一、四氯化碳诱导鼠肝组织血管病变的动态观察（论文文献综述）
张强[1]（2021）在《基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制》文中认为肝纤维化（Hverfibrosis,LF）是肝胆系统疾病中的常见病,并且是大多数慢性肝病发展的必然阶段。目前医学界普遍认为早期肝纤维化能够逆转,但如何进行逆转,目前尚未形成普遍的共识。肝纤维化早期产生的诸多病理变化中,人们对肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells,SECs）的病理变化给予的关注逐渐增多,其特征性的细胞学行为改变包括“窗口”尺寸与数量的变化以及连续性基底膜的形成,一旦SECs发生去窗口化后,则肝纤维化的进程难以逆转,目前这已是不争的事实。目前针对肝纤维化的治疗,现代医学尚且只能给予病因治疗,针对肝纤维化本身而言,目前还没有疗效肯定的药物或治疗手段问世。中医药学在治疗肝纤维化方面的经验历史较长,并对其发病机制形成了完整的认识,尤其是在治未病思想指导下,针对慢性肝病给予早期干预,这在一定程度上能够降低患者未来发生肝纤维化、肝硬化的风险。芪术颗粒是姚乃礼教授经过多年的临床经验总结,结合目前中医药学界对肝纤维化的普遍认识基础上创制的治疗肝纤维化常用方,本课题在国家自然基金“基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制”（NO:81774282）的资助下,结合课题组前期的研究成果探讨益气活血方芪术颗粒治疗肝纤维化的机制。1.基于益气活血法治疗肝纤维化临床疗效的Meta分析目的:以Meta分析的方法评价益气活血法治疗肝纤维化的临床疗效。方法:1.以PubMed、中国知识基础设施工程数据库、万方数据知识服务平台为检索资料库,检索时间跨度为自建库到2020年12月31日;以检索词“liver fibrosis”、“hepatic fibrosis”为检索词,然后以“effect”或者“efficacy”作为关键词逐篇进行排除;以“肝纤维化”作为检索词进行检索,然后以“临床观察”、“疗效分析”作为关键词逐篇进行排除。以上数据库没有语言限制。2.纳入随机对照临床研究类文献,以肝纤维化四项、肝脏瞬时弹性成像、肝脾脏的形态、门脾静脉的宽度、不良反应、安全性等结局指标作为考核指标。结果:本次研究共纳入合格文献共93篇,其中有86篇文献以肝纤维化四项作为临床评价指标,两组对比显示中药组的临床疗效比对照组更好,结果对比具有统计学差异[MD=51.15,95%CI（56.95,45.35）,P<0.00001]。15篇文献以肝硬度值作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善肝硬度值方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=3.52,95%CI（4.78,2.26）,P<0.00001]。33 篇文献研究以门静脉直径作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善门静脉直径方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=1.20,95%CI（2.14,0.26）,P=0.01]。31篇文献研究以脾脏厚度作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善脾脏厚度方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=6.83,95%CI（9.54,4.12）,P<0.00001]。13篇文献研究以脾静脉直径作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善脾静脉直径方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=1.77,95%CI（3.04,0.49）,P=0.007]。结论:以益气活血为主要功效的中药组方在治疗肝纤维化方面相较于西药而言具有更好的临床疗效。2.基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制目的:（1）研究芪术颗粒对肝纤维化大鼠肝脏炎症因子、肝纤维化指标以及病理组织学的调控作用。（2）通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法明确芪术颗粒对肝窦内皮细胞eNOSmRNA、eNOS、NO表达的影响。（3）基于多相多级次多孔介质理论,明确芪术颗粒干预下肝窦内皮细胞的力学特征。方法:（1）以四氯化碳作为肝纤维化的诱导剂,构建肝纤维化大鼠模型,造模同时给予芪术颗粒进行干预,通过Elisa法、HE以及Masson染色研究芪术颗粒对肝纤维化大鼠的生化、病理组织学的影响。（2）原位胶原酶灌注+离体消化+梯度密度分离法分离提取肝窦内皮细胞。（3）以10%肝纤维化大鼠血清+5%的胎牛血清作为外在损伤因素作用于体外培养状态的肝窦内皮细胞,模拟体内生化环境,构建肝窦内皮细胞损伤模型。将细胞按照正常对照组、损伤组、正常大鼠血清损伤组、芪术颗粒含药血清低、中、高浓度进行分组。（4）采用 qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测胞内eNOSmRNA、eNOS、NO的表达情况。（5）基于多相多级次多孔介质理论,采用原子力显微镜表征芪术颗粒干预下肝窦内皮细胞的力学属性。结果:（1）芪术颗粒能够改善肝纤维化大鼠生化指标,改善肝脏病理组织形态。（2）经过细胞形态以及免疫荧光鉴定可知,我们所提取的细胞为大鼠肝窦内皮细胞,且纯度较高。（3）经 qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测胞内 eNOSmRNA、eNOS、NO显示芪术颗粒含药血清能够上调eNOSmRNA、eNOS、NO的表达。（4）经过芪术颗粒含药血清干预后,肝窦内皮细胞的骨架模量、粘度均有所提高,使肝窦内皮细胞向正常力学状态转变,而其扩散系数无明显变化。结论:（1）芪术颗粒能够抑制肝脏炎症状态,恢复肝脏正常组织形态。（2）芪术颗粒能够上调eNOSmRNA、eNOS、NO的表达,从而改善肝窦内皮细胞的病理状态,这可能是其抗肝纤维化的重要机制之一。（3）芪术颗粒能够改善肝窦内皮细胞的力学状态,促进肝窦内皮细胞向正常力学状态恢复,这可能是其发挥抗肝纤维化的另一重要机制。
周怡驰[2]（2021）在《柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究》文中提出中国是肝病大国,多种肝病高发,肝纤维化作为肝病研究和治疗的重要领域,越来越受到重视。肝纤维化是肝脏修复肝损伤引起的异常结缔组织增生和细胞外基质过度沉积的病理改变。肝纤维化存在于大多数慢性肝病中,是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,甚至可持续进展为肝硬化、肝癌,给患者生命健康带来严重威胁。研究肝纤维化的病因及发病机制、寻找有效的治疗靶点,对于阻止肝病的发展、维护患者的生命健康有很大的意义。近年来,肝纤维化的病理分子生物学机制、临床诊疗技术等取得了长足发展。但目前西医对于抗纤维化疗效尚不确切,缺乏有效的治疗手段。中医药治疗肝纤维化具有确切的优势,已有多种注册适应证为肝纤维化的中成药上市。柴芪益肝方由导师胡世平教授所创,是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的经验方,前期临床和实验研究发现对肝纤维化有较好疗效,但其作用机制尚不清楚。胡教授现任北京中医药大学深圳医院党委书记,广东省名中医,全国基层名老中医师承项目指导老师,深圳市地方级领军人才,获评“南粤最美中医”,从事中医药防治慢性肝病的临床与科研工作30多年,擅长中医、中西医结合治疗肝脏疾病,形成了独特的学术思想体系。目的结合临床回顾性研究、网络药理学预测和动物实验探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的疗效与作用机制,为该方的进一步开发应用提供依据,并分析总结导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想及其在柴芪益肝方组方思路中的应用。方法1、临床研究:通过回顾性研究方法,收集2018年1月1日至2021年2月3日期间在北京中医药大学深圳医院肝病科门诊及住院部诊断为慢性乙型肝炎患者的病例资料,并筛选出符合本研究标准的慢性乙型肝炎肝纤维化肝郁脾虚型患者。根据患者所服药物分为常规治疗组和CQYG组,收集所有患者治疗12个月前后的指标,包括主要指标:肝脏硬度值（LSM）、纤维化-4指数（FIB-4）、天门冬氨酸氨基转移酶和血小板比率指数（APRI）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量;次要指标:谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）,总胆红素（TBiL）,谷氨酰转酞酶（GGT）,白蛋白（ALB）,将所有检测指标进行治疗前后的组内与组间比较。2、网络药理学:检索 TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction、OMIM、Gene Cards等数据库,筛选CQYG治疗肝纤维化的活性成分和潜在作用靶点。借助Cytoscape软件和String数据库,分别构建“药物-成分-靶点-疾病”网络和蛋白互作PPI网络,并进行拓扑学分析,筛选关键药效分子和核心靶点。运用Autodock vina软件进行分子对接,并基于R语言对作用靶点进行GO和KEGG富集分析。3、动物实验:选取50只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机抽取10只分别纳入空白对照组（CTL）、肝纤维化模型组（Model）、柴芪益肝方低剂量组（CQYG-L）、柴芪益肝方高剂量组（CQYG-H）和水飞蓟素治疗组（Silymarin）,共5组。四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型:除空白对照组外,其余各组小鼠腹腔注射含15%CCl4的橄榄油5ml·kg-1,每周2次,连续注射8周。从造模第1天起,柴芪益肝方低、高剂量组小鼠分别灌胃给予0.37 g·kg-1·d-1、0.74 g·kg-1·d-1的柴芪益肝方,水飞蓟素组给予100 mg·kg-1·d-1灌胃。实验结束,摘取所有小鼠肝脏、收集血清,对各组小鼠肝组织进行HE、天狼星红、Masson染色;用自动生化分析仪检测血清AST和ALT的含量;ELISA法检测肝组织中MDA、SOD、GSH-Px和Hyp水平;免疫组化法检测肝组织中α-SMA、Collagen I、Vimentin的表达;免疫荧光法检测肝组织中Ki67+和Lgr5+细胞;提取各组肝组织RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot分别检测肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB、TGF-β/Smad、Wnt/β-Catenin信号通路相关靶标mRNA和蛋白表达。结果1、临床研究:共纳入符合标准的患者203人,其中,常规治疗组纳入101人,年龄最大者76岁,最小22岁,平均年龄（41.34±0.90）岁;CQYG组纳入102人,年龄最大者67岁,最小27岁,平均年龄（43.13±0.78）岁,两组年龄无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。（1）无创肝纤维化指标（LSM、FIB-4、APRI）在两组患者自身治疗前后比较,以及治疗后的组间比较,均无显着性差异（P>0.05）,但两组治疗后LSM均较治疗前有降低趋势。（2）两组患者自身前后比较,乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）治疗前和后均无显着性差异（P>0.05）;CQYG组较常规治疗组治疗后HBsAg显着性降低（P<0.05）,CQYG组治疗后HBV-DNA定量和HBsAg较治疗前均有下降趋势。（3）两组患者自身治疗前后血清肝功能指标（ALT、AST、GGT、TBiL、ALB）均在正常范围内,治疗后组间比较肝功能均无显着性差异（P>0.05）。2、网络药理学预测:共获得121种CQYG治疗肝纤维化的潜在活性成分和257个对应的作用靶点,并筛选出14种关键药效分子及28个核心靶点。点度中心性值前10的核心靶点和关键药效分子具有较好的结合活性。GO和KEGG结果主要涉及炎症反应、氧化应激、成纤维细胞增殖、内皮细胞增殖、调节脂质代谢活动、血管生成、肝再生等生物学过程及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等。