新生神经元生成的影响。结果显示,轻度OGD和常规OGD组显着增加DCX+/BrdU+细胞数,显着提高海马脑片培养的新生神经元生成(P<0.05,n=5)。常规OGD组诱导的新生神经元数量比轻度OGD组显着增高,严重OGD组诱导产生的新生神经元较其它组都少,与轻度OGD组和常规OGD组相比、甚至与对照组相比均有统计学差异(P<0.05, n=5,ANOVA and post-hoc LSD test),严重OGD组的反向作用原因可能是严重的缺氧导致培养脑片的神经祖细胞或新生的神经元死亡,最终表现为在DIV16检测的新生神经元数量较少。6海马脑片培养OGD损伤后BDNF与TrkB的表达变化前面已经证明,内源性BDNF及TrkB的蛋白表达是随着体外海马脑片培养的时间动态变化的。在脑片培养的过程中,神经元生长经历了不同的过程,包括损伤、修复、神经元的再生与成熟过程等,这些过程可能与BDNF-TrkB信号强度相互关联。而OGD的损伤后,内源性BDNF及TrkB的蛋白表达又是如何变化的?本研究利用Western blot的方法测定OGD处理后不同培养时间点的BDNF与TrkB的相对表达水平。以未受OGD处理的脑片(DIV 8)为对照,结果发现TrkB和BDNF蛋白表达改变相匹配,在OGD早期急剧下调,在OGD后期急速回升。BDNF在24小时和48小时显着低于对照组(P<0.05),随后快速回升,并在OGD处理6天后和8天后(DIV 14和DIV 16)显着高于对照组(P<0.05)。TrkB则在OGD处理48小时后的表达显着降低,而在OGD处理后8天显着高于对照组。与同时期的正常脑片培养相比,BDNF及TrkB蛋白的表达在OGD处理后4天并未有显着差异,而在OGD处理后OGD处理后8天显着增高(P<0.05)。结果提示,OGD诱发细胞损伤后的早期(4天内),BDNF及TrkB蛋白的表达下调；在损伤修复期(6-8天),与未受OGD处理的同时期脑片相比,BDNF及TrkB蛋白的表达显着增高,证明OGD处理本身可促进BDNF及TrkB蛋白的表达。结论1.海马脑片培养是研究神经再生的一个重要工具。2.外源性补充BDNF可成浓度依赖地促进海马脑片培养的新生神经元生成。3.阻断内源性或外源性的BDNF均可抑制海马脑片培养的新生神经元生成。4.海马脑片培养过程中内源性BDNF与TrkB蛋白表达是动态变化的。在培养早期,内源性BDNF相对不足。5.外源性补充BDNF的促神经再生作用具有时机性。在培养早期给予外源性BDNF补充最为关键,可能与培养早期的内源性BDNF相对不足有关。6.在海马脑片中给缺氧缺糖处理后,细胞存在不同程度的损伤, 并在损伤后的修复期新生神经元增加。7.培养的海马脑片给予不同维持时间的缺氧处理,细胞损伤水平与处理时间成正相关。细胞损伤较小时,诱导生成的新生神经元数量也较小。细胞损伤过大,培养的海马脑片的新生神经元数量并未相应增高,相反,显着低于正常对照。8.在培养的海马脑片中,缺氧处理后的细胞损伤早期内源性BDNF与TrkB的表达水平显着下降；而在缺氧处理后期,即细胞修复期,内源性BDNF与TrkB的表达水平迅速增高,并在缺氧处理后8天,显着高于正常对照。(本文来源于《南方医科大学》期刊2016-03-08）
宫晓丽,王乐,王玮,付夏,张婷[4]（2015）在《阿霉素在小鼠离体培养脑片中增强Ⅱ型腺相关病毒的转导》一文中研究指出目的在小鼠离体培养脑片中观察Ⅱ型腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV-2)载体介导的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的感染,并进一步研究阿霉素促进AAV-2转导的效应。方法离体培养小鼠全脑脑片,在培养基中加入携带EGFP的AAV-2(AV2.EGFP)或阿霉素与AV2.EGFP的混合物,利用荧光显微镜实时观察活细胞中EGFP的表达情况。结果 AV2.EGFP感染脑片6 d后,EGFP稳定表达,同时加入1μmol/L阿霉素可明显增强EGFP表达,阳性细胞数增加至2.8倍,该效果至少可持续6 d。并且,阿霉素与AV2.EGFP同时给药与在AV2.EGFP感染之后给药效果相似。结论阿霉素在小鼠离体培养脑片中可明显增强AAV-2的转导,该研究有望促进AAV-2介导的基因治疗在中枢神经系统疾病中的应用。(本文来源于《首都医科大学学报》期刊2015年06期）
