导读:本文包含了肠粘膜上皮论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:氧化应激,自噬,细菌易位,紧密连接蛋白
肠粘膜上皮论文文献综述
黄路桥[1]（2018）在《重症急性胰腺炎中肠上皮氧化应激与自噬对肠粘膜屏障的影响及机制研究》一文中研究指出目的:重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一种发病急、并发症多、死亡率高的急腹症,常伴有全身炎症反应综合征、脓毒症甚至器官功能障碍。它能够导致肠粘膜屏障损伤,这种损伤与肠粘膜氧化应激和自噬水平的改变有关。我们旨在探讨肠粘膜自噬和氧化应激之间的相互作用对重症急性胰腺炎大鼠肠粘膜屏障损伤的影响。方法:选取健康雄性Wistar大鼠40只,随机分为两组:SAP组(n=30)和假手术(sham operation,SO)组(n=10)。适应性饲养2周后,将大鼠称重并用3%戊巴比妥钠(20mg/kg体质量)腹腔注射麻醉。消毒后选择右侧旁正中小切口打开腹腔,用血管夹在肝门部阻断胰胆管。采用逆行胆胰管穿刺法,使用微量泵连接24G套管针缓慢泵入(10min泵入)牛磺胆酸钠(5%、1ml/kg)诱导SAP模型。在诱导SAP 24h后经大鼠下腔静脉穿刺抽血,用16S r DNA序列分析法检测细菌易位(BT)。所有大鼠均在诱导SAP 24h后处死。通过HE染色观察胰腺组织和肠组织的病理变化,并根据评分标准分别对各组胰腺及肠组织进行病理评分;同时使用全自动生化分析仪分别测定血液样本中血清淀粉酶和脂肪酶水平。采用分光光度法测定肠上皮组织氧化应激水平,通过测定肠组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平来确定组织氧化应激状态。用Western blot技术检测大鼠肠上皮组织样本中紧密连接(tight junction,TJ)蛋白(Zonula occluden-1,ZO-1)、Occludin、Claudins-1、Claudin-2的表达。用RT-PCR技术检测大鼠肠上皮组织中TJ蛋白ZO-1、Occludin、Claudins-1、Claudin-2 m RNA的表达。同样用Western blot检测大鼠肠上皮组织中自噬蛋白LC3II和Beclin1的表达情况。采用免疫荧光染色法检测大鼠肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-2和自噬蛋白LC3II的分布情况。结果:重症急性胰腺炎组30只大鼠在造模后10h到24h内有13只发生死亡,17只存活(死亡率43.33%),假手术组无大鼠发生死亡。根据血16S r DNA序列分析结果,将SAP大鼠分为:BT(+)组(n=9)和BT(-)组(n=8)。SAP组胰腺和肠组织的损伤程度显着高于对照组(P<0.01)。SAP组血清淀粉酶、脂肪酶水平显着高于对照组(P<0.01)。SAP组血清淀粉酶、脂肪酶水平与胰腺损伤程度一致。与BT(-)组相比,BT(+)组MDA的含量明显升高(P<0.01),而SOD和GPx活性降低(P<0.05,P<0.01)。SAP组LC3II和Beclin1的表达显着高于SO组(P<0.01),而BT(-)组LC3II和Beclin1水平明显高于BT(+)组(P<0.05)。SAP组紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1表达显着低于SO组,而Claudin-2水平升高(均P<0.01);与BT(-)组相比,BT(+)组Claudin-2水平升高(P<0.05),而紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1表达减低(均P<0.01)。结论:SAP大鼠模型的肠粘膜自噬是激活的,肠粘膜自噬的激活可抑制和减轻SAP引起的氧化应激对肠黏膜屏障功能的损伤。(本文来源于《青岛大学》期刊2018-05-19）
王文杏[2]（2016）在《鼠伤寒沙门氏菌spv基因回补株的构建及其对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响》一文中研究指出目的:构建稳定的沙门氏菌表达载体,在此基础上构建鼠伤寒沙门氏菌spv基因回补株并研究其稳定性。体外建立鼠伤寒沙门氏菌感染Henle-407的细胞模型,观察沙门菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制。为探讨鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spvC致病机制提供理论和实验依据,并为后续利用动物模型进行该基因功能的研究提供工具和手段。方法:一、鼠伤寒沙门氏菌spv基因荧光回补株的构建及其稳定性的研究。以低拷贝克隆载体pACYC-184为基础,根据GenBank数据库中公布的eGFP基因序列,上游增加Trc Promoter启动子,下游增加rrnB ribosomal终止子,两端位点上、下游序列设计相应酶切位点,采用多重PCR的方法合成pACYC184-eGFP载体,并依次调取及克隆aphA-hok-parDE基因和spv基因,构建得到pACYC184-eGFP-HOK载体、pACYC184-spvB-eGFP-HOK载体及pACYC184-spvC-eGFP-HOK载体,分别电转化入对应的鼠伤寒沙门氏菌spv基因缺陷变异株得到相应的回补株,并对质粒的稳定性及荧光蛋白表达情况进行检测。二、沙门氏菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制的研究。