3、动物实验研究:与模型组相比,CQYG各组和水飞蓟素组小鼠肝组织形态和胶原沉积较模型组改善,水飞蓟素组和CQYG-H小鼠血清ALT、AST水平均显着降低（P<0.01）;CQYG高剂量组肝组织MDA和Hyp的含量显着低于模型组（P<0.05）,SOD和GSH-Px含量显着高于模型组（P<0.05）;免疫组化结果显示,CQYG组和水飞蓟素组α-SMA、CollagenI、Vimentin阳性表达区域较模型组少;免疫荧光结果显示,柴芪益肝方组Ki67阳性细胞和Lgr5阳性细胞数量均较模型组有增多趋势;CQYG组肝组织中p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平较模型组显着降低（P<0.05）;与模型组相比,CQYG-H 肝组织 CollagenI、TGF-β、TNF-α、IL-1βmRNA 的表达水平以及 Collagen I、α-SMA、TIMP-1、TGF-β、磷酸化 Smad2/3、Smad2/3、Smad4、Wnt3a、β-Catenin 蛋白表达均较模型组有不同程度降低,而MMP-9、Smad7蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。结论1、临床研究:柴芪益肝方加减联合常规治疗有降低慢乙肝肝纤维化患者肝脏硬度值、HBV-DNA和HBsAg含量的趋势,且在降低HBsAg定量上优于单纯常规治疗。2、网络药理学:柴芪益肝方可能通过槲皮素、白藜芦醇、山奈酚等活性成分作用于丝裂原激活蛋白激酶MAPK1/3/8、原癌基因酪氨酸激酶Src、激活子蛋白Jun等靶点,以及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等,调节肝脏炎症反应、氧化应激、细胞增殖、肝再生等生物学过程发挥治疗肝纤维化的作用。3、动物实验研究:柴芪益肝方能显着减轻四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化,其作用机制可能减轻氧化应激反应、抑制NF-κB介导的炎症信号通路,下调炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放,减轻肝脏炎症,并通过调节TGF-β/Smad、Wnt3a/β-catenin信号通路,抑制肝星状细胞的活化,调节MMP-9和TIMP-1活性平衡,减少细胞外基质α-SMA、Collagen I、Hyp的合成,促进ECM降解相关。4、“推陈致新”学术思想:导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想核心在于顺应人体本身的正气祛邪之势和气血津液各自的新陈代谢过程,协助人体自然排邪,促进疾病向愈。在肝纤维化治疗上,通过“推陈致新”,加强气化动力、调节气机升降,使病理产物消除的同时,人体气血津液正常化生。
苏骁男[3]（2021）在《纤维连接蛋白额外结构域A促进肝纤维化及血管异常增生的作用与机制研究》文中指出研究背景肝纤维化是众多慢性肝脏疾病发生发展中重要的病理过程,其主要表现为肝脏内纤维结缔组织的异常沉积和病理性的血管增生。在各种慢性损伤因素的持续刺激下,肝纤维化会逐渐向肝硬化发展,进而引起肝门静脉高压、食管静脉曲张等一系列严重并发症。肝纤维化肝硬化在发达国家中造成的死亡率高达约45%,尽管有证据表明早期及时地对其进行干预可以缓解甚至逆转肝纤维化肝硬化,但临床上目前仍然缺乏统一规范的治疗方案。因此,进一步探究肝纤维化的发病机制,研发新的肝纤维化治疗靶点,对临床有着重要的指导意义。肝纤维化的发病机制主要包括两个方面。一方面,肝星状细胞在各种刺激下持续活化,分泌大量细胞外基质,造成纤维结缔组织过度沉积,导致肝脏硬度升高,压迫正常肝脏组织。另一方面,肝窦内皮细胞的活化导致肝内血管病理性增生血管网络发生重构,引起肝内血管阻力增加,进而影响正常肝脏血供,引起门脉高压。肝内血管异常增生对肝纤维化的发生发展有着重要的促进作用,有研究表明在肝纤维化早期利用特异性抗血管药物可以抑制肝纤维化的发展,但其具体机制目前还有待进一步的研究。纤维连接蛋白（Fibronectin）作为细胞外基质的重要组成成分,其包含有额外结构域 A 的 RNA 剪接体 FN-EDA（Fibronectin containing Extra Domain A）特异性表达在胚胎早期,以及特定的病理环境中。FN-EDA在包括肺、肾脏、皮肤、肝脏、骨髓在内的多种组织器官的纤维化中都扮演了重要的角色,但其具体机制目前尚未完全阐明。在肝纤维化中,早期研究提示FN-EDA参与了星状细胞的活化;但近期研究表明,FN-EDA主要影响了肝星状细胞的迁移能力而对于星状细胞的活化影响有限。肝内血管病理性异常增生作为肝纤维化过程中的重要部分,目前被认为是治疗肝纤维化的一个重要靶点。尽管FN-EDA在胚胎阶段参与了心血管系统的发生,并且有研究指出其促进了视网膜血管的生成,但FN-EDA在包括肝纤维化在内的一系列纤维化疾病中,对血管异常增生的影响以及其分子机制,目前尚未见报道。综上,本研究主要分为三个部分。第一部分利用临床标本、小鼠肝纤维化模型以及体外细胞共培养模型,深入探讨了 FN-EDA在肝纤维化中与肝内血管增生的关系以及作用效应。第二部分通过细胞实验和动物模型,深入探究了 FN-EDA促进肝纤维化血管增生的主要通路和具体调控机制。第三部分通过动物实验初步探究FN-EDA与其受体的特异性阻断剂Irigenin对肝纤维化血管增生潜在的治疗作用。本研究从崭新的角度揭示FN-EDA促进肝纤维化发生发展的相关机制,为肝纤维化的临床治疗策略提供了潜在的靶点以及相应的理论基础。第一部分星状细胞上的FN-EDA促进肝纤维化及血管异常增生研究目的FN-EDA在纤维化疾病中发挥着重要作用,但其在纤维化中对血管异常增生的影响尚不明确。本研究旨在探究FN-EDA与肝纤维化及血管异常增生的关系。研究方法1.检测FN-EDA在肝纤维化样本中的表达水平运用RT-qPCR检测临床肝纤维化患者以及正常人的肝脏组织中FN-EDA mRNA的表达水平,运用免疫蛋白印迹实验与免疫组织化学染色检测纤维化患者及正常人群肝脏组织中FN-EDA表达水平和定位情况,并进行统计分析。2.检测纤维化肝组织中FN-EDA与血管标志物CD31的表达并分析其相关性运用RT-qPCR检测临床肝纤维化患者的肝脏组织中FN-EDA与CD31的表达水平;运用免疫组化检测患者以及造模小鼠肝纤维化肝组织中FN-EDA与CD31的表达水平和定位情况,量化统计后进行相关性分析。3.研究FN-EDA对肝纤维化血管异常增生的促进作用通过组织免疫荧光双染实验明确FN-EDA的主要来源（星状细胞）后,体外实验构建抑制FN-EDA表达的星状细胞。同时利用共培养体系,检测星状细胞在敲低FN-EDA前后对内皮细胞成管以及迁移功能的影响。同时利用FN-EDA特异性阻断抗体,进一步验证FN-EDA在该过程中的作用。4.在FN-EDA抑制的小鼠模型中检测肝纤维化及肝内血管增生情况利用带有FN-EDA shRNA的腺相关病毒AAV9,构建FN-EDA敲低的小鼠肝纤维化模型。利用冰冻切片组织免疫荧光实验以及Western blot检测CD31以及α-SMA的表达水平和分布情况。研究结果1.FN-EDA在肝纤维化肝组织中的表达水平显着升高通过RT-qPCR、Western blot、免疫组化检测FN-EDA在纤维化肝组织及正常肝组织中的表达水平。结果显示,与正常肝组织相比,纤维化肝组织中的FN-EDA的表达水平显着升高,并且主要定位在纤维化肝组织的窦间隙附近。2.在肝纤维化中FN-EDA与肝内血管增生正相关通过RT-qPCR及免疫组化检测FN-EDA以及血管标志物CD31在纤维化肝组织中的mRNA水平。结果显示,在纤维化肝组织中FN-EDA与CD31的表达呈显着正相关。同时利用四氯化碳构建小鼠肝纤维化模型,每隔两周取造模小鼠的肝组织,免疫组化检测FN-EDA与CD31在肝组织中的表达情况。结果显示,随着造模时间的延长,FN-EDA与CD31的表达呈现升高趋势,且两者的变化情况存在同步性。3.星状细胞表达的FN-EDA促进了血管增生通过免疫荧光双染实验检测小鼠纤维化肝组织中FN-EDA与星状细胞标志物α-SMA、肝细胞标志物白蛋白、内皮细胞标志物CD31的共定位情况。结果显示FN-EDA的定位主要和α-SMA重合,提示FN-EDA主要来源于星状细胞。因此我们利用Transwell细胞培养板将LX-2星状细胞与HUVEC、SK-hep1以及人原代HSEC进行共培养,期间敲低LX-2中的FN-EDA或预先加入FN-EDA特异性中和抗体IST-9及3E2,然后进行成管和迁移实验。结果显示,敲低LX-2中FN-EDA或预先加入上述中和抗体显着抑制共培养条件下内皮细胞的成管长度及迁移数目。4.敲低FN-EDA抑制了小鼠模型中的肝纤维化及血管增生水平在四氯化碳诱导的C57BL/6小鼠肝纤维化造模过程中,利用带有FN-EDA shRNA的AAV9通过尾静脉注射方式敲低小鼠肝脏中的FN-EDA。通过组织免疫荧光以及Western blot检测FN-EDA的敲低情况以及相应小鼠肝脏中CD31和α-SMA的表达情况。结果显示,与对照组相比,四氯化碳诱导的小鼠纤维化肝脏中的FN-EDA,α-SMA与CD31表达水平显着提高;敲低FN-EDA的表达显着抑制了肝纤维化中α-SMA与CD31的表达。提示FN-EDA参与了肝纤维化及血管增生。第二部分肝纤维化中FN-EDA通过整合素激活VEGFR2促进血管异常增生研究目的FN-EDA在肝纤维化中促进了血管异常增生,但其具体作用机制尚不明确。本研究旨在研究FN-EDA促进了血管异常增生的具体机制,为肝纤维化抗血管增生治疗提供潜在靶点。研究方法1.探究FN-EDA对VEGFR2的调控效应运用Western blot分别检测:利用AAV-9敲低小鼠体内FN-EDA并进行肝纤维化造模后,小鼠肝脏中的VEGFR2磷酸化水平;敲低LX-2星状细胞中的FN-EDA后,共培养条件下HUVEC与HSEC的VEGFR2磷酸化水平;以及利用FN-EDA特异性中和抗体阻断后内皮细胞的VEGFR2的磷酸化水平。并进行统计分析。另外,利用VEGF与VEGFR2的特异性阻断剂ZM323881与FN-EDA共同或单独刺激HUVEC,检测内皮细胞VEGFR2磷酸化水平的变化。2.探究EDA片段自身对内皮细胞的活化作用分别利用不含有EDA片段的FN,全长的FN-EDA蛋白以及重组EDA片段蛋白刺激HUVEC以及HSEC,检测在不同刺激下两种内皮细胞的成管与迁移能力以及内皮细胞VEGFR2相关通路的变化。3.探究FN-EDA作用于内皮细胞的特异性受体利用FN-EDA与TLR4的抑制剂Restorvid以及FN-EDA与整合素的抑制剂Irigenin分别预处理后再用FN-EDA刺激HUVEC与HSEC,检测在阻断不同受体后两种内皮细胞的成管与迁移能力以及内皮细胞VEGFR2相关通路蛋白磷酸化的变化。利用不同的整合素中和抗体anti-α4、anti-α9、anti-β1和对照IgG预处理后再用重组EDA蛋白刺激HUVEC与HSEC,检测在阻断不同整合素亚基后两种内皮细胞的成管与迁移能力以及内皮细胞VEGFR2相关通路的变化。4.探究CD63是否介导了 FN-EDA刺激下整合素到VEGFR2之间的信号转导4.1检测FN-EDA是否通过反式激活作用促进了 VEGFR2的磷酸化利用FN-EDA与整合素的抑制剂Irigenin预处理后再加入FN-EDA共同刺激HUVEC,通过Western blot检测整合素下游FAK、Src的磷酸化水平变化。并利用Src磷酸化抑制剂SU6656预处理后再加入FN-EDA共同刺激HUVEC,通过Western blot检测阻断Src后FN-EDA对VEGFR2磷酸化的影响。4.2检测CD63是否参与了整合素与VEGFR2共受体的形成利用带有Flag标签的重组EDA蛋白刺激HUVEC后,用相应标签抗体进行蛋白免疫共沉淀实验。通过Western blot检测与重组EDA蛋白结合的膜蛋白复合物,观察VEGFR2、整合素β1与CD63三者的结合情况。4.3抑制或过表达CD63后检测FN-EDA对整合素下游通路及VEGFR2磷酸化水平的影响在HUVEC中利用lipo3000单独转染CD63 siRNA或先后转染CD63 siRNA和CD63过表达质粒后,用FN-EDA继续刺激6小时。随后利用Western blot检测整合素下游FAK和Src以及VEGFR2磷酸化水平的变化。4.4抑制或过表达CD63后检测FN-EDA对内皮细胞功能的影响在HUVEC中利用lipo3000单独转染CD63 siRNA或先转染CD63 siRNA,24小时后转染CD63过表达质粒,72小时后用FN-EDA继续刺激6小时,检测在敲低或敲低后过表达CD63的情况下,FN-EDA对HUVEC的成管和迁移能力的影响。4.5检测CD63在肝纤维化中的表达水平及分布情况利用免疫组化检测纤维化肝组织中CD63的表达水平以及分布情况。利用免疫荧光双染检测CD63与内皮细胞标志物CD31的共定位情况。研究结果1.FN-EDA促进了内皮细胞上VEGFR2磷酸化与正常肝组织相比,纤维化肝组织中的VEGFR2磷酸化水平显着升高;敲低小鼠肝脏中的FN-EDA显着抑制了纤维化肝组织中的VEGFR2磷酸化水平。敲低LX-2星状细胞中的FN-EDA后显着抑制共培养条件下HUVEC以及人原代HSEC上的VEGFR2磷酸化水平。FN-EDA特异性中和抗体IST-9、3E2显着抑制共培养条件下HUVEC以及人原代HSEC上的VEGFR2磷酸化水平。Western blot显示FN-EDA敲低后的LX-2星状细胞中VEGF的表达水平有一定降低。因此利用VEGF与VEGFR2的特异性阻断剂ZM323881与FN-EDA共同或单独刺激HUVEC,检测内皮细胞VEGFR2磷酸化水平的变化。结果显示,ZM323881只能轻微抑制FN-EDA促进的VEGFR2磷酸化。以上结果提示FN-EDA可以以VEGF非依赖的方式促进VEGFR2磷酸化。