王玉晶[5]（2015）在《神经科学研究中人类脑片培养技术的建立和评价》一文中研究指出目的：建立和优化离体脑组织切片的培养方法，制备适用于活组织电生理学研究的人类脑片标本。方法：（1）建立稳定的Wistar幼鼠脑片体外培养方法：优化啮齿类脑片培养技术，在切片和培养记录过程中使用不同成分的改良人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF），采用界面下培养-快速层流技术,在48h内动态观察脑片局域场电位（local field potential，LFP）变化，采用HE染色、氯叁苯四唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色、尼氏染色动态观察脑片组织病理学变化。（2）人类脑片体外培养方法：在优化啮齿类脑片培养方法的基础上，采用神经外科深部脑肿瘤切除手术过程中，开窗切除的非病理大脑皮层组织迅速进行转运、修块和进行体外切片培养，并同上过程监测脑片LFP和神经元组织病理学变化。结果：（1）幼鼠和人类脑片LFP电生理信号均可持续48h以上，但随着培养时间的延长呈衰减趋势；（2）HE染色计数脑片神经元死亡率随时间呈递增趋势，人类和幼鼠脑片均可维持50%以上神经元存活达24h；（3）TTC染色脑片IOD值随时间呈递减趋势，培养24h后呈衰减趋势，48h组仍可见红色区域，各观察时间点人类脑片与幼鼠比较未见明显差异（P<0.05）；（4）尼氏染色IOD值随时间呈递减趋势，幼鼠和人类脑片在24h后明显降低，48h后降至较低水平。结论：人类脑片培养存活时间与啮齿类脑片相似，可以在切片后保存半数以上的神经元存活达24h以上，能够满足活细胞神经电生理研究要求。采用不同的切片和培养ACSF溶液，联合液面下培养-快速层流技术，可以满足手术切除的人类非病理大脑皮层组织体外切片培养前经过1h左右的运输时间。(本文来源于《吉林大学》期刊2015-05-01）
王玉晶,代丽花,梁建民[6]（2014）在《应用脑片培养技术进行神经科学研究》一文中研究指出探索神经元功能的理想方式是在活体动物大脑中进行研究,但因技术限制至今难以开展和深入。尽管分散神经元培养和活体动物模型已广泛用于神经病理生理机制研究中,但针对不同的研究目的,它们在某种程度上存在不足之处。例如,分散培养神经元由于神经元间的联系缺失,无法模拟在体病理生理过程。活体动物模型研究易受多种内环境因素干扰,在某些神经功能活细胞研究中具有一定局限性。活组织脑片是介于分散神经元培养与活体动物模型之间的活(本文来源于《中风与神经疾病杂志》期刊2014年12期）
周丽,周军,刘艳平[7]（2013）在《丹参酮ⅡA对Aβ_(1-42)处理的体外培养海马脑片组织神经元与胶质细胞的影响》一文中研究指出目的观察丹参酮ⅡA(TanⅡA)干预Aβ1-42处理体外培养的新生大鼠海马脑片组织中神经元特异核蛋白(NeuN)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和CD11b表达的影响。方法将大鼠海马脑片随机分为正常对照组、Aβ高、低剂量模型组和Aβ模型组联合TanⅡA高、低剂量组,共7组。其中正常组仍用完全培养液培养,Aβ高剂量模型组为完全培养基加5μg Aβ1-42,Aβ低剂量模型组为完全培养基加0.5μg的Aβ1-42,TanⅡA药物处理组分别为Aβ模型组加8μg或16μg TanⅡA。免疫组织化学染色法检测TanⅡA处理后各组NeuN、GFAP和CD11b表达水平的改变。结果与正常对照组比较,不同剂量Aβ处理组NeuN表达均减少,其中高剂量组下降明显(P<0.05),用高剂量TanⅡA干预后NeuN表达量均显着上升(P<0.05);对比正常对照组,Aβ处理组中GFAP和CD11b表达量均上升,其中高剂量Aβ处理组中两种蛋白表达量显著增高(P<0.05),TanⅡA处理组2种蛋白表达均下降,高剂量组下降明显(P<0.05)。结论 TanⅡA干预Aβ诱导的AD海马脑片模型,可有效的减少组织中GFAP和CD11b的表达水平,抑制胶质细胞的活化。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2013年11期）