携带spv基因(Salmonella plasmid virulence genes)的野生型鼠伤寒沙门氏菌211、敲除spvC的缺陷变异株(ST211-△-e-spvC)及回补株(ST211-c-spvC)与Henle-407细胞共培养,取不同干预时间点的细胞进行实验。荧光显微镜观察细胞核形态学改变和胞内菌数量;Promega荧光素酶发光法检测Caspase3/7活性;Western blot法检测ERK和p-ERK表达水平;胞内集落形成单位的检测采用平板菌落计法。结果:一、鼠伤寒沙门氏菌spv基因回补株的构建及其稳定性的研究。1.经PCR及基因测序证实成功构建鼠伤寒沙门菌spvB、spvC基因荧光回补株。2.含有低拷贝质粒的回补株在连续培养12代或144h都未发生丢失,在细菌感染细胞模型中用荧光显微镜可观察到细菌带绿色荧光。二、沙门氏菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制的研究。1.荧光显微镜下ST211感染组与ST211-c-spvC感染组细胞在4h出现大量的细胞核呈波纹状或折缝样、部分染色质凝聚等早期细胞凋亡形态学改变,而ST211-△-e-spvC感染组及空白对照组无明显凋亡形态学改变。感染24h,ST211感染组与ST211-c-spvC感染组细胞的染色质高度凝聚边缘化、产生凋亡小体并出现大量以坏死为特征的形态学改变,ST211-△-e-spvC仅部分细胞存在凋亡、坏死形态学改变。2.Caspase-3/7活性检测结果显示,各组Caspase-3/7活性随感染时间的延长而升高,0h和4h,叁个感染组间的Fluorescence值无明显差异(P>0.05);感染后4h,细菌感染组较空白对照组出现显着差异(P<0.01);感染的8h、12h和24h,ST211-△-e-spvC感染组较ST211-eGFP感染组和ST211-c-spvC感染组的Fluorescence值有差异(P<0.05)。3.p-ERK蛋白的比值分别为(24h;空白对照组,0.89±0.03;ST211-eGFP感染组,0.12±0.02;ST211-△-e-spvC感染组,0.74±0.05;ST211-c-spvC感染组,0.11±0.04),ST211-eGFP感染组与ST211-c-spv C感染组的p-ERK蛋白的比值较ST211-△-e-spvC感染组显着降低(P<0.01)。4.共培养的前4h,组间胞内活菌数无明显差异(P>0.05)。在干预后8h、12h和24h,ST211-eGFP感染组与ST211-c-spvC感染组胞内活菌数高于ST211-△-e-spvC感染组(P<0.05)。结论:1.高度稳定且含有绿色荧光蛋白标签的沙门氏菌表达载体及spv基因回补株构建成功,为深入研究鼠伤寒沙门菌毒力基因的功能奠定了基础。2.沙门菌质粒毒力基因spvC可通过诱导细胞凋亡促进细菌在宿主细胞内的存活和增殖,进而加重细胞损伤,这一作用可能与其影响ERK的磷酸化水平有关。(本文来源于《南昌大学》期刊2016-06-01）
赵亮[3]（2016）在《梗阻性黄疸大鼠肠粘膜上皮潘氏细胞变化及其与肠粘膜屏障的关系》一文中研究指出目的本实验通过建立梗阻性黄疸大鼠模型,探讨梗阻性黄疸大鼠肠粘膜上皮潘氏细胞变化及其与肠粘膜屏障的关系。方法成年健康雄性SD大鼠27只,随机分为:空白对照组(Control, n=9),假手术组(Sham operation,SO 组,n=9),梗阻性黄疸组(Obstructive jaundice, 0J组,n=9)。Control组不做任何处理;SO组,开腹后仅分离胆总管;0J组,开腹后分离胆总管并行胆总管双重结扎。叁组大鼠均于胆管结扎术后第9天剖腹探查、采血,术中观察各组胆管梗阻情况后立即处死实验动物,并留取相应实验所需标本。留取下腔静脉血检测ALT、AST、TBIL、DBIL等肝功能指标;留取门静脉血液ELISA法检测D-乳酸及DAO;取末端回肠10%甲醛固定后,HE染色观察肠粘膜形态,免疫组化检测溶菌酶蛋白及sIgA蛋白的表达情况。结果1.动物模型情况:成功建立大鼠胆管梗阻动物模型。肉眼观大鼠胆管结扎术后第1天即出现轻度黄疸表现,以皮肤,尤其是耳朵处为着,随时间延长呈进行性加重,第2天出现尿液变黄,第3天大鼠皮肤黄染明显,活动减少,继续有尿黄表现伴有大便颜色变白,术后大鼠整体活动明显受限,神志较差,有轻度嗜睡现象出现。2.肝功能:SO组与Control组血清中ALT、AST、TBIL、DBIL含量无明显差异;0J组大鼠血清中ALT、AST、TBIL、DBIL等反映肝功能及胆道梗阻情况的指标含量明显升高,较其它两组具有明显差异(P<0.01)。3.肠粘膜组织学观察:(1) HE染色:S0组与Control组大鼠回肠粘膜绒毛结构完整,肠粘膜上皮细胞呈现高柱状。0J组大鼠的回肠绒毛结构欠完整,其数量及密度下降,粘膜绒毛间间隙增大,并伴有部分绒毛的脱落及细胞肿胀,粘膜的腺体排列较为稀疏,杯状细胞减少明显,粘膜萎缩变薄,呈现以间质充血水肿及非特异性炎细胞浸润的炎症改变。(2)肠粘膜绒毛高度和隐窝深度:S0组与Control组大鼠进行比较,肠粘膜绒毛高度和隐窝深度无显着差异,0J组的绒毛高度及隐窝深度明显低于及浅于其它两组(P<0.01)。4. D-乳酸及DAO含量:S0组与Control组血清中D-乳酸及DAO含量无明显差异;0J组血清中D-乳酸及DAO含量较其它两组相比显着升高(P<0.01)。5. sIgA蛋白的表达:sIgA阳性产物主要定位于固有层细胞。S0组与Control组可见较多sIgA蛋白表达,且无显着差异;0J组sIgA蛋白表达量较其它两组显着减少(P<0.05)。