2.EDA片段自身可以促进内皮细胞激活以及VEGFR2磷酸化分别利用不含有EDA片段的FN,全长的FN-EDA蛋白以及重组EDA片段蛋白刺激HUVEC以及HSEC,检测在不同刺激下内皮细胞成管和迁移能力的变化以及VEGFR2相关通路蛋白的磷酸化情况。结果显示,FN-EDA以及重组EDA蛋白显着促进内皮细胞的成管长度与迁移数目,以及VEGFR2、PI3K、AKT、PLCγ和ERK的磷酸化。3.FN-EDA通过整合素受体促进VEGFR2磷酸化3.1阻断FN-EDA与整合素结合显着抑制内皮细胞激活以及VEGFR2磷酸化利用FN-EDA与整合素的抑制剂Irigenin以及与TLR4的抑制剂Restorvid预处理后再用FN-EDA刺激HUVEC与HSEC,检测两种内皮细胞的成管长度和迁移数目。结果显示,加入Irigenin显着抑制内皮细胞的成管长度和迁移数目以及VEGFR2磷酸化,而Restorvid几乎对此没有作用。上述结果提示FN-EDA主要通过整合素受体影响内皮细胞功能及VEGFR2的激活。3.2 FN-EDA主要通过整合素β1促进内皮细胞的激活分别利用不同的整合素中和抗体anti-α4、anti-α9、anti-β1和对照IgG与重组EDA蛋白共同刺激HUVEC与HSEC,检测在阻断不同整合素下两种内皮细胞的成管长度、迁移能力以及VEGFR2的磷酸化水平。结果显示,anti-α4、anti-β1显着抑制FN-EDA促进的内皮细胞成管能力,而anti-α9并无明显抑制作用;anti-α9、anti-β1 显着抑制 FN-EDA 促进的内皮细胞成管能力,而 anti-α4 并无明显抑制作用;anti-α4、anti-α9、anti-β1抑制FN-EDA促进的VEGFR2磷酸化水平,其中anti-β1作用尤为显着。以上结果提示整合素β1为FN-EDA激活内皮细胞最重要的整合素。4.FN-EDA通过整合素激活VEGFR2依赖于CD634.1 FN-EDA通过整合素下游Src反式激活作用VEGFR2磷酸化利用FN-EDA与整合素受体抑制剂Irigenin共同或单独刺激HUVEC,Western blot检测整合素下游FAK、Src的磷酸化水平。结果显示,FN-EDA可以显着促进FAK、Src的磷酸化,Irigenin抑制了该促进作用。接着利用FN-EDA与Src磷酸化阻断剂SU6656共同或单独刺激HUVEC,Western blot检测,Src以及VEGFR2的磷酸化水平。结果显示,抑制Src磷酸化后,FN-EDA促进的VEGFR2磷酸化得到抑制。4.2 CD63参与了整合素与VEGFR2共受体的形成利用带有Flag标签的重组EDA蛋白刺激HUVEC后,用相应标签抗体进行蛋白免疫共沉淀实验。Western blot检测与重组EDA蛋白结合的蛋白复合物中,相应蛋白的水平。结果显示,VEGFR2、整合素β1与CD63可以在与EDA结合的蛋白复合物中检测到,提示CD63参与了整合素β1与VEGFR2共受体的形成。4.3 CD63介导了 FN-EDA刺激下整合素到VEGFR2之间的信号转导利用CD63 siRNA和CD63过表达质粒,在HUVEC中敲低或敲低后过表达CD63,随后用FN-EDA进行刺激,Western blot检测整合素下游FAK和Src以及VEGFR2的磷酸化水平。结果显示,敲低CD63可以显着抑制FN-EDA刺激的VEGFR2磷酸化水平升高,但对FN-EDA刺激的整合素下游FAK和Src的磷酸化水平无明显抑制作用,并且敲低后再过表达CD63可以恢复VEGFR2的磷酸化水平。提示CD63介导了 FN-EDA刺激下整合素到VEGFR2的信号转导。4.4敲低CD63抑制了内皮细胞的成管和迁移功能利用CD63 siRNA和CD63过表达质粒,在HUVEC中敲低或敲低后过表达CD63,随后用FN-EDA进行刺激,进行成管和迁移实验。结果显示,敲低CD63可以显着抑制FN-EDA促进的内皮细胞的成管长度和迁移数目,再次过表达CD63上述抑制效应解除。4.5在肝纤维化中CD63高表达于肝窦内皮细胞通过免疫组化实验检测小鼠纤维化与正常肝组织中CD63的表达情况。结果显示,与正常肝组织相比,CD63的在纤维化肝组织中表达显着升高,并且主要表达在肝窦部位。利用免疫荧光双染实验检测CD63与内皮细胞标志物CD31共定位情况,结果显示CD63主要表达部位定位在内皮细胞上。第三部分FN-EDA阻断剂Irigenin抑制了小鼠肝纤维化及血管增生研究目的我们前期研究证实了 FN-EDA在肝纤维化中通过整合素激活了 VEGFR2促进了血管增生。Irigenin作为FN-EDA与整合素特异性的阻断剂,体外实验证实了其可以抑制FN-EDA促进的内皮细胞激活。本部分旨在探究FN-EDA 阻滞剂Irigenin作为潜在抗纤维化及血管增生的药物价值。研究方法1.构建阻断FN-EDA与整合素结合的小鼠肝纤维化模型通过向健康的6周龄C57BL/6小鼠腹腔注射四氯化碳的方式构建小鼠肝纤维化模型,从造模的第2周开始,每两天一次,以5mg/kg的剂量,用FN-EDA与整合素的阻断剂Irigenin对小鼠进行灌胃给药。2.Irigenin阻断FN-EDA与整合素后检测小鼠肝纤维化中血管增生的水平取造模6周的小鼠肝脏,用1%OsO4固定制片后,利用透射电子显微镜观察并记录肝窦内皮细胞窗孔结构的大小和数量以及基底膜的厚度;运用Western blot检测阻断FN-EDA与整合素小鼠肝纤维化造模后肝脏VEGFR2磷酸化水平;运用免疫组化检测肝脏组织中CD31的表达水平,并进行统计学分析。3.Irigenin阻断FN-EDA与整合素后检测小鼠肝纤维化的水平取造模6周的小鼠肝脏,石蜡包埋制片后,HE、Masson染色检测肝纤维化水平,免疫组化检测α-SMA的表达水平,并进行统计学分析。4.在不同时间点检测Irigenin阻断FN-EDA与整合素后小鼠肝纤维化及血管增生的情况利用上述造模方法,持续造模10周。每两周收集一批肝脏组织,进行Masson染色以及免疫组化检测α-SMA、CD31的表达,并进行统计学分析。研究结果1.Irigenin抑制了小鼠肝纤维化模型中的肝内血管增生收集造模6周的肝脏组织,利用透射电子显微镜拍摄肝窦内皮细胞的形态学变化。结果显示,与对照组相比,纤维化组中的肝窦内皮细胞窗孔大小和数量明显减少,基底膜显着增厚。给予Irigenin有效地减少肝窦内皮的激活,保留了窗孔结构,减少了基底膜的形成。通过Western blot检测小鼠肝脏VEGFR2磷酸化水平,进行统计分析。结果显示,给予Irigenin显着抑制了纤维化肝组织中的VEGFR2磷酸化水平。通过免疫组化检测CD31的表达,结果显示,Irigenin有效地减少了肝脏CD31的水平。2.Irigenin抑制了小鼠肝纤维化模型中的肝脏纤维化水平收集造模6周的肝脏组织进行HE染色、马松染色以及免疫组化检测α-SMA。结果显示,给予Irigenin显着抑制了纤维化肝组织中炎性细胞的浸润、纤维结缔组织沉积以及α-SMA的表达。3.Irigenin主要在肝纤维化早期抑制了肝脏血管增生以及纤维化水平从造模第二周开始,每两周收集一批上述肝脏组织进行马松染色,以及免疫组化检测α-SMA与CD31,持续10周。结果显示,Irigenin可以有效抑制小鼠体内的血管增生,但其对肝脏纤维化的抑制效果主要发生在纤维化早期,到了纤维化晚期该抑制作用出现减弱。研究结论1.通过对肝纤维化临床标本,小鼠肝纤维化模型的研究,证实了 FN-EDA在肝纤维化中促进了肝内血管的异常增生。2.在肝纤维化中,星状细胞来源的FN-EDA通过旁分泌作用促进了内皮细胞的血管增生功能。FN-EDA可以通过整合素受体,尤其是整合素β1,在CD63的介导下以VEGF非依赖的方式激活VEGFR2,促进内皮细胞活化。3.体内实验证实阻断FN-EDA和整合素结合可以有效地缓解肝纤维化血管增生的进程。
于亚男[4]（2021）在《滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用》文中认为目的:观察不同剂型的滇产铁皮石斛（Dendrobium candidum from Yunnan,DCY）对CCl4诱导肝纤维化大鼠肝组织病理学、肝功能和肝纤维化生化学指标的影响,同时通过体外观察铁皮石斛多糖（Dendrobium candidum polysaccharide,DCP）对活化肝星状细胞系LX2（Hepatic stellate cell LX2,HSC-LX2）增殖、凋亡的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法:（1）实验一:选取86只SD大鼠,将其随机分为正常组15只、模型组71只,模型组大鼠行CCl4皮下注射诱导肝纤维化,正常组给予等量生理盐水处理,每周3次,同时称体重。连续注射5周后,随机处死正常组和模型组大鼠各5只,行肝组织病理切片,镜下观察各组肝组织的病理学改变。再随机选取8只正常组大鼠为阴性对照组（NG）,剩余MG 64只大鼠随机分为DCY粉剂组（DDG）、鲜榨组（FDG）、秋水仙碱阳性对照组（CG）和模型组（MG）,其中粉剂组和鲜榨组又随机分别分为低浓度组（DGl,0.15g/m L）、中浓度组（DGm,0.45g/m L）、高浓度组（DGh,0.75g/m L）。DCY的粉剂和鲜榨组分别给药浓度由低到高分别为0.15g/m L、0.45g/m L、0.75g/m L,CG给予秋水仙碱浓度为0.002%,同时MG和NG给予等量生理盐水,各组给药剂量均为3 m L/只,每天灌胃1次。连续灌胃4周后,各组大鼠称体重,断头处死,立即在无菌条件下剖腹行腹主动脉采血,然后观察肝的色泽、质地,并取肝称肝重,计算肝脏指数（Liver index,LI）;采用HE染色、Masson染色法,镜下观察各组肝组织的病理学改变;通过免疫组织化学染色法,检测各组肝组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达情况;应用血液生化仪检测大鼠血清肝功能指标ALP、AST、GPT的改变,并采用ELISA法检测其血清肝纤维化指标HA、LN、PCIII的变化。（2）实验二:体外传代HSC-LX2,取对数生长期细胞培养,以5×104/孔的细胞密度种入6孔板,分阴性对照组和DCP组进行划痕实验,其中DCP组给予含药浓度为400ug/m L,然后检测HSC-LX2在2 h、6 h、12 h、24 h、48 h的细胞迁移率;另体外培养HSC-LX2,以1×103/孔的细胞密度种入96孔板,分为阴性对照组（NG）、25ug/m L DCP组（DCPG-25）、50ug/m L DCP组（DCPG-50）、100ug/m L DCP组（DCPG-100）、200ug/m L DCP组（DCPG-200）、400ug/m L DCP组（DCPG-400）,分别给予不同浓度的DCP处理24 h后,采用MTT法检测并计算DCP对HSC-LX2的抑制率;同上方法体外培养HSC-LX2,以5×104/孔的细胞密度接种至6孔板内,分为阴性对照组（NG）、100ug/m L DCP组（DCPG-100）、200ug/m L DCP组（DCPG-200）、400ug/m L DCP组（DCPG-400）,细胞培养12h时后,低、中、高浓度组分别加入DCP的浓度为100μg/m L、200μg/m L、400μg/m L,各孔加入同等液量1.5 m L,作用24h后,倒置显微镜下观察细胞形态并进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:（1）实验一:（1）一般情况及肝脏外观的变化:模型制备期间MG大鼠一般状态差,体重呈缓慢上升态势,两种剂型的DCY给药干预后,DDG、FDG、CG三组大鼠一般状态好转。NG大鼠肝脏多分为6叶,呈棕红色,表面滑润,质地柔软;MG大鼠肝脏则偏暗红色,肝表面可见弥漫性小结节,质地偏韧;DDG、FDG、CG三组大鼠肝脏质地较韧并有颗粒感,但与MG比较均有较明显改善。（2）LI变化:与NG比较,MG大鼠LI明显升高（P<0.01）;CG、DDG、FDG的LI较NG偏高,但分别与NG比较差异无统计学意义（P>0.05）;与MG比较,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh、CG的LI均明显降低（P<0.05或P<0.01）;与CG比较,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组的LI偏高,但差异无统计学意义（P>0.05）;与DDGh比较,DDGl的LI降低不明显,有统计学意义（P<0.05）;与FDGh比较,FDGl和FDGm两组的LI变化无统计学意义（P>0.05）。（3）肝组织病理学改变:HE染色显示,NG大鼠肝脏细胞形态正常,核圆居中,肝细胞索呈放射状排列紧密;MG大鼠肝脏细胞排列紊乱,细胞内广泛形成脂肪空泡,可见大量假小叶形成,汇管区扩大,有炎细胞浸润;CG、DDG、FDG大鼠的肝损伤均有明显改善。Masson染色显示,NG大鼠肝组织中的肝细胞形态正常,肝细胞索排列规则,细胞内未见明显脂肪空泡,汇管区无明显胶原纤维沉积;MG大鼠肝细胞索排列紊乱,可见大量假小叶形成,汇管区有大量胶原纤维沉积;CG、DDG、FDG大鼠的肝损伤明显缓解,假小叶形成减少,汇管区纤维化程度降低。随着DCY各剂型给药浓度的增高,大鼠肝组织的病理变化改善更加明显,可能存在剂量依赖性。