程树斌[8]（2013）在《器官型脑片培养OGD复氧模型中丁苯酞对于bcl-2/bax及bim蛋白的调节作用》一文中研究指出目的：建立大脑皮层的器官型脑片氧糖剥夺模型（Oxygen andGlucose Deprivation,OGD），观察OGD复氧模型中丁苯酞（NBP）对细胞凋亡中bcl-2、bax及bim蛋白的调节作用。方法：用生后7天的SD(Sprague Dawley)乳大鼠，制备大脑皮层运动区的器官型脑片，用膜插件的方法进行体外培养，观察其形态。2周后，将脑片随机分为对照组（C组）、模型组（M组）、溶剂对照组（MT组）和实验组（T10组），每组九片，更换含有Propidium iodide（PI,1μg/ml）的培养液，孵育20min,倒置荧光显微镜下拍照（4X，曝光时间1.038ms，灵敏度ISO1600），后模型组、溶剂对照组和实验组采用厌氧罐氧剥夺，更换无糖培养液（含PI）的方式，进行OGD干预30min,之后更换正常糖含量培养液，溶剂对照组更换同实验组等量溶剂(DMSO)的正常培养液(含PI),实验组更换含NBP（10μM）的正常培养液（含PI），对照组与实验组同一时间更换两次正常培养液。分别在干预前和恢复正常条件后不同时间点（1h、24h、72h），观察PI染色。另外，对照组、模型组和实验组，重复上述干预（培养液不添加PI），复氧6小时后用戊二醛固定，并做石蜡切片，进行HE染色及对各组进行bcl-2、bax、bim蛋白的免疫组化染色。结果：1体外培养的脑片存活良好，未见明显的坏死区域。2周的脑片，进行HE染色，可见正常的细胞结构。2PI染色可见对照组在不同的时间点荧光强度并未发生明显变化(P>0.05)，模型组和溶剂对照组可见荧光强度在OGD复氧1h后有明显增强，之后在24h、72h逐渐增强。两组进行各时间点比较其荧光强度未见明显差异（P>0.05）。3实验组荧光强度也呈现逐渐增强趋势，但与模型组比较，在24h、72h其荧光强度均低于模型组。4免疫组化染色可见对照组、模型组和实验组处理后6小时的石蜡切片中。bcl-2蛋白：模型组和实验组阳性细胞数均增多，实验组增多更明显，叁组差异均具有统计学意义；bax蛋白：模型组和实验组阳性细胞数均增多，模型组增多更明显，叁组之间差异均有统计学意义；bim蛋白：模型组和实验组阳性细胞数均增多，模型组增多更明显，叁组之间差异均有统计学意义。结论：1出生后7天的SD乳鼠可以作为体外脑片培养的脑组织供体，并且可以以此为平台，对脑细胞进行不同条件的刺激来研究神经细胞的不同反应；2OGD模型可以诱导脑片损伤，出现急性的细胞死亡和迟发性细胞凋亡，可以模拟在体的缺血缺氧后脑组织损伤，重复性良好；3NBP对OGD后的细胞损伤具有保护作用，其可能通过对bcl-2、bax以及bim蛋白的调节从而减少细胞的凋亡。(本文来源于《河北医科大学》期刊2013-03-01）
赵博[9]（2012）在《蝙蝠葛酚性碱对原代培养大鼠皮层细胞及离体脑片氧糖剥夺损伤的保护作用及机制研究》一文中研究指出蝙蝠葛酚性碱对原代培养大鼠皮层细胞及离体脑片氧糖剥夺损伤的保护作用及机制研究目的本研究通过建立原代培养大鼠皮层细胞和离体脑片氧糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation, OGD)模型,观察蝙蝠葛酚性碱(Phenolic alkaloids from Menispermum dauricum rhizome, PAM)在离体水平对OGD损伤的保护作用,并从细胞外谷氨酸(Glutamate, Glu)含量、细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential, MMP)及相关兴奋性氨基酸转运体(Excitatory amino acid transporters, EAATs)的表达等方面,探讨PAM对抗OGD损伤的保护作用及机制,为缺血性脑损伤相关疾病的治疗提供新的靶点,同时也为其临床应用提供可靠的实验依据。