6.潘氏细胞的组织学观察:SO组与Control组大鼠潘氏细胞整齐排列于小肠隐窝底部,呈锥形,核不规则,靠近细胞的基底部,细胞质顶部有大量被伊红染为红色的圆形的分泌颗粒。0J组大鼠潘氏细胞数目减少,分泌颗粒染色变浅。7.溶菌酶蛋白的表达:在各实验组均有不同程度的表达,阳性产物主要定位于小肠隐窝潘氏细胞细胞质内。各组大鼠通过计算肠粘膜溶菌酶阳性细胞数所占百分率进行比较, SO组与Control组可见较多溶菌酶阳性细胞表达,0J组溶菌酶蛋白表达的阳性细胞数低于Control组,有显着统计学意义(P<0.01)。8.相关性分析:溶菌酶作为一种潘氏细胞分泌的抗菌蛋白,在0J组的表达与D-乳酸的含量呈负相关(r=-0. 95,P<0. 01),与sIgA的表达呈正相关(r=0. 89,P<0.01)。结论梗阻性黄疸可致肝功能受损及肠粘膜屏障功能障碍。同时,梗阻性黄疸可致潘氏细胞数目减少及功能障碍。相关性分析显示,梗阻性黄疸状态下潘氏细胞的变化与肠粘膜屏障功能显着相关。(本文来源于《滨州医学院》期刊2016-03-20）
马莉,曾慧红,饶瑜红,彭胜男,陈小文[4]（2015）在《大黄酸对损伤肠粘膜上皮PCNA及cleaved-PARP表达的影响》一文中研究指出目的探讨大黄酸(RH)对损伤肠粘膜上皮增殖细胞核抗原(PCNA)及细胞凋亡的标志蛋白PARP降解产物(cleaved-PARP)表达的影响及其肠黏膜保护作用。方法将28只SD雌性大鼠随机分成正常对照组、损伤组、RH治疗组和RH预防组(n=7)。用牛血清白蛋白(BSA)+脂多糖(LPS)+四氯化碳(CCl_4)联合构建损伤模型;正常对照组用生理盐水替代药物;RH治疗组在建立损伤模型后大黄酸灌胃;RH预防组在建立损伤模型时大黄酸灌胃。采用免疫组织化学法观察大鼠回肠上皮组织PCNA及cleaved-PARP表达情况,并采用图像分析仪检测肠上皮PCNA及cleavedPARP阳性细胞表达率及平均光密度值。结果损伤组肠上皮脱落、肠绒毛不规整、数量减少并变矮,固有层充血,炎症细胞浸润。与损伤组相比,RH预防组和RH治疗组肠粘膜损伤明显减轻,肠绒毛高度增加,小肠腺深度变浅。PCNA表达于小肠腺上皮细胞核,cleaved-PARP肠绒毛及小肠腺上皮细胞核均有表达,且肠绒毛顶部表达较强。与正常对照组比较,损伤组肠粘膜上皮细胞PCNA的阳性率和平均光密度均减少,cleaved-PARP的阳性率和平均光密度均增加(均P<0.05)。与损伤组比较,RH治疗组和RH预防组肠粘膜上皮细胞PCNA的阳性率和平均光密度均增加,cleavedPARP的阳性率和平均光密度均减少(均P<0.05)。RH治疗组和RH预防组之间比较,RH治疗组肠粘膜上皮细胞PCNA的阳性率和平均光密度均少于RH预防组,RH预防组肠粘膜上皮细胞cleaved-PARP的阳性率和平均光密度均少于RH治疗组(均P<0.05)。结论大黄酸能增强小肠上皮细胞PCNA的表达,并抑制PARP的表达,通过促进肠上皮的生长,抑制上皮细胞凋亡从而保护肠粘膜和修复肠粘膜损伤。(本文来源于《第十四届中国体视学与图像分析学术会议论文集》期刊2015-09-16）
程秀琴[5]（2015）在《MiR-19b调控肠上皮细胞SOCS3表达在肠粘膜损伤修复中的作用》一文中研究指出【研究背景与目的】炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD),其病因和发病机制尚未完全明确。肠黏膜免疫紊乱是导致IBD发生、发展和影响其转归的决定性因素,而肠上皮细胞在维持肠免疫稳态中具有重要的作用。目前调控肠上皮细胞发挥肠黏膜免疫稳态功能的分子机制尚不清楚。近期研究表明,IBD患者存在特异的miRNAs表达谱,miRNA可在转录后水平抑制靶基因的表达,参与IBD的发病。细胞因子信号抑制物3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)可通过对肠上皮细胞(Intestinal epithelial cell,IEC)信号传导及转录激活因子3(Signal transducers and activators of transcription,STAT3)的表达调控,介导细胞增殖过程,影响炎症过程中的粘膜愈合,是炎症持续活动的生物学标志。我们的前期研究发现miR-19b在CD患者肠粘膜组织的病变部位较正常人明显下降,而SOCS3的蛋白表达较正常人明显升高,且细胞实验验证miR-19b可以靶向调控SOCS3的表达。本课题旨在:通过小鼠结肠炎模型进一步验证miR-19b在肠道炎症形成中的作用;并通过免疫组化、miRNA原位杂交及细胞实验探讨miR-19b靶向调控肠上皮细胞SOCS3的表达对STAT3活性的影响及其对IEC增殖的作用。【方法】1.选取6~8周雌性BALB/c小鼠,给予叁硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)灌肠,诱导建立小鼠结肠炎模型。2.TNBS造模成功后,给予小鼠miR-19b类似物灌肠,免疫荧光检测外源性输注的miR-19b在肠粘膜中的分布,并观察各组小鼠肠道炎症的变化,检测肠组织中miR-19b及SOCS3的表达水平。3.原位杂交技术(In situ hybridization,ISH)检测CD患者及正常对照组肠上皮细胞中miR-19b的表达。4.免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测CD患者及正常对照组肠上皮细胞中STAT3及磷酸化STAT3(Phosphorylated-STAT3,p-STAT3)的表达。5.