（4）免疫组织化学染色结果:与NG相比,MG、DDGl和FDGl大鼠肝组织中TGF-β1的表达明显增多（P<0.01）;与MG相比,DDGm、DDGh、FDGm和FDGh各组的TGF-β1表达明显降低（P<0.01）;与CG比,DDGl、FDGl、DDGm和FDGm各组的TGF-β1表达差异均十分显着（P<0.01）;DDGl、DDGm与DDGh相比,FDGl、FDGm与FDGh相比,TGF-β1的表达差异均有统计学意义（P<0.01）。结果表明,DCY能降低大鼠肝组织TGF-β1的表达水平,且可能有剂量依赖性。（5）肝功能血清生化指标变化:与NG相比,MG大鼠血清ALP、AST、GPT的表达明显升高（P<0.01）;与MG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达均降低（P<0.01）;与CG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达均无统计学意义（P>0.05）;DDGl、DDGm与DDGh相比,FDGl、FDGm和FDGh相比,各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。（6）肝纤维化血清生化指标变化:与NG相比,MG大鼠血清HA、LN、PC-III的表达明显升高（P<0.01）;与MG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清HA、LN、PC-III的表达均降低（P<0.05）;与CG相比,DDGm、DDGh、FDGm和FDGh各组血清HA、LN、PC-III的表达差异无统计学意义（P>0.05）,而DDGl和FDGl均有显着统计学意义（P<0.01和P<0.05）。但值得注意的是,在不同剂量药物干扰组进行组内比较时,仅LN的表达可能存在剂量依赖性,即DDGl与DDGh相比,FDGl与FDGh相比,LN的表达差异均十分显着（P<0.01）。（2）实验二:（1）一般情况:传代的HSC-LX2贴壁后,光镜下显示细胞生长旺盛,胞质透亮,细胞伸展呈星状,核仁清晰,细胞碎片少。（2）划痕实验:给药组细胞迁移率显着降低,表明DCP可通过抑制HSC-LX2的迁移来起到抗肝纤维化的作用。（3）MTT法检测结果:随着DCP给药浓度的增高,细胞增殖抑制率逐渐增高,各浓度给药组分别与NG比较,差异显着有统计学意义（P<0.01）;DCPG-25、DCPG-50、DCPG-100、DCPG-200和DCPG-400各组进行两两比较,HSC-LX2的增殖抑制率均显着较低,差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明,DCP可抑制HSC-LX2的增殖且呈剂量依赖性。（4）流式细胞术结果:随着给药浓度增加,HSC-LX2的生长密度逐渐降低,细胞凋亡率逐渐升高,并与给药浓度呈正相关。各浓度给药组分别与NG比较,差异显着有统计学意义（P<0.01）;与DCPG-400比较,DCPG-100和DCPG-200凋亡率较低,差异显着,有统计学意义（P<0.01）,表明DCP能显着促进HSC-LX2凋亡且呈剂量依赖性。结论:两种剂型DCY均可改善肝纤维化大鼠的一般状态、肝功能、肝纤维化生化指标以及肝组织的病理变化,并降低肝组织中TGF-β1的表达;DCP能抑制活化的HSC-LX2增殖并促进其凋亡;随着给药浓度的升高,体内外检测指标大部分得到明显改善。因此,铁皮石斛具有抗肝纤维化作用,可能存在剂量依赖性。
曹献[5]（2021）在《肝宁方对小鼠肝癌癌前病变炎症微环境影响的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:肝宁方在实际临床应用中,对肝病患者具有良好的治疗效果,具有研究价值和意义,本研究目的是通过研究肝宁方对二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine,DEN）联合四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）诱导建立原发性肝癌癌前病变小鼠模型炎症微环境的影响,以期阐明肝宁方对肝癌癌前病变的防治作用机制。方法:60只周龄6-8周,重量为（18±22）g的KM雄性小鼠,适应性饲养一周后,随机分为四组（15只）:对照组、模型组、肝宁方组、护肝片组。除对照组,其余各组进行CCl4溶液灌胃和DEN腹腔注射联合造模,同时每天进行药物灌胃。于16周末（肝癌癌前病变期）将小鼠进行禁食取材,眼眶采血,摘取脾脏、肝脏。记录各组间肝的外观、癌前结节的数目及大小;称量肝脏、脾脏、体重;检测小鼠血清肝功能ALT、AST、GGT、TBIL水平;肝脏病理检查;酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测血清中小鼠血清IL-6、IL-1β、AFP、TNF-α、GPC-3、TSGF和Ki67含量;蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测TLR4、NF-κB蛋白表达。结果:1.一般情况:与对照组相比,模型组、肝宁方组、护肝片组在造模第4周开始出现进食量减少,精神萎靡,掉毛,急躁易怒等表现,第8周部分出现腹水,尾部出现皮下出血点,行动迟缓。与模型组相比,肝宁方组和护肝片组程度均好于模型组,一般状态好。2.体重指数:与对照组相比,模型组、肝宁方组、护肝片组体重显着下降（P<0.01）;与模型组相比,肝宁方组、护肝片组体重显着增加（P<0.05）;肝脏指数、脾脏指数:与对照组相比,模型组、肝宁方组、护肝片组肝脏指数和脾脏指数显着增加（P<0.01）,与模型组相比,肝宁方组肝脏指数和脾脏指数显着下降（P<0.01）,护肝片组肝脏指数和脾脏指数下降（P<0.05）。3.病理:小鼠肝脏形态,模型组小鼠肝脏组织质地粗糙,色泽暗沉,表面密布大小不等白色增生结节（0.2-3cm）肉眼可见,与模型组相比,肝宁方组和护肝片组,结节分布密度低,直径小,肝脏色泽较好。肝组织HE染色,模型组小鼠肝细胞出现水肿、坏死,成巢状,细胞核出现核异型性（核大、双核、多核）,细胞密度增高,汇管区间质增生,纤维组织增多;结节包膜明显,与周边肝脏组织界限清楚,肝小梁结构不规则。与模型组相比,肝宁方组细胞变性坏死程度轻,纤维组织增生程度较轻,细胞较少出现核异型,护肝片介于两者间。4.肝功能:与对照组相比,模型组、肝宁方组、护肝片组肝功能ALT、AST、GGT、TBIL显着升高（P<0.01）,与模模型组相比,肝宁方组肝功能ALT、AST、GGT、TBIL显着降低（P<0.01）,护肝片组肝功能ALT、AST、GGT、TBIL降低（P<0.05）。5.炎症因子:与对照组相比模型组、肝宁方组、护肝片组IL-6、IL-1β、TNF-α显着升高（P<0.01）,与模型组相比肝宁方组IL-6、IL-1β、TNF-α水平显着降低（P<0.01）,护肝片组IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低（P<0.05）。6.肿瘤相关因子:与对照组相比模型组、肝宁方组、护肝片组AFP、GPC-3、TSGF和Ki67显着增高（P<0.01）,与模型组相比肝宁方组、护肝片组AFP、GPC-3、TSGF和Ki67显着降低（P<0.05）。7.与对照组相比模型组、肝宁方组、护肝片组TLR4、NF-κB蛋白表达显着增加（P<0.01）,与模型组相比,肝宁方和护肝片组TLR4、NF-κB蛋白表达显着下降（P<0.05）。结论:1.肝宁方对DEN诱导的小鼠肝癌癌前病变有抑制作用2.肝宁方可抑制TLR4、NF-κB的表达,改善肝癌癌前病变的炎症微环境,其可能通过TLR4/NF-KB信号通路发生作用。
吕艳杭[6]（2021）在《基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用》文中研究指明目的:观察柔肝化纤颗粒对四氯化碳（CCl4）复合因素诱导的肝纤维化大鼠模型的干预作用,从PKCα/Nrf2/ROS信号通路方面探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的作用机制。方法:将48只Wistar雄性大鼠随机分为正常组、病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗组,每组12只。除正常组外,其余每组大鼠采用皮下注射40%CCl4（第一次使用5ml/kg体重,以后每隔3天以每3ml/kg体重,每周2次,共8周）皮下注射,联合高脂低蛋白食物（以玉米面为饲料,实验第一、二周加用0.5%胆固醇、20%猪油）,为了防止肝纤维化自然修复对实验结果造成的影响,除正常组外,其余各组仍每周腹腔注射一次40%CCl4油剂3ml/kg体重/每次;正常组正常饲养,同时采用同体积花生油皮下注射8周后灌胃给予同体积的生理盐水,肝纤维化模型组造模成功病理模型组于4mg/kg生理盐水灌胃,秋水仙碱组于每日0.11mg/kg体重给予秋水仙碱进行灌胃;柔肝化纤颗粒剂量组予柔肝化纤颗粒溶液4mg/kg灌胃,每周3次,共8周,连续8周取材。各组分别于用药8周后,禁食12h,经1%戊巴比妥麻醉,股静脉采血后处死,开腹剖取肝脏,通过HE染色、Masson染色观察肝脏情况,采用ELLSA检测活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）、超氧化歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量;采用PCR、Western Blot检测平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin,α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-Cadherin,E-Cad）、I型胶原蛋白酶（Collagen I,Col I）、III型胶原蛋白酶（Collagen III,Col III）、血红素氧合酶1（Heme Oxygenase-1,HO-1）、醌氧化还原酶1（NAD（P）H:Quinone dehydrogenase1,NQO1）、蛋白激酶C（Protein Kinase C,PKCα）、核因子E2相关因子（NF-E2-related factor 2,Nrf2）m RNA及蛋白表达。结果:1.柔肝化纤颗粒对肝组织的影响正常组大鼠肝组织的肝小叶结构完整,轮廓清晰,肝组织致密,无假小叶结节形成,汇管区及其周围未见小胆管及纤维组织增生,胞核位于中央。病理模型组肝小叶结构被破坏,甚至消失,结节形成,肝索排列紊乱,汇管区大量增生的纤维,呈条索状,肝细胞脂肪变性,胞浆出现许多大小不等的空泡。秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组均存在肝小叶结构不清晰,汇管区及其周围小胆管可见纤维组织增生,肝细胞脂肪变性,胞浆出现许多大小不等的空泡,但程度均较病理模型组有明显减轻。2.柔肝化纤颗粒对SOD、GSH-Px、MDA含量的影响1与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的MDA含2量显着升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组MDA含量均有不同程度降低（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的SOD、GSH-Px显着降低（P<0.05）;与模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组明显升高（P<0.05）。3.柔肝化纤颗粒对血清ROS的影响与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的ROS含量明显升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的ROS含量均降低（P<0.05）。4.柔肝化纤颗粒对α-SMA m RNA、E-Cadherin m RNA、PKCαm RNA、Nrf2mRNA、HO-1 m RNA、NQO1 m RNA、Collagen I m RNA、Collagen III m RNA表达的影响1与正常组相比,病理模型组的PKCαm RNA相对表达量下降（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的PKCαm RNA相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCαm RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。2与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的HO-1m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的HO-1 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。4与正常组相比,病理模型组的NQO1 m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。5与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA m RNA相对表达量升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。