方法和结果第一部分蝙蝠葛酚性碱对原代培养大鼠皮层细胞氧糖剥夺损伤的保护作用及机制研究离体脑缺血模型采用原代培养大鼠皮层细胞的OGD模型。通过预实验确定PAM的给药剂量和给药时间段。通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, MTT]比色法和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)检测来观察PAM对OGD复氧(OGD-reoxygenation, OGD-R)所致大鼠皮层细胞损伤的保护作用。采用高效液相色谱(High performance liquid chromatography, HPLC)荧光检测技术测定原代培养大鼠皮层细胞培养液中Glu的含量。分别利用二氯二氢荧光素二乙酯(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)荧光探针和阳离子荧光羰花青染色剂(5,5',6,6',-tetrachloro-1,1',3,3'tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide, JC-1),运用流式细胞技术进行细胞内ROS和MMP的检测,以期进一步探讨PAM的保护作用机制。根据预实验结果选择PAM (0.1,1,10μg/mL)叁个剂量进行正式实验,给药时间点选在开始OGD时给药并持续至复氧结束。结果显示,PAM可以减轻OGD-R对大鼠皮层细胞的损伤。PAM可以有效降低OGD后细胞外液Glu含量的增加,在复氧6h后减少细胞内ROS的产生及降低MMP去极化程度。第二部分蝙蝠葛酚性碱对大鼠离体脑片氧糖剥夺损伤的保护作用及机制研究大鼠离体脑片缺血模型采用OGD模型。通过2,3,5-叁苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色的方法检验PAM对离体脑片的保护作用。分别检测皮层脑片和海马脑片上EAATs中的胶质细胞谷氨酸转运体1(Glial glutamate transporter-1, GLT-1)和兴奋性氨基酸载体1 (Excitatory amino acid carrier 1, EAAC1)的蛋白表达来探讨PAM对OGD-R损伤的保护机制。结果显示,PAM (0.3,3,30μg/mL)可以有效减轻OGD-R对大鼠离体脑片的损伤。OGD-R可使皮层脑片和海马脑片的GLT-1表达下降,EAAC1表达升高。而PAM除了在海马脑片上对EAAC1无显着影响之外,均可有效逆转OGD-R对这两种EAATs的影响。结论PAM在离体水平下可显着改善OGD-R损伤所致的毒性作用,其保护作用的机制可能涉及以下几方面：通过上调GLT-1的表达来摄取细胞外过多的Glu；通过下调EAAC1减少细胞外的Glu堆积；减少细胞内ROS的生成；降低MMP去极化程度,保护线粒体功能。(本文来源于《华中科技大学》期刊2012-05-01）
何志慧,蒋莉,陈恒胜,张晓萍[10]（2012）在《培养大鼠海马脑片模拟痫性发作后pCREB在细胞凋亡中的作用的初步研究》一文中研究指出目的:观察痫性发作对体外培养海马脑片的损伤作用,研究细胞磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(Phosphorylated cAMP response element-binding protein,pCREB)对损伤海马神经元的作用。方法:以培养11 d的海马脑片为研究对象,随机分为3组:(1)正常对照组:正常海马脑片培养液培养至14 d。(2)痫性发作模型组:正常海马脑片培养液培养至14 d,更换为含匹罗卡品(0.5 mmol/L)的完全培养液作用1 h后终止培养。(3)抗pCREB抗体干预组:用含pCREB抗体的海马脑片培养液(pCREB抗体终浓度为5μg/ml)预培养3 d,换为含匹罗卡品(0.5 mmol/L)的完全培养液作用1 h后终止培养。