荧光素酶报告基因实验(Luciferase reporter assay)分析HT-29细胞中miRNA与SOCS3 3’非翻译区(UTR)的结合情况。6.过表达或抑制HT-29细胞中的miR-19b后,采用Western blotting及q RT-PCR分别检测SCOS3蛋白和信使RNA(Messenger RNA,mRNA)的表达情况。7.过表达或抑制HT-29细胞中的miR-19b后,给予Interleukin-6(IL-6)刺激细胞30min,Western blotting检测细胞STAT3及p-STAT3的表达水平。8.过表达或抑制HT-29细胞中的miR-19b后,给予IL-6刺激细胞24h,q RT-PCR及Western blotting分别检测STAT3的下游基因细胞周期素cyclin D1的mRNA和蛋白的变化。9.过表达或抑制HT-29细胞中的miR-19b后,给予IL-6刺激细胞24h,用流式细胞技术及CCK8检测细胞细胞周期及增殖能力的变化。【结果】1.BALB/c小鼠经TNBS灌肠后形成结肠炎模型。与乙醇对照组相比,TNBS模型组小鼠的DAI评分增加,肠道炎症加重,HE组织病理评分增加。提示造模成功。2.小鼠TNBS造模成功后,结肠中miR-19b水平较对照组降低,SOCS3蛋白表达较对照组增加。再给予miR-19b类似物灌肠,免疫荧光显示外源性输注的miR-19b可进入肠上皮细胞内。治疗组中小鼠的DAI评分较造模组有所下降,HE组织评分降低,肠道炎症减轻,提示结肠中miR-19b的水平与小鼠的肠道炎症程度成负相关。检测各组小鼠结肠组织中miR-19b及SOCS3的表达,发现经miR-19b类似物灌肠治疗后小鼠结肠中miR-19b水平升高,SOCS3蛋白降低,SOCS3 mRNA在各组小鼠结肠组织中无明显差异。提示miR-19b可以改善TNBS小鼠结肠的炎性损伤,可能与转录后调控SOCS3的表达相关。3.原位杂交结果显示miR-19b在活动期CD患者肠上皮细胞中低表达,与前期研究中PCR的检测结果一致。4.活动期CD患者病变肠上皮细胞中STAT3蛋白表达水平与正常对照组肠上皮细胞相比无明显差异,而p-STAT3的表达较对照组明显降低。5.在HT-29细胞中,荧光素酶报告基因实验结果提示miR-19b可以与SOCS3 mRNA的3’UTR特异性结合。6.过表达或抑制HT-29细胞中的miR-19b,可降低或升高SOCS3蛋白水平,而SOCS3 mRNA水平不受影响。提示在HT-29细胞中,miR-19b可在转录后水平抑制SOCS3的表达。7.在HT-29细胞中过表达或抑制miR-19b,可升高或下降STAT3蛋白的磷酸化水平,而STAT3的总蛋白水平不受影响。8.过表达HT-29细胞中的miR-19b可促进STAT3磷酸化,可增加下游基因cyclin D1的表达;降低miR-19b可抑制STAT3的磷酸化,可减少cyclin D1的表达。9.过表达HT-29细胞中的miR-19b能够诱导细胞G1/S期转化,促进细胞增殖;下调HT-29细胞中的miR-19b则减少细胞G1/S期的转化,抑制细胞增殖。【结论】miR-19b的低表达及SOCS3的高表达存在于CD患者及TNBS诱导的结肠炎小鼠中。给予miR-19b类似物后,可减低TNBS小鼠结肠的炎性损伤,提示异常表达的miR-19b及SOCS3可能与肠道的炎症形成相关,参与CD的发病。体外细胞实验提示miR-19b可靶向调控SOCS3的表达,影响p-STAT3/cyclin D1的表达,调节细胞周期及细胞增殖,从而影响CD患者损伤肠粘膜的修复,参与CD的发生发展。(本文来源于《南京医科大学》期刊2015-05-01）
王中秋[6]（2015）在《肠上皮细胞Syndecan-1在维持肠粘膜屏障中的作用及机制》一文中研究指出研究背景和目的肠粘膜屏障是机体屏障系统的重要组成部分,多种因素可以引起肠粘膜屏障功能受损,导致肠壁通透性增加,细胞旁细胞转运被易化,进一步诱发细菌易位、内毒素血症甚至是全身性炎症反应综合征和多脏器功能衰竭综合征。正常的肠粘膜屏障功能由肠粘膜上皮屏障(或称为机械屏障)、免疫屏障、微生物屏障、化学屏障等组成,其中肠粘膜上皮屏障和免疫屏障被认为是最关键的组成部分。肠上皮屏障由完整的肠上皮细胞、细胞间封闭的紧密连接和粘附连接组成,是肠粘膜物理结构的解剖屏障。封闭的紧密连接是肠上皮细胞之间的主要连接方式,被认为是上皮屏障的结构基础,是维持肠粘膜屏障通透性的决定因素。紧密连接的关键成分包括跨膜蛋白occludin(闭锁蛋白)、claudins(密蛋白)家族等、膜周蛋白zonula occludens(闭锁小带,ZO),以及调节蛋白如激酶、磷酸化酶等多种蛋白。ZO-1 (zonula occludens-1)被认为是紧密连接的支架蛋白,具有PDZ样结合位点(PSD-95、Discs large、Zona ocludens 1)、Src同源SH3结构域(Src homology 3)和GUK鸟苷酸激酶样(Guanylate kinase-like)结一构域等结构,能够连接occludin、claudins蛋白和细胞骨架肌动蛋白及肌球蛋白,在一系列信号分子的调控下,构成稳定的连接系统,封闭细胞之间的间隙。正常情况下,紧密连接在相邻上皮细胞间维持着正常的结构组装和功能状态,只允许离子及小分子可溶性物质通过,而不允许毒性大分子和细菌等微生物通过,从而维持肠上皮屏障功能的完整。目前已经明确,肠道内的各种细菌、毒素及某些炎症因子可通过不同途径影响紧密连接的完整性和通透性,破坏肠粘膜屏障功能。然而近期有研究提示紧密连接单独表达缺失或功能障碍并不足以破坏屏障而引起腹腔感染、败血症及多脏器功能衰竭等疾病,表明仍然存在其它因素参与肠上皮屏障功能的维护。