6与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin m RNA相对表达量升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。?与正常组相比,病理模型组的Collagen I m RNA相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化颗粒组Collagen I m RNA相对表达量显着下降（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen I m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。7与正常组相比,病理模型组Collagen III m RNA相对表达量显着升高（P<0.05）,柔肝化颗粒组Collagen III m RNA相对表达量显着下降（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen III m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。5.柔肝化纤颗粒对α-SMA、E-Cadherin、HO-1、NQO1、PKCα、Nrf2、Collagen I、Collagen III蛋白表达的影响1与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCα蛋白表达下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCα蛋白表达明显升高（P<0.05）。2与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组Nrf2蛋白表达下降（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组Nrf2蛋白表达无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2蛋白表达明显升高（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、柔肝化纤颗粒组的HO-1蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组HO-1蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组的HO-1蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒升高不明显（P>0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1蛋白相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）。4与正常组相比,病理模型组的α-SMA蛋白相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。5与正常组相比,病理模型组的E-Cadherin蛋白相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。6与正常组相比,病理模型组的Collagen I蛋白相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组的Collagen I蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。7与正常组相比,病理模型组的Collagen III蛋白相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组的Collagen I蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen III蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。结论:柔肝化纤颗粒可改善CCl4诱导的大鼠的肝纤维化程度,显着降低血清中ROS、MDA含量,升高血清中SOD、GSH-Px的含量,提示柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠具有一定的抗氧化应激作用。柔肝化纤颗粒通过对PKCα的激活,促进Nrf2发生核转移,抑制ROS信号通路的表达以抗氧化应激反应,下调α-SMA、E-cadherin的表达以抑制HSCs活化,减少Collagen I、Collagen III分泌,减少ECM在肝脏中的沉积,从而实现逆转肝纤维化进程。
莫婵[7]（2021）在《保肝宁和人参皂苷Rg1对肝纤维化小鼠IDO1及树突状细胞的作用机制研究》文中认为背景与目的:肝纤维化是目前难治性疾病之一,加快对其病理机制和创新药物的研发刻不容缓。前期研究表明肝纤维化的发生与肝脏免疫微环境的改变密切相关。保肝宁从清热祛湿解毒、活血化瘀软坚、益气疏肝健脾治疗临床上肝纤维化患者取得良好疗效。本研究旨在阐明保肝宁和人参皂苷Rg1是否可通过干预肝纤维化小鼠免疫微环境中的免疫调节因子IDO1及与免疫应答相关的树突状细胞,从而改善肝纤维化的机制研究。方法:利用CCL4及BDL诱导建立肝纤维化模型,先在野生型肝纤维化小鼠中确定IDO1与DCs参与肝纤维化的发生;体外模型检测IDO1与DCs表型成熟的相关性;进一步在体内观察IDO1基因缺失或过表达状态对DCs表型成熟的改变和对肝纤维化进程的影响。在此基础上,探讨IDO1与DCs是否为保肝宁抗肝纤维化的主要靶标及其分子机制并对保肝宁中所含6种化学成分进行检测,最后在体内探索保肝宁中所含化学成分-人参皂苷Rg1是否可通过参与IDO1与DCs表型的调控发挥抗肝纤维化作用。本研究结果采用SPSS 22.0软件分析数据、Graph Pad Prism7.0作图,以均数±标准误（X±SEM）表示。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.CCL4及 BDL诱导的野生型肝纤维化小鼠肝脏中IDO1表达水平显着升高且伴随着DCs成熟表型的降低以及CD3+CD4+T细胞比例和CD4+/CD8a+比值的降低。2.在LPS干预下,IDO1+/+BMDCs细胞的成熟表型较IDO1-/-BMDCs明显降低;IDO1抑制剂的浓度与IDO1+/+BMDCs细胞中CD11C+CD80+、CD11C+CD86+、CD11C+CD40+、CD11C+MHCⅡ+标记的细胞比例值之间存在正相关关系,且相关系数较高。3.IDO1基因缺失的肝纤维化小鼠肝脏中DCs表型成熟度增加,HSCs的活化减少,较野生型肝纤维化小鼠的肝纤维化程度明显减轻;而肝脏特异性过表达IDO1抑制了肝纤维化小鼠肝脏中DCs的表型成熟,加剧了胶原纤维的沉积,使CCL4及BDL诱导的肝纤维化明显加重。4.保肝宁中以下6种化学成分的含量分别为:丹酚酸B（2012.820ng/mL）、隐丹参酮（1932.013 ng/mL）、人参皂苷 Rg1（38487.28 ng/mL）、人参皂苷 Rb1（176646.543 ng/mL）、黄芪甲苷（1239.123 ng/mL）、毛蕊异黄酮（3116.211 ng/mL）。5.保肝宁和人参皂苷Rg1均可通过有效降低肝纤维化小鼠肝脏中IDO1表达水平继而促进DCs的成熟使DCs功能恢复发挥护肝、抗肝纤维化作用。结论:1.IDO1与DCs在小鼠肝纤维化中均有明显改变,同时IDO1的表达水平在DCs的成熟中发挥着重要作用。2.IDO1基因缺失能够减轻CCL4及BDL所诱导小鼠的肝纤维化,肝脏特异性过表达IDO1会加重CCL4及BDL所诱导小鼠的肝纤维化,可能是由于IDO1的表达水平影响了肝纤维化小鼠DCs免疫表型的成熟及HSCs的活化。3.保肝宁和人参皂苷Rg1均可通过参与IDO1对DCs表型的调控缓解肝纤维化。
张嘉鑫[8]（2021）在《基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究》文中认为背景:肝硬化（Hepatic cirrhosis,HC）为肝脏受各种损伤因素侵袭,出现以肝纤维化、假小叶为特点的疾病,由乙肝病毒、丙肝病毒、酒精等一种或多种病因引起。5年生存率为14-35%,已成为全球成人死亡率第14高的病因。目前的治疗主要集中在病因与并发症防治方面,肝硬化本身能否被逆转一直存在争议。国内外学者认为,肝硬化实现逆转必然涉及以下三方面环节:细胞外基质（extracellular matrix,ECM）降解,肝细胞再生及肝小叶结构重建。其中,ECM降解为重要前提。近年研究提示,弹性蛋白合成、降解及其交联阻碍了 ECM降解,进而影响逆转过程。弹性蛋白是由肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）分泌的,为ECM重要组分。其在正常肝脏中也存在,但含量极低,在肝硬化阶段,沉积迅速。目前,中药单体、复方研究多集中于抗纤维化领域,对早期肝硬化关注较少,需要更多基础研究及高质量的临床试验进一步证实中药疗效优势,并对其相关机制进行深入挖掘。中药复方具有多层次、多靶点的先天优势,但现有研究多聚焦于抑制HSCs活化、促进胶原降解或抗肝窦毛细血管化等方向,尚未对中医药潜在的调控弹性蛋白合成及降解的相关机制进行探索。目的:基于益肝消积方对弹性蛋白合成及降解的调控作用,探索在四氯化碳（CCl4）诱导的肝脏发生损伤形成早期肝硬化病变后,该复方干预早期肝硬化的效果及其可能的机制,以期为益肝消积方进一步成果转化提供理论支撑,同时亦为其它防治早期肝硬化药物的研发提供方向。方法:通过给予SPF级雄性Sprague Dawley大鼠（200±10g）1ml/kg腹腔内注射50%CCl4和橄榄油混合液,2次/周,共6周,构建早期肝硬化模型。7周始,予益肝消积方、阳性对照药（安络化纤丸）,1ml/100g剂量灌胃。空白对照、模型对照组予等剂量蒸馏水灌胃,日1次,持续6周。用生化法检测ALT、AST评估肝功能;行组织病理学染色（HE染色、天狼猩红染色及Masson染色）评估早期肝硬化病变进展、检测肝脏胶原沉积;用弹性纤维染色评估肝脏的弹性蛋白沉积;免疫组织化学染色、免疫荧光染色观察肝组织中TGF-β1、CD68、CD80、CD163和α-SMA表达情况;用蛋白免疫印迹（Western blot,WB）分析以及实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-βR-Ⅱ、Smad2/3、P-Smad2/3、Smad4、Smad7、Sp1、TNF-α、Ras、MEK1/2、ERK1/2、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1的蛋白水平及bFGF、弹性蛋白（Elastin）的mRNA水平变化,进而对益肝消积方干预早期肝硬化的作用及其相关机制进行初步探索。结果:1.模型制备:予50%CCl4/橄榄油混合液,腹腔注射,1ml/kg,2次/周。造模6周后,组织病理染色发现,模型组大鼠肝脏出现大量纤维增生,汇管区增宽,形成假小叶,说明模型制备成功。2.一般情况:益肝消积方治疗组及阳性对照安络化纤丸组大鼠毛色、精神状态、进食量等方面均优于模型组。体重上,治疗组大鼠体重均明显高于模型组（P<0.01）;体重增长趋势上,益肝消积方组优于安络化纤丸组。3.肝功能:与正常组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST含量升高显着（P<0.01）。益肝消积方和阳性对照组（安络化纤丸）较模型组显着下降（P<0.05或P<0.01）。与安络化纤丸相比,益肝消积方在改善ALT方面疗效较优。4.肝组织病理学表现:从肝脏外观看,模型组大鼠颜色变暗,体积缩小,表面粗糙,边缘较钝,质地较硬韧,部分肝脏在剥离时与胸膜腔其他组织相粘连,难以剥离。益肝消积方和安络化纤丸治疗后的大鼠肝体积缩小不明显,表面粗糙不明显,质地较柔韧,未发现与胸腔其他组织粘连,较易剥离。此外,通过组织学染色（HE染色、Masson染色、天狼猩红染色）发现,与模型组大鼠相比,益肝消积方和安络化纤丸治疗后的大鼠肝脏炎性细胞浸润程度减轻,病变范围减小,汇管区及周围纤维增生程度减轻,假小叶数量明显减少,且胶原纤维等细胞外基质成分沉积减少（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方抑制胶原沉积的效果较好。说明益肝消积方能够有效抑制炎细胞浸润,减少胶原纤维过度沉积,从而发挥干预早期肝硬化的作用。5.弹性纤维染色结果:为观测弹性纤维变化,我们对其进行了特殊染色。实验发现,在早期肝硬化阶段,模型组弹性纤维含量增多迅速,显着高于空白对照组（P<0.01）。益肝消积方、安络化纤丸治疗组与模型组相比,弹性纤维含量显着减少（P<0.01）,且益肝消积方效果较明显。6.免疫组化、免疫荧光染色结果:与空白对照组相比,模型组TGF-β1、α-SMA、CD68、CD80、CD163阳性表达区域明显增多。与模型组相比,益肝消积方、安络化纤丸组阳性区域明显减少。7.qRT-PCR结果:模型组与空白对照组相比,ElastinmRNA表达量显着升高（P<0.01）。