采用TUNEL原位末端标记法检测各组培养海马脑片凋亡细胞;免疫组化染色观察海马脑片神经元内pCREB蛋白的表达变化。结果:(1)痫性发作模型组:海马脑片CA1区发生凋亡的细胞(95.44±14.30)显着多于对照组(41.30±9.30)(P<0.05);pCREB表达(201.36±19.31)较对照组(75.12±13.71)显着升高(P<0.05)。(2)抗pCREB抗体干预组:海马脑片CA1区发生凋亡的细胞(140.88±18.32)较痫性发作模型组显着增多(P<0.05);pCREB表达(172.60±17.68)较对照组显着升高、较模型组显着降低(P<0.05)。结论:(1)痫性发作可以增加体外培养海马脑片神经细胞凋亡发生,加重神经元损伤。(2)痫性发作后海马脑片神经细胞CREB的磷酸化增强,阻断CREB的磷酸化可导致神经细胞凋亡加重。(本文来源于《重庆医科大学学报》期刊2012年04期）
脑片培养论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的观察正丁基苯酞(NBP)对乳大鼠大脑皮质器官型脑片的氧糖剥夺模型(OGD)中细胞凋亡bcl-2、bax及bim蛋白的调节作用。方法用生后7 d的SD乳大鼠制备大脑皮质运动区器官型脑片,将培养2 w的脑片随机分为对照组(C组)、模型组(M组)、溶剂对照组(Sc组)和实验组(T组),T组在OGD干预30 min后给予NBP 10μM。将脑片制备OGD模型30 min,部分脑片在NBP干预前后不同时间点(0 h、1 h、24 h、72 h)进行PI染色;部分脑片在NBP干预后6 h用戊二醛固定,做石蜡切片,行HE染色及bcl-2、bax、bim免疫组化染色。结果 PI染色可见C组在不同时间点荧光强度无明显变化,M组、Sc组和T组荧光强度均随时间有不同程度增强,M组和Sc组各时间点荧光强度无明显差异,T组荧光强度较前两者降低,随时间延长,降低幅度增大,尤其是72 h时间点。HE染色C组可见皮质运动区特有的大锥体细胞,结构清晰,M组和T组可见细胞肿胀,细胞核溶解,M组相对明显。免疫组化染色可见在3种染色中M组和T组阳性细胞数均较C组增多,其中bcl-2染色中T组阳性细胞增多更明显,bax和bim染色中M组阳性细胞增多更明显,3种染色中C、M、T各组之间差异均有统计学意义。结论NBP对OGD后的细胞损伤具有保护作用,可能是通过对bcl-2、bax以及bim蛋白的调节减少细胞凋亡。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
脑片培养论文参考文献
[1].钟磊,谢燕萍,杨娟,冯伟伟,游宇.小鼠海马神经元冰冻切片和脑片培养方法的比较[J].现代生物医学进展.2017
[2].董梅,程树彬,郭彦芳,李钊,李世平.器官型脑片培养OGD复氧复糖模型中丁苯酞对于bcl-2/bax、及bim蛋白的调节作用[J].中风与神经疾病杂志.2017
[3].韦朝霞.BDNF-TrkB通路在海马脑片培养中的神经再生研究[D].南方医科大学.2016
[4].宫晓丽,王乐,王玮,付夏,张婷.阿霉素在小鼠离体培养脑片中增强Ⅱ型腺相关病毒的转导[J].首都医科大学学报.2015
[5].王玉晶.神经科学研究中人类脑片培养技术的建立和评价[D].吉林大学.2015
[6].王玉晶,代丽花,梁建民.应用脑片培养技术进行神经科学研究[J].中风与神经疾病杂志.2014
[7].周丽,周军,刘艳平.丹参酮ⅡA对Aβ_(1-42)处理的体外培养海马脑片组织神经元与胶质细胞的影响[J].细胞与分子免疫学杂志.2013
[8].程树斌.器官型脑片培养OGD复氧模型中丁苯酞对于bcl-2/bax及bim蛋白的调节作用[D].河北医科大学.2013
[9].赵博.蝙蝠葛酚性碱对原代培养大鼠皮层细胞及离体脑片氧糖剥夺损伤的保护作用及机制研究[D].华中科技大学.2012
[10].何志慧,蒋莉,陈恒胜,张晓萍.培养大鼠海马脑片模拟痫性发作后pCREB在细胞凋亡中的作用的初步研究[J].重庆医科大学学报.2012