Syndecan-1(CD138, Sdcl)属于跨膜蛋白聚糖类细胞粘附分子,是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的重要成员。生理情况下多表达于成熟上皮细胞基底层,是细胞质膜、细胞间质的重要组成部分,由胞内段、跨膜的核心蛋白和连接于核心蛋白上的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate, HS)链及硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)链组成。它可以与多种配体结合,包括粘附分子、细胞外基质、细胞因子、生长因子、趋化因子和细菌表面的肝素结合蛋白等,以共受体的方式在维持细胞形态、促进组织修复、调节免疫功能、参与宿主防御等诸多病理生理过程中发挥重要作用。研究发现Sdcl为稳固肠上皮屏障所必需,是维持上皮屏障的重要保护机制之一。其HS链及类似物乙酰肝素能够抑制多种肠道菌种对肠上皮细胞的粘附,进而抑制细菌被内吞入细胞、发生易位甚至引起系统性感染。Sdcl还能够抑制葡萄球菌肠毒素感染性休克时细胞因子的级联反应和T细胞介导的炎性损伤,保护宿主抵抗全身败血症的发生。Sdcl与紧密连接蛋白均为上皮屏障功能的保护因素,但二者之间是否存在相互作用,是否能够共同参与维持肠上皮屏障的过程现在并不十分明确。我们推测：Sdc1和紧密连接蛋白均参与肠上皮屏障功能的维护,二者可能具有协同作用,共同稳固细胞旁屏障,保持细胞旁路物质转运的选择性。为了证明这一假设,本研究通过利用体外Transwell小室培养法模拟的单层肠上皮模型和体内硫酸葡聚糖钠(Dextran sodium sulfate, DSS)诱导构建的肠上皮屏障缺陷小鼠模型,探讨了Sdc1与紧密连接蛋白的相互作用在肠上皮屏障功能维护中的作用；并进一步揭示了转录因子Stat3在这一过程中的介导作用。研究方法和结果1.筛选Sdcl不同表达水平的肠上皮细胞,构建单层肠上皮屏障障模型采用荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光法检测四种经文献报道,具有形成融合性单层上皮潜能的结肠癌上皮细胞株(HT29、LoVo、SW480、Caco-2)细胞中的Sdcl的表达水平,结果提示Sdcl在HT29细胞中为显着高表达(F=103.111,P<0.001),并且大多集中于细胞膜上,而Caco-2细胞中的Sdcl表达水平最低。因此选取这两种细胞用于构建单层肠上皮屏障模型,采用跨膜电阻仪检测上皮跨膜电阻(transepithelial electrical resistance, TEER)来评价上皮屏障的完整性,在大肠杆菌刺激后检测细菌易位,通过荧光素FITC-dextran (FD4)的旁细胞转运评价上皮屏障的通透性。结果显示：在Transwell小室底部内侧培养细胞15d之后,TEER值显着升高,约为300 ohms cm2,证明单层肠上皮屏障形成。大肠杆菌刺激后,以处理前TEER值为对照,TEER实测值的绝对值及其与处理前TEER值的比值均呈现时间依赖性的减少,而在未被细菌处理的上皮屏障中TEER值基本维持稳定。在Caco-2细胞构建的单层上皮屏障中,TEER值减少更加显着(F=49.030,P<0.001),大肠杆菌的易位量(t=8.373,P=0.001)和FD4的透过量(t=9.689,P=0.001)也均较HT29细胞更加显着。为了明确上述屏障功能改变是否依赖于紧密连接蛋白的变化,在细菌刺激过程同时检测肠上皮细胞是否会因细胞毒性反应发生细胞膜损伤、细胞凋亡,以及是否发生紧密连接结构的重组。结果显示：大肠杆菌刺激细胞5h后,与未处理细胞比较,LDH释放、caspase-3激活均并不显着,而分别以Triton X-100 (HT29细胞：t=9.362,P=0.001; Caco-2细胞：t=12.566,P<0.001)及环孢菌素A(Cyclosporin A, CsA)为阳性对照的处理组均表现出显着的细胞损伤。正常细胞未受到细菌刺激时,免疫荧光染色可见ZO-1呈典型的线性荧光,沿细胞膜分布；大肠杆菌刺激细胞5h后,ZO-1荧光信号减弱,并且分布丢失明显的规律性。上述结果说明在采用Transwell小室构建单层上皮屏障模型的过程中,利用细菌刺激细胞5 h,细胞毒性反应并不显着,所发生的屏障功能的改变可能与紧密连接改变有关,而与细胞凋亡或坏死的关系不显着。2.Sdc1能缓解大肠杆菌刺激后的屏障功能受损及细菌易位利用慢病毒载体将外源性的Sdc1导入Caco-2细胞,经过2周左右2 μg/mL puromycin筛选,建立了Sdc1表达显着升高的细胞克隆,通过荧光定量PCR和Western blot对细胞克隆进行鉴定,结果显示Sdcl在mRNA (t=14.381, P<0.001)和蛋白水平均显着增加。利用Lipofectmine 2000瞬时转染Sdcl siRNA进入HT29细胞,转染48 h后,Sdc1在mRNA (t=56.292, P<0.001)和蛋白的表达水平均显着降低。分别利用经过上述处理的细胞构建单层上皮屏障模型,检测屏障功能变化。结果显示,对Caco-2细胞上调Sdc1表达后,TEER值减低率(F=39.841,P<0.001)、大肠杆菌易位(F=73.726,P<0.001)、FD4透过值(F=54.835,P<0.001)均显着升高。与之相反,HT29细胞下调Sdc1表达后,TEER值减低率(F=34.098,P<0.001)、大肠杆菌易位(F=33.782,P=0.001)、FD4透过值(F=153.383,P<0.001)均显着升高。