与模型组相比,益肝消积方治疗组ElastinmRNA表达量显着下降（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方减少ElastinmRNA表达更显着;模型组bFGF mRNA较正常组升高显着（P<0.01）。对比模型组,益肝消积方治疗组bFGF mRNA表达量显着下降（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方下调bFGF mRNA表达更显着。8.Western blot 结果:与空白对照组相比,模型组 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-β RⅡ、P-Smad2/3、Smad4、Ras、Sp1、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1 蛋白表达含量明显升高（P<0.05 或 P<0.01）,Smad7、TNF-α、MEK1/2 蛋白表达含量明显下降（P<0.05或P<0.01）;与模型组相比,益肝消积方治疗组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-β RⅡ、P-Smad2/3、Smad4、Ras、Sp1、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1 蛋白表达含量明显降低（P<0.05 或 P<0.01）,Smad7、TNF-α、MEK1/2蛋白表达含量明显上升（P<0.05或P<0.01）。结论:1.予50%CCl4/橄榄油混合液,腹腔注射,1ml/kg,2次/周,共6周,可成功制备早期肝硬化大鼠模型。予益肝消积方干预后,可改善早期肝硬化大鼠体重、肝功能;有效抑制早期肝硬化大鼠肝脏炎性细胞浸润,肝细胞变性、坏死,胶原纤维（Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ）、弹性纤维等ECM沉积,改善病变程度。2.益肝消积方可抑制α-SMA表达,下调CD68、CD80、CD163表达量,抑制CCL2-CCR2通路,进而具有抑制HSCs激活,抑制单核/巨噬细胞浸润,及向M2型巨噬细胞极化,阻止单核/巨噬细胞向损伤肝组织部位迁移,减少Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和Elastin含量,发挥干预早期肝硬化的作用。3.益肝消积方能通过 TGF-β1/Smads、TGF-β1/Ras/ERK 和 bFGF、TNF-α/MEK/ERK信号转导通路抑制胶原纤维、弹性纤维等ECM合成,发挥干预早期肝硬化的作用。4.益肝消积方可通过调节MMPs/TIMPs酶系,促进胶原纤维、弹性纤维等ECM降解,达到干预早期肝硬化的作用。
徐蒙[9]（2021）在《LECT2/Tie1信号调控肝纤维化进程的作用和机制研究》文中研究说明肝纤维化是由病毒感染、先天性代谢缺陷、化学毒物以及自身免疫异常等原因引起慢性肝损伤的一种共同病理表现,也是机体对慢性肝损伤的一种修复反应。目前还没有被批准应用于临床的特效药物,所以对于研究其发病机制及寻找潜在的干预靶点变得极为迫切和重要。肝血窦毛细血管化与血管新生在肝纤维化进程中扮演着重要的作用,但是其机制尚未完全阐明清楚。本课题以实验室新发现的LECT2/Tie1信号通路为基础,探讨了其在调控肝血窦毛细血管化与血管新生及肝纤维化进程的作用和机制,为肝纤维化治疗提供了新的策略和理论基础。研究首先发现,白细胞趋化因子2（Leukocyte cell-derived chemotaxin 2,LECT2）在代谢相关脂肪性肝病（Metabolic associated fatty liver disease,MAFLD）病人血清及肝组织样本中表达上调,通过构建多种小鼠慢性肝损伤模型,观察到在野生型（WT）小鼠肝脏出现纤维化损伤时LECT2表达也会上调,而全身性Lect2基因敲除（Lect2-KO）小鼠肝纤维化症状则显着减轻,表明LECT2具有促进肝脏纤维化的作用。利用免疫荧光共定位技术及原代细胞体外实验发现,纤维化时主要表达LECT2的细胞为肝细胞和血管内皮细胞。利用CD31对纤维化肝组织染色发现LECT2在体内对肝内血管具有明显的调控作用:减少汇管区/损伤区周围新生血管数量,促进肝血窦毛细血管化。与野生型（WT）小鼠相比,在Lect2-KO小鼠肝纤维化的汇管区/损伤区可见更多的CD31和VEGFR2双阳性血管。体外细胞实验发现,重组人LECT2蛋白可抑制EA.hy926细胞及原代肝血窦内皮细胞迁移以及成管能力。进一步机制研究发现,LECT2与血管内皮细胞表面受体 Tie1（Tyrosine kinase with immunoglobulin like and EGF like domains 1）的胞外Ig3结构域直接结合,并依赖结合发挥调控血管内皮细胞功能的作用。通过表面等离子体共振（SPR）、交联质谱（XL-MS）和免疫共沉淀（Co-IP）等一系列的实验相互结合,我们进一步找到了 LECT2与Tie1相互作用的关键氨基酸位点,这为后续将抑制两者结合作为靶点干预肝脏纤维化的研究提供了可行性。通过转录组测序比较WT与Lect2-KO小鼠纤维化肝脏中基因表达量的差异,发现PPARγ/MMP信号通路发生了显着变化,LECT2/Tie1信号可以激活PPARγ/MMP信号通路,促进TGF-β1等因子分泌继而活化肝星状细胞,促进胞外基质蛋白分泌,同时下调基质金属蛋白酶MMPs,使得VE-cadherin及胞外基质降解减少,增强内皮细胞之间的连接并增加了胞外基质堆积,抑制血管内皮细胞迁移和血管新生并促进肝血窦毛细血管化,最终促进肝纤维化进程。我们的研究从发现白细胞趋化因子LECT2在肝脏纤维化进展中的作用入手,找到了 LECT2行使功能的关键受体Tie1,明确了两者相互作用的关键氨基酸位点,探讨了 LECT2/Tie1信号在肝脏纤维化中发挥作用的下游机制,为靶向LECT1/Tie1信号治疗肝纤维化提供了坚实的理论和实验基础。
成茂源[10]（2020）在《基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响》文中指出目的:观察加减三甲散干预模型大鼠肝纤维化的效果以及对WNT/β-catenin通路的影响,并从lnc RNA和m RNA角度揭示其作用机制,丰富“主客交”学说的现代生物学内涵。方法:1.实验一:SPF级SD雄性大鼠40只,随机分成空白对照组、模型组、1号方组（加减三甲散1号方组）、2号方组（加减三甲散2号方组）、阳性对照组（秋水仙碱组）。常规喂养7d,模型组、1号方组、2号方组、阳性对照组采用皮下注射四氯化碳油剂的方法制造肝纤维化大鼠模型。造模同时各组均灌胃干预,空白对照组、模型组予以超纯水灌胃,1号方组予以加减三甲散全方灌胃,2号方组以去穿山甲的加减三甲散2号方灌胃,阳性对照组予以秋水仙碱液灌胃。56d后麻醉大鼠,取心尖血和肝脏组织。HE染色观察病理形态,检测血清ALT、AST。Western blot法检测空白对照组、模型组、1号方组、阳性对照组WNT2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量。2.实验二:SPF级SD雄性大鼠40只,随机分成空白对照组、模型组、加减三甲散组、阳性对照组（秋水仙碱组）。常规喂养7d,模型组、加减三甲散组、阳性对照组采用皮下注射四氯化碳油的方式剂制造肝纤维化大鼠模型。造模同时各组均灌胃干预,空白对照组、模型组予以超纯水灌胃,加减三甲散组予以加减三甲散全方灌胃,阳性对照组予以秋水仙碱液灌胃。56d后麻醉大鼠,取心尖血和肝脏组织。HE和MASSON染色观察病理形态,ELISA法检测血清HA、LN、PCⅢ、CIV浓度。高通量二代测序法检测空白对照组、模型组、加减三甲散组大鼠肝组织lnc RNA和m RNA表达谱。结果:1.病理切片:HE染色光镜下观察,实验一中,与空白对照组比较,模型组大鼠、1号方组、2号方组、阳性对照组大鼠肝脏组织纤维化程度明显增大（P﹤0.01）;与模型组比较,1号方组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度减轻,差异显着（P﹤0.01）,2号方组无明显差异（P﹥0.05）;与1号方组比较,2号方组大鼠肝纤维化程度明显加重（P﹤0.01）。实验二中,与空白对照组相比,模型组、加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝脏组织纤维化程度明显增大（P﹤0.01）;与模型组相比,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度减轻,差异显着（P﹤0.01）;加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度无明显差异,无统计学意义。MASSON染色光镜下观察,实验二中,与空白对照组比较,模型组大鼠肝纤维化程度明显增大（P﹤0.01）,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度增大（P﹤0.05）;与模型组比较,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝脏组织肝纤维化程度明显减轻（P﹤0.01）;与加减三甲散组比较,阳性对照组大鼠肝脏组织肝纤维化程度相当,无统计学意义（P﹥0.05）。2.肝功能指标:实验一中,与空白对照组相比,模型组、1号方组、2号方组大鼠血清中ALT、AST水平显着升高（P﹤0.01）,阳性对照组大鼠ALT、AST水平相当,无统计学意义（P﹥0.05）;与模型组相比,1号方组、2号方组、阳性对照组大鼠ALT水平显着降低（P﹤0.01）;与模型组相比,1号方组、2号方组大鼠AST水平降低（P﹤0.05）,阳性对照组大鼠AST水平显着降低（P﹤0.01）;与1号方组相比,阳性对照组大鼠血清中AST水平显着降低（P﹤0.01）。3.信号通路指标:实验一中,与空白对照组比较,模型组大鼠肝脏组织WNT2、β-catenin蛋白表达量降低（P﹤0.05）,GSK-3β蛋白表达量显着降低（P﹤0.01）;与模型组比较,1号方组、阳性对照组大鼠肝脏组织WNT2、β-catenin、GSK-3β蛋白含量无明显变化,无统计学意义（P﹥0.05）。4.肝纤维化指标:实验二中,与空白对照组相比,模型组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ浓度均显着增大（P﹤0.01）。与模型组相比,加减三甲散组大鼠血清中HA浓度增大,差异明显（P﹤0.05）。与模型组相比,加减三甲散组大鼠血清中LN、PCⅢ、CⅣ浓度减小（P﹤0.05）。加减三甲散组与阳性对照组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ浓度比较,无统计学意义（P﹥0.05）。5.测序结果:实验二中,预测出新的lncRNA1976条。空白对照组与模型组差异Inc RNA基因共340个（187个上调,153个下调）。空白对照组与加减三甲散组差异Inc RNA基因251个（上调139个,下调112个）。模型组与加减三甲散组差异Inc RNA基因93个（上调48个,45下调）。差异lnc RNA靶基因共同功能主要为:自然杀伤细胞介导免疫,自然杀伤细胞介导的细胞毒性调控等。空白对照组与模型组差异m RNA基因1635个（上调1451个,下调184个）,模型组与加减三甲散组得到差异m RNA基因80个（上调39个,下调41个）,空白对照组与加减三甲散组得到差异m RNA基因80个（上调39个,下调41个）。空白对照组、加减三甲散组和模型组m RNA差异基因共同途径为:PPAR信号通路。结论:1.采用四氯化碳诱导法可成功复制大鼠肝纤维化模型。2.加减三甲散1号方减轻模型大鼠肝纤维化程度的效果好于去除穿山甲的加减三甲散2号方。3.加减三甲散（加减三甲散1号方）改善模型大鼠肝纤维化程度不经过WNT/β-catenin通路作用。4.加减三甲散改变肝纤维化模型大鼠lnc RNA和m RNA的表达谱,这可能是加减三甲散改善模型大鼠肝纤维化程度的部分作用机制。
二、四氯化碳诱导鼠肝组织血管病变的动态观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、四氯化碳诱导鼠肝组织血管病变的动态观察（论文提纲范文）
（1）基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药学治疗肝纤维化的研究进展 |
| 综述二 现代医学对肝纤维化的研究进展 |
| 综述三 益气活血法对肝窦内皮细胞细胞生物学影响的研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于益气活血法治疗肝纤维化临床疗效的Meta分析 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 芪术颗粒对肝纤维化模型大鼠的影响研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 结论 |