以上结果提示Sdc1对上皮屏障功能可能具有保护作用。3.Sdc1能缓解金黄色葡萄球菌刺激后的屏障功能受损及细菌易位利用金黄色葡萄球菌刺激上述已经构建好的单层上皮屏障,结果显示,刺激5h后,与对照组相比,高表达Sdc1的Caco-2细胞的TEER值减低率(F=129.269,P<0.001)和葡萄球菌易位(F=39.479,P<0.001)均显着减少：而敲低Sdc1表达的HT29细胞中,TEER值减低率(F=124.132,P<0.001)和葡萄球菌易位(F=51.965,P=0.001)均显着增加,均与大肠杆菌刺激屏障后的结果一致。以上结果提示Sdc1对上皮屏障功能的保护作用并非呈刺激细菌依赖性,而可能是一种对各种细菌-上皮作用普遍存在的现象。4.Sdc1能够减轻紧密连接蛋白缺陷细胞的屏障功能受损HT29细胞单独转染ZO-1 siRNA后,ZO-1蛋白表达水平显着下降,若在此基础上同时给予Sdcl慢病毒载体处理使Sdc1表达水平升高,就能够显着减弱ZO-1蛋白的下降程度。在上述ZO-1蛋白缺陷的细胞中检测Sdc1表达改变前后屏障功能的变化,结果显示：在HT29细胞单独转染ZO-1 siRNA下调ZO-1蛋白表达水平后,与对照组相比,单层上皮屏障的TEER值减低率(F=138.489,P<0.001)、大肠杆菌易位(t=11.624, P<0.001)、FD4透过值(t=14.802,P<0.001)均显着升高。若同时给予Sdcl慢病毒载体处理使ZO-1沉默作用被减轻,上述指标升高的程度均有所减少,提示受损的屏障功能被部分恢复,Sdc1可能对ZO-1蛋白缺陷的细胞具有保护作用。但与单独感染Sdc1慢病毒载体上调Sdc1表达水平,而对ZO-1蛋白不作专门处理的细胞相比,上述指标仍然有所下降,单层上皮屏障的功能仍然较低。HT29细胞单独给予occludin siRNA或同时给予occludin siRNA和Sdcl慢病毒载体联合处理后,结果表现出同样的趋势。以上结果提示Sdcl对于ZO-1或occludin蛋白缺陷细胞的屏障功能同样具有保护作用,并且能够减轻由于紧密连接损失导致的屏障功能受损。5.Sdc1能够缓解小鼠体内DSS诱导的屏障缺陷及细菌易位利用DSS诱导结肠炎的方法构建肠粘膜屏障缺陷小鼠模型,通过尾静脉注射Sdc1高表达质粒的方法进行体内转染,上调Sdc1表达,之后评估肠粘膜紧密连接蛋白表达及超微结构、组织细菌易位、肠粘膜组织病理学变化等相应屏障功能的改变。结果发现：PBS对照组小鼠一般情况及大便性状均无显着变化,DAI评分为0；组织病理学检查和紧密连接超微结构亦无显着改变。小鼠饮用DSS溶液3-5天后逐渐出现腹泻、不同程度的稀便至血便等症状,DAI评分升高(F=559.328,P<0.001),结肠缩短。肉眼观察结肠组织,可见结肠缩短,受累肠段变紫红至黑褐色,肠壁充血、水肿,与周围组织粘连,部分可见糜烂及溃疡。组织病理学可见肠粘膜不完整,可见多灶性浅溃疡,杯状细胞减少,隐窝及腺体正常结构消失,部分病灶表面仅残留少许上皮或上皮结构已被完全破坏,粘膜层及粘膜下层大量炎性细胞浸润。电镜观察可见紧密连接结构减少、间隙增宽。提取肠粘膜蛋白进行Western blot检测,发现Sdcl及ZO-1、occludin蛋白的表达水平均减少。与DSS对照组相比,对小鼠进行尾静脉注射Sdc1表达质粒上调Sdc1表达后,小鼠结肠病变有所减轻,疾病活动度和结肠炎症程度减低(DAI评分：F=559.328,P<0.001),结肠缩短和体重下降程度亦不及对照组显着；肉眼观察可见肠管充血、水肿,但糜烂和溃疡较少,病理组织学检查可见有少量上皮细胞和腺体细胞再生并移行；电镜观察可见紧密连接结构较完整,细胞间隙扩大程度有所减低；ZO-1、occludin蛋白的表达水平也有所增加。说明Sdcl在体内对肠粘膜上皮屏障同样具有保护作用。并且在DSS诱导前通过尾静脉注射Sdcl进行预处理产生的效果较DSS诱导后注射Sdcl进行处理的效果更显着(DAI评分：F=559.328,P<0.001),提示Sdc1可能具有预防肠粘膜屏障缺陷产生的作用。而尾静脉注射pcDNA3.0空白对照质粒后小鼠结肠炎症症状与DSS对照组相比差别并不显着。提取不同处理组小鼠肠系膜淋巴结、肝、脾组织样本的基因组DNA进行荧光定量PCR检测,计算其中的细菌含量。PBS对照组小鼠的肠系膜淋巴结、肝、脾组织无细菌易位发生。与PBS对照组相比,单纯DSS处理组小鼠肠系膜淋巴结、肝、脾样本中的细菌16S rDNA含量升高,菌群检测为阳性,发生细菌易位。并且在DSS处理组内,从肠系膜淋巴结、肝、脾中检测到的细菌含量呈现逐渐减少的趋势(P<0.05)。在肠系膜淋巴结检测到的细菌中,以肠球菌属、双歧杆菌属、拟杆菌属为主,其次分别为梭菌属和肠杆菌属。在肝脏检测到的细菌中,肠杆菌属、拟杆菌属和梭菌属较多,其次为肠球菌属和双歧杆菌属。在脾脏检测到的是肠球菌属和肠杆菌属。在叁种组织中,均未检测到乳酸杆菌属的细菌。尾静脉注射Sdcl质粒上调Sdcl表达水平后,叁种组织中的菌群总数和各亚属的数量均呈现减少的趋势(P<0.05),尤其以脾脏最为显着,在脾脏中均未检测到任何细菌。以上结果提示Sdcl能够抑制体内屏障缺陷模型的细菌易位。6.Sdcl与紧密连接蛋白ZO-1、occludin在细胞中的表达及分布相似利用免疫荧光染色从细胞水平观察Sdc1与ZO-1、occludin的细胞内定位,结果发现Sdcl和ZO-1、occludin分布位置相似,均以细胞膜上分布为主。Caco-2细胞上调Sdcl表达后,Western blot检测结果提示ZO-1和occludin的表达水平均升高；HT29细胞敲除Sdc1表达后,ZO-1和occludin的表达水平也均有一定程度的降低。