| 实验二 大鼠肝窦内皮细胞的原代分离与提取 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 芪术颗粒含药血清对肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合成酶、一氧化氮的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 芪术颗粒含药血清对肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 创新性 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
| 中医药科技查新报告书 |
（2）柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 中西医治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第一节 西医诊断和治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二节 中医药治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二章 柴芪益肝方治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎肝纤维化的临床回顾性研究 |
| 前言 |
| 第一节 临床资料 |
| 第二节 分组与治疗 |
| 第三节 结果分析 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 第三章 基于网络药理学探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的作用机制 |
| 前言 |
| 第一节 资料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论与小结 |
| 第四章 柴芪益肝方对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 材料与研究方法 |
| 第二节 指标检测 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）纤维连接蛋白额外结构域A促进肝纤维化及血管异常增生的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 第一部分 星状细胞上的FN-EDA促进了肝纤维化及血管异常增生 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 肝纤维化中FN-EDA通过整合素激活VEGFR2促进血管异常增生 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 FN-EDA阻断剂Irigenin抑制了小鼠肝纤维化及血管增生 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 血管异常增生在肝纤维化发生、发展和治疗中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 1 |
| 外文论文 2 |
（4）滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英对照表 |
| 前言 |
| 实验技术路线 |
| 第一章 不同剂型铁皮石斛对CCl_4诱导肝纤维化大鼠的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 药物与试剂 |
| 1.1.3 主要仪器及器械 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 分组与模型制备 |
| 1.2.2 大鼠死亡率 |
| 1.2.3 标本采集和留取 |
| 1.2.4 指标检测 |
| 1.2.5 统计学处理 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 大鼠肝纤维化模型建立的分析 |
| 1.3.2 两种剂型药物干扰后肝脏指数的变化 |
| 1.3.3 肝组织形态学变化 |
| 1.3.4 TGF-β1表达水平 |
| 1.3.5 大鼠肝功能和肝纤维指标的变化 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 CCl_4诱导的肝纤维化模型可成功复制 |
| 1.4.2 铁皮石斛干预SD大鼠肝纤维化的疗效分析 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 铁皮石斛多糖对活化肝星状细胞LX2的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞种类 |
| 2.1.2 药物与试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 细胞实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DCP溶液制备 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 采用细胞划痕实验检测DCP对HSC-LX2迁移率的影响 |
| 2.2.4 采用MTT法检测DCP对HSC-LX2增殖抑制率的影响 |
| 2.2.5 采用流式细胞术检测DCP对HSC-LX2细胞凋亡率的影响 |
| 2.2.6 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HSC-LX-2一般情况 |
| 2.3.2 DCP对细胞迁徙率的影响 |
| 2.3.3 DCP对HSC-LX2增殖的影响 |
| 2.3.4 DCP对HSC-LX2凋亡率的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Hedgehog信号通路与肝纤维化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）肝宁方对小鼠肝癌癌前病变炎症微环境影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 中医对肝癌癌前病变的认识与研究 |
| 1.1 肝癌癌前病变的病名 |
| 1.2 肝癌癌前病变的病因病机 |
| 1.3 肝癌癌前的辨证与分型 |
| 1.4 中医药治疗肝癌癌前病变 |
| 2 现代医学对肝癌癌前病变的认识与研究 |
| 2.1 肝癌癌前病变的流行病学 |
| 2.2 肝癌癌前病变的发病机制 |
| 2.3 现代医学对肝癌癌前病变的诊断 |
| 2.4 现代医学对肝癌癌前病变的治疗 |
| 3 肝癌癌前病变的肿瘤微环境 |
| 3.1 肿瘤微环境的定义 |
| 3.2 肿瘤免疫微环境 |
| 3.3 肿瘤炎症微环境 |
| 3.4 中医药调节肿瘤微环境 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试验药物及试剂 |
| 1.2.1 实验药物 |
| 1.2.2 实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物造模方法 |
| 2.2 标本采集 |
| 2.3 观察指标 |
| 2.3.1 小鼠的一般情况 |
| 2.3.2 体重、肝脏指数、脾脏指数 |
| 2.3.3 肝脏病理HE染色 |
| 2.3.4 血清肝功能和肿瘤相关因子检测 |
| 2.3.5 蛋白质印迹法检测肝组织中TLR4、NF-κB蛋白表达 |
| 2.4 统计学处理 |
| 第三部分 研究结果与分析 |
| 3.1 小鼠的一般情况 |
| 3.2 各组小鼠体重变化趋势 |
| 3.3 体重、肝脏指数、脾脏指数变化情况 |
| 3.4 肉眼可见结节大小、数量、分布情况 |
| 3.5 肝脏病理学观察HE染色 |
| 3.6 肝功能 |
| 3.7 血清炎症相关因子与肿瘤相关指标 |
| 3.8 肝脏TLR4、NF-κB表达情况 |
| 第四部分 讨论 |
| 4.1 肝宁方的研究基础 |
| 4.2 肝宁方的药物组成成分及研究现状 |
| 4.3 肝宁方对DEN/CCl4诱发的肝癌癌前病变炎症微环境影响的评价 |
| 4.3.1 肝宁方对小鼠一般情况的影响 |
| 4.3.2 肝宁方对肝脏指数/脾脏指数的影响 |
| 4.3.3 肝宁方对肝功能的影响 |
| 4.3.4 肝宁方对肝脏病理的影响 |
| 4.3.5 肝宁方对肝癌癌前病变相关炎症因子的影响 |
| 4.3.6 肝宁方对肝癌癌前病变相关肿瘤标志物的影响 |
| 4.3.7 肝宁方对肝癌癌前病变TLR4、NF-κB蛋白表达的影响 |
| 4.4 中西结合防治肝癌及癌前病变的特色与优势 |
| 4.5 不足与展望 |
| 第五部分 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药调节肝癌及癌前微环境中的TLR4/NF-κB信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（6）基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对肝纤维化的认识与研究 |
| 1.1 现代医学对肝纤维化流行病学的认识 |
| 1.2 现代医学对肝纤维化发病机制的研究 |
| 1.2.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 1.2.2 肝细胞与肝纤维化 |
| 1.2.3 枯否细胞与肝纤维化 |
| 1.3 西医治疗 |
| 1.3.1 药物治疗 |
| 1.3.2 肝脏移植 |
| 2 中医药对肝纤维化的认识与研究 |
| 2.1 中医学对肝纤维化病名的沿革 |
| 2.2 中医学中肝纤维化的病因病机 |
| 2.3 中医学对肝纤维化的辨证论治 |
| 2.4 中药对肝纤维化的认识与研究 |
| 2.4.1 单味中药 |
| 2.4.2 中药复方 |
| 2.4.3 针灸治疗及其他 |
| 第二部分 实验内容 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要实验试剂配制 |
| 1.4.1 药物 |
| 1.4.2 50%的CCl4 溶液配制 |
| 1.4.3 制备秋水仙碱 |
| 1.4.4 制备10%的水合氯醛 |
| 1.4.5 制备4%多聚甲醛固定液 |
| 1.4.6 封闭液 |
| 1.4.7 2XSDS蛋白上样缓冲液 |
| 1.4.8 电泳液 |
| 1.4.9 1X转膜液 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 肝纤维化大鼠模型的制备及给药方法 |
| 2.1.1 分组方法 |
| 2.1.2 造模方法 |
| 2.1.3 给药方法 |
| 2.2 标本采集 |
| 2.2.1 血清标本的采集 |
| 2.2.2 肝脏病理切片制备 |
| 2.3 HE染色制备 |
| 2.4 Masson染色制备 |
| 2.5 血清中ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量的测定 |
| 2.6 肝组织中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III m RNA表达 |
| 2.6.1 肝组织样本的采集 |
| 2.6.2 肝组织内总RNA的提取 |
| 2.6.3 RNA浓度的测定 |
| 2.6.4 反转录反应 |
| 2.6.5 Real-time q PCR扩增 |
| 2.7 肝组织中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、CollagenI、Collagen III蛋白的表达 |
| 2.7.1 组织样本的采集 |
| 2.7.2 肝组织内总蛋白的提取 |
| 2.7.3 总蛋白的保存 |
| 2.7.4 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.7.5 转膜 |
| 2.7.6 封闭 |
| 2.7.7 孵育抗体 |
| 2.7.8 发光显影 |
| 2.8 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠肝脏病理学形态的影响 |
| 3.1.1 大鼠一般情况 |
| 3.1.2 肝脏组织肉眼变化 |
| 3.1.3 肝组织病理学观察 |
| 3.2 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠血清中ROS、MDA、SOD、GSH-Px的影响 |
| 3.2.1 柔肝化纤颗粒对血清中ROS表达的影响 |
| 3.2.2 柔肝化纤颗粒对血清中MDA含量的影响 |
| 3.2.3 柔肝化纤颗粒对血清中SOD含量的影响 |
| 3.2.4 柔肝化纤颗粒对血清中GSH-Px含量的影响 |
| 3.3 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠PKCα/Nrf2 通路中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III m RNA表达的影响 |
| 3.3.1 柔肝化纤颗粒对PKCαmRNA表达的影响 |
| 3.3.2 柔肝化纤颗粒对Nrf2 mRNA表达的影响 |
| 3.3.3 柔肝化纤颗粒对HO-1 mRNA表达的影响 |
| 3.3.4 柔肝化纤颗粒对NQO1 mRNA表达的影响 |
| 3.3.5 柔肝化纤颗粒对α-SMA mRNA表达的影响 |
| 3.3.6 柔肝化纤颗粒对E-Cadherin mRNA表达的影响 |
| 3.3.7 柔肝化纤颗粒对Collagen I mRNA表达的影响 |
| 3.3.8 柔肝化纤颗粒对Collagen III mRNA表达的影响 |
| 3.4 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠PKCα/Nrf2 通路中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III蛋白表达的影响 |
| 3.4.1 柔肝化纤颗粒对PKCα蛋白表达的影响 |
| 3.4.2 柔肝化纤颗粒对Nrf2 蛋白表达的影响 |
| 3.4.3 柔肝化纤颗粒对HO-1 蛋白表达的影响 |
| 3.4.4 柔肝化纤颗粒对NQO1 蛋白表达的影响 |
| 3.4.5 柔肝化纤颗粒对α-SMA蛋白表达的影响 |
| 3.4.6 柔肝化纤颗粒对E-Cadherin蛋白表达的影响 |
| 3.4.7 柔肝化纤颗粒对Collagen I蛋白表达的影响 |
| 3.4.8 柔肝化纤颗粒对Collagen III蛋白表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的理论基础 |
| 4.1.1 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的疗效研究 |
| 4.1.2 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的机制研究 |
| 4.2 氧化应激反应与肝纤维化 |
| 4.3 PKCα/Nrf2/ROS信号通路与肝纤维化 |
| 4.4 α-SMA、E-cadherin与肝纤维化 |
| 4.5 Collagen I、Collagen III表达与肝纤维化 |
| 4.6 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 氧化应激在肝脏疾病中的作用及相关治疗策略 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及发表论文和参加科研情况说明 |
（7）保肝宁和人参皂苷Rg1对肝纤维化小鼠IDO1及树突状细胞的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 现代医学对肝纤维化的研究现状 |
| 第二节 IDO1与树突状细胞在肝纤维化的研究进展 |
| 第三节 中医学对肝纤维化的认识 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 体内模型检测肝纤维化小鼠体内IDO1表达水平与DCs免疫表型的改变 |
| 第二节 体外模型检测IDO1与DCs免疫表型的相关性 |
| 第三节 IDO1基因缺失或过表达状态对DCs免疫表型的改变及其对肝纤维化进程的影响 |
| 第四节 保肝宁对肝纤维化小鼠体内IDO1与DCs免疫表型的调控作用 |
| 第五节 保肝宁汤剂中的化学成分-人参皂苷Rg1对CCL_4诱导肝纤维化小鼠的保护作用 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（8）基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药防治肝硬化的研究现状 |
| 1 肝硬化病名渊源 |
| 2 中医对肝硬化病因病机的认识 |
| 3 中医治疗肝硬化思路 |
| 4 导师论治肝硬化的经验 |
| 5 中医药防治肝硬化的机制探讨 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 弹性蛋白及其调控因子在早期肝硬化中的作用 |
| 1 流行病学 |
| 2 肝硬化现代研究进展 |
| 3 弹性蛋白在肝硬化发生中的作用 |
| 4 调控弹性蛋白合成的细胞因子 |
| 5 调控弹性蛋白降解的细胞因子 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 研究一 益肝消积方对早期肝硬化的干预作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究二 益肝消积方调控弹性蛋白合成干预早期肝硬化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究三 益肝消积方调控弹性蛋白降解干预早期肝硬化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（9）LECT2/Tie1信号调控肝纤维化进程的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 第一章 LECT2在纤维化肝脏中高表达 |
| 一、实验结果 |
| 二、结论 |
| 三、讨论 |
| 第二章 LECT2主要表达于肝细胞和血管内皮细胞 |
| 一、结果 |
| 二、结论 |
| 三、讨论 |
| 第三章 敲除Lect2可以缓解肝脏纤维化 |
| 一、结果 |
| 二、结论 |
| 三、讨论 |
| 第四章 LECT2调控血管内皮细胞功能 |
| 一、结果 |
| 二、结论 |
| 三、讨论 |
| 第五章 LECT2与Tie1相互作用的关键位点 |
| 一、结果 |
| 二、结论 |
| 三、讨论 |
| 第六章 LECT2依赖与Tie1结合发挥作用 |
| 一、结果 |
| 二、结论 |
| 三、讨论 |
| 第七章 LECT2/Tie1下游信号通路研究 |
| 一、结果 |
| 二、结论 |
| 三、讨论 |
| 全文讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
（10）基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 祖国医学对肝纤维化的认识 |
| 1.1 病名探讨 |
| 1.2 病因病机探究 |
| 1.3 治法探讨 |
| 2 现代医学对肝纤维化的认识 |
| 2.1 肝纤维化的病因 |
| 2.2 肝纤维化的诊断 |
| 2.3 肝纤维化的治疗 |
| 3 本研究的理论基础 |
| 3.1 “主客交”学说 |
| 3.1.1 “主客交”学说的创立 |
| 3.1.2 “主客交”含义 |
| 3.1.3 “主客交”学说的发展 |
| 3.1.4 “主客交”学说的特点 |
| 3.2 “主客交”与肝纤维化 |
| 3.3 “主客交”之治疗——三甲散及加减运用 |
| 3.4 加减三甲散及其运用 |
| 4 肝纤维化与Wnt/β-catenin信号转导通路 |
| 4.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 4.2 Wnt信号转导通路 |
| 4.3 Wnt/β-catenin与肝纤维化 |
| 5 LncRNA与肝纤维化 |
| 5.1 LncRNA概况 |
| 5.2 LncRNA在肝纤维化中的研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 实验一 加减三甲散功效对比及wnt信号通路研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验主要试剂 |
| 1.1.3 实验主要仪器和设备 |
| 1.1.4 实验药物 |
| 1.1.5 实验场地 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验动物分组 |
| 1.2.2 干预用药的用法用量及制备方法 |
| 1.2.3 造模方法 |
| 1.2.4 药物干预方法 |
| 1.2.5 血清标本采集与处理 |
| 1.3 观察指标及方法 |
| 1.3.1 大鼠肉眼下观察 |
| 1.3.2 大鼠肝脏组织形态 |
| 1.3.3 血清肝功能指标观察 |
| 1.4 肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量观测 |
| 1.5 统计学处理方法 |
| 1.6 实验结果 |
| 1.6.1 大鼠一般情况变化 |
| 1.6.2 大鼠肝脏组织形态变化 |
| 1.6.3 血清肝功能指标观察 |
| 1.6.4 肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量变化 |
| 1.7 讨论 |
| 1.7.1 加减三甲散2号方的由来 |
| 1.7.2 对肝纤维大鼠模型的评价 |
| 1.7.3 对大鼠一般情况的影响 |
| 1.7.4 对大鼠肝脏病理形态的影响 |
| 1.7.5 对大鼠血清肝功能指标的影响 |
| 1.7.6 对肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量的影响 |
| 2 实验二加减三甲散干预肝纤维化大鼠lnc RNA和 m RNA表达谱的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 |
| 2.1.4 实验药物 |
| 2.1.5 实验场地 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 造模方法 |
| 2.2.3 干预用药的制备及用法用量 |
| 2.2.4 药物干预方法 |
| 2.2.5 标本采集与处理 |
| 2.3 观察指标及方法 |
| 2.3.1 大鼠肉眼下形态观察 |
| 2.3.2 小鼠肝脏组织形态 |
| 2.3.3 血清肝纤维化指标观察 |
| 2.4 高通量测序肝脏组织m RMA和 lnc RNA |
| 2.4.1 RNA抽提和质检 |
| 2.4.2 文库构建 |
| 2.4.3 上机测序 |
| 2.4.3.1 获得reads |
| 2.4.3.2 数据预处理 |
| 2.4.3.3 基因组比对(Mapping genome) |
| 2.4.4.4 基因饱和度分析 |
| 2.4.4.5 mRNA和lncRNA差异基因筛选 |
| 2.4.4.6 GO 富集分析和 KEGG pathway 富集分析 |
| 2.5 统计学处理方法 |
| 2.6 实验结果和分析 |
| 2.6.1 大鼠一般情况变化 |
| 2.6.2 大鼠肝脏组织形态变化 |
| 2.6.3 血清肝纤维化指标观察 |
| 2.6.4 大鼠肝脏组织mRNA表达谱的变化 |
| 2.6.5 大鼠肝脏组织lnc RNA表达谱的变化 |
| 2.7 讨论 |
| 2.7.1 对大鼠一般情况的影响 |
| 2.7.2 对大鼠肝脏病理形态的影响 |
| 2.7.3 对大鼠血清肝纤维化指标的影响 |
| 2.7.4 对大鼠肝脏组织lncRNA和mRNA的影响及与“主客交”的联系 |
| 结论 |
| 特色与创新 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 1:附图 部分原始图片 |
| 附件 2:文献综述 中成药治疗肝纤维化的临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件 3:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
四、四氯化碳诱导鼠肝组织血管病变的动态观察（论文参考文献）
- [1]基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制[D]. 张强. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究[D]. 周怡驰. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]纤维连接蛋白额外结构域A促进肝纤维化及血管异常增生的作用与机制研究[D]. 苏骁男. 山东大学, 2021(11)
- [4]滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用[D]. 于亚男. 大理大学, 2021(09)
- [5]肝宁方对小鼠肝癌癌前病变炎症微环境影响的实验研究[D]. 曹献. 广西中医药大学, 2021(01)
- [6]基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用[D]. 吕艳杭. 广西中医药大学, 2021
- [7]保肝宁和人参皂苷Rg1对肝纤维化小鼠IDO1及树突状细胞的作用机制研究[D]. 莫婵. 南方医科大学, 2021(02)
- [8]基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究[D]. 张嘉鑫. 北京中医药大学, 2021(01)
- [9]LECT2/Tie1信号调控肝纤维化进程的作用和机制研究[D]. 徐蒙. 南方医科大学, 2021
- [10]基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响[D]. 成茂源. 成都中医药大学, 2020(01)