7.Sdcl通过激活Stat3信号通路调控ZO-1和occludin的表达在高表达Sdcl的细胞中,Stat3发生705位酪氨酸磷酸化修饰,提示Stat3信号通路被激活。利用IL-6刺激HT29细胞诱导Stat3通路被激活,或通过带有Stat3持续活化型质粒的慢病毒载体感染细胞诱导Stat3通路的持续活化后,ZO-1(F=5471.716,P<0.001)和occludin (F=151.487, P<0.001)的表达均显着增高,mRNA和蛋白水平的变化保持一致,并且与Sdcl高表达细胞中ZO-1和occludin的改变一致。通过感染带有Stat3显性负性突变型质粒的慢病毒载体阻断Stat3的转录活性后,细胞中ZO-1和occludin的表达水平均减少(P<0.001)。如果在阻断Stat3转录活性同时再感染Sdc1慢病毒载体上调Sdcl表达,Sdc1对ZO-1和occludin的表达调控作用就被削弱,提示Sdcl是通过Stat3通路的介导从而发挥对ZO-1和occludin的调控作用的。8. Stat3信号通路参与Sdcl对肠上皮屏障功能的维护在细胞中阻断Stat3转录活性的同时上调Sdcl的表达水平,检测Sdcl表达水平改变前后肠上皮单层屏障模型的功能变化。结果提示：单独阻断Stat3的转录活性,单层上皮屏障功能受损,表现为TEER值下降(F=83.270,P<0.001),大肠杆菌易位(t=3.954,P=0.017)及FD4透过增加(t=11.143,P<0.001)。尽管Sdcl能够维持细胞的TEER值在较高水平,抑制细菌易位和FD4的跨膜转运,但当Stat3通路被阻断时,Sdcl的上述保护作用就被削弱。9. Stat3能直接结合ZO-1和occludin的启动子生物信息学预测发现：在人类ZO-1和occludin基因及其转录起始位点上游约10 kb以内的DNA序列中,可以找到多个类似Stat3结合核心序列(TTCCGGAA)的DNA序列,被认为是潜在的Stat3的DNA结合位点,随后利用ChIP实验验证其是否位于ZO-1或occludin的启动子区域。结果提示：在ZO-1转录起始位点上游-199～-208 bp、-394--404 bp处,occludin转录起始位点上游-4458■4469 bp、-5385-5394 bp、-7056-7066 bp处分别找到若干个与Stat3分子DNA结合序列最相似的序列,ChIP-PCR显示ZO-1和occludin基因的启动子序列通过Stat3-ChIP得到了富集(P<0.05),证明Stat3可以与ZO-1和occludin的启动子结合。当Caco-2细胞高表达Sdcl时,Stat3向ZO-1和occludin启动子区域的募集显着增加(P<0.01)。在HT29细胞中敲除Sdcl后,Stat3的募集相对减少(P<0.01)。这些结果表明,Sdc1能够激活Stat3分子发生磷酸化,Stat3能够直接靶向结合ZO-1和occludin的启动子,叁者表达水平呈正相关。对结果5所述的动物实验中的肠粘膜蛋白进行Western blot检测,发现尾静脉注射Sdc1表达质粒组小鼠的肠粘膜中Sdc1及ZO-1、occludin蛋白表达水平增加的同时,Stat3信号通路也被激活,Stat3分子被显着磷酸化,体内、外结果保持一致。10. ZO-1与occludin具有相互作用,反馈调节Sdc1表达Co-IP实验提示免疫沉淀的ZO-1复合体中可以检测到occludin蛋白的存在,同样,在免疫沉淀的occludin复合体中也可以检测到ZO-1蛋白的存在；而ZO-1和occludin与作为阴性对照的IgG蛋白不发生任何结合作用,表明ZO-1和occludin二者能够发生相互作用,构成免疫复合体。在HT29细胞中,敲除ZO-1或occludin蛋白,Sdc1的表达水平呈反馈性增加。提示叁者可能构成负反馈环路,共同参与对肠上皮屏障功能的维持。结论1、Sdc1对肠上皮屏障的维护具有保护作用,表现为能够显着稳定上皮的完整性、抑制细菌易位和降低跨膜转运的通透性；2、Sdcl能够在体外提高紧密连接蛋白缺陷细胞的单层上皮屏障功能；3、Sdcl能够在体内缓解DSS诱导的屏障缺陷及细菌易位；4、Sdcl与紧密连接蛋白ZO-1、occludin在细胞中的表达同步、分布相似；5、Sdcl能够激活Stat3信号通路,磷酸化的Stat3直接结合ZO-1和occludin的启动子区域,调控ZO-1和occludin的转录,从而参与Sdc1对屏障功能的维护；6、ZO-1与occludin具有相互作用,构成免疫复合体,能负反馈调节Sdc1表达,共同构成环路维护屏障功能保持正常。(本文来源于《南方医科大学》期刊2015-03-20）
康新,梁正凯,路小光,范治伟,吕畅[7]（2014）在《大黄附子汤对重症急性胰腺炎肠粘膜上皮细胞线粒体超微结构和离子泵的作用研究》一文中研究指出目的探讨大黄附子汤对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肠黏膜上皮细胞线粒体离子泵Na~+-K~+-ATP酶和Ca~(2+)-ATP酶以及线粒体超微结构的影响及意义。方法 72只健康SD大鼠,采用随机数字表法分成3组:对照组、重症急性胰腺炎组(模型组)及大黄附子汤治疗组(治疗组),每组24只,每组再按1、3、6、12h分为四个亚组(n=6)。对照组开腹翻动胰腺数次后关腹。模型组、治疗组均经胰胆管注入5%牛磺胆酸钠(4ml/kg)建立SAP模型。造模后0、4、8h对照组和模型组采用0.9%生理盐水,治疗组采用大黄附子汤保留灌肠(量均1ml/100g)。各组按各时间点处死动物前股静脉取血测血清淀粉酶、肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)及二胺氧化酶(DAO)水平;处死后利用差速离心法提取线粒体,并测定肠黏膜上皮细胞线粒体Na~+-K~+-ATP酶、Ca~(2+)-ATP酶水平;透射电镜观察肠黏膜上皮细胞线粒体结构变化,同时光镜下观察胰腺、小肠病理组织学变化。结果与对照组相比,模型组大鼠术后3、6、12h血清iFABP和DAO均有不同程度升高(P<0.05 or P<0.01),肠黏膜上皮细胞线粒体Na~+-K~+-ATP酶(术后1、3、6、12h,P<0.05 or P<0.01)、Ca~(2+)-ATP酶(术后3、6、12h,均P<0.01)均明显降低;透射电镜示模型组较对照组大鼠肠黏膜上皮细胞线粒体超微结构损伤严重。经大黄附子汤干预治疗后,治疗组大鼠较模型组肠黏膜上皮细胞线粒体Na~+-K~+-ATP酶(术后1、3、6、12h,P<0.05 or P<0.01)、Ca~(2+)-ATP酶(术后3、6、12h,P<0.05 or P<0.01)均增高,线粒体结构损伤显着减轻,血清iFABP和DAO亦显着降低(术后3、6、12h,P<0.05 or P<0.01)。结论大黄附子汤通过升高SAP时肠黏膜上皮细胞线粒体离子泵Na~+-K~+-ATP酶、Ca~(2+)-ATP酶活性,维护肠黏膜上皮细胞及其线粒体超微结构,降低血清iFABP、DAO水平。(本文来源于《2014第十届全国中西医结合灾害医学学术大会江苏省中西医结合学会灾害医学、重症医学专业委员会成立大会暨健康产业成果展示洽谈会学术论文集》期刊2014-09-13）
邢茜,江荣林,马伟斌,雷澍,王灵聪[8]（2014）在《参附注射液对严重脓毒症大鼠肠粘膜上皮细胞紧密连接的影响》一文中研究指出【目的】严重脓毒症时,由于胃肠道缺血缺氧导致肠粘膜上皮细胞紧密连接受损,参附注射液可改善组织的微循环以及氧代谢,因此本实验研究参附注射液对脓毒症模型大鼠肠粘膜上皮细胞紧密连接的影响。方法将50只SD大鼠以随机数字表法分别入选假手术组(Sham)、脓毒症模型组(CLP)、参附注射液低、中、高剂量组(LSF、MSF、HSF)各10只。Sham组大鼠打开腹腔后予缝合,其余组大鼠采用盲肠结扎穿孔法制备严重脓毒症模型。Sham组和CLP组分别以生理盐水腹腔注射,其余叁组分别以参附注射液5ml/Kg、10ml/kg、20ml/kg腹腔注射。剔除死亡的大鼠,饲养12h后取血清及回肠组织,分别检测血清TNF-α、DAO、D-乳酸,回肠黏膜损伤程度和超微结构,肠粘膜上皮细胞紧密连接蛋白Claudin-3、ZO-1及其m RNA。结果 CLP组较Sham组的血清TNF-α、DAO以及D-乳酸的浓度显着升高,回肠黏膜损伤Chiu’s评分显着增高,紧密连接蛋白Claudin-3、ZO-1及其m RNA表达水平显着降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);LSF、MSF、HSF组与CLP组比较,上述各项指标均有显着改善(均P<0.05),且HSF组较MSF组、MSF组较LSF组的改善作用均更为显着(均P<0.05),Sham组的回肠黏膜上皮绒毛排列整齐,上皮细胞紧密连接连续,各细胞器和微绒毛完整;CLP组回肠黏膜绒毛破坏明显,绒毛顶端上皮细胞脱落,上皮下毛细血管充血,中央乳糜管扩张,细胞间紧密连接不连续,间隙增宽,微绒毛变细变短,部分断裂。LSF组、MSF组和HSF组与CLP组比较回肠粘膜上皮细胞绒毛排列基本规则,紧密连接连续,尤其HSF组细胞间紧密连接清晰可见。结论以5、10、20ml/kg腹腔注射参附液后可明显改善严重脓毒症模型大鼠发生异常改变的血清TNF-α、DAO、D-乳酸和回肠粘膜上皮细胞紧密连接蛋白Claudin-3、ZO-1的表达,以及回肠粘膜上皮细胞紧密连接结构,且这些作用的强度与参附注射液的剂量成正比。(本文来源于《变化与应对——2014年浙江省重症医学学术年会论文汇编》期刊2014-09-11）
康新,梁正凯,路晓光,范治伟,吕畅[9]（2014）在《大黄附子汤对重症急性胰腺炎肠粘膜上皮细胞线粒体超微结构和离子泵的作用研究》一文中研究指出目的探讨大黄附子汤对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肠黏膜上皮细胞线粒体离子泵Na~+-K~+-ATP酶和Ca~(2+)-ATP酶以及线粒体超微结构的影响及意义。方法 72只健康SD大鼠,采用随机数字表法分成3组:对照组、重症急性胰腺炎组(模型组)及大黄附子汤治疗组(治疗组),每组24只,每组再按1、3、6、12h分为四个亚组(n=6)。(本文来源于《中华医学会急诊医学分会第17次全国急诊医学学术年会论文集》期刊2014-08-07）
吴本娟[10]（2014）在《HO-1/hUC-MSCs对受损肠粘膜上皮细胞修复作用及其机制的研究》一文中研究指出目的：1.探讨体外人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的分离、培养、纯化及鉴定方法。2.探讨TNF-a处理Caco-2细胞建立体外肠黏膜上皮损伤模型的方法。3.探讨血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)基因修饰的hUC-MSCs对受损肠黏膜上皮细胞的保护作用及其发挥这一作用的机制。方法：1.采用直接组织块法分离培养脐带间充质干细胞,用细胞表型、成脂成骨诱导分化方法鉴定：将带有荧光标记绿色荧光蛋白和HO-1基因的质粒与腺病毒重组,将重组的腺病毒转染入hUC-MSCs中,形成稳定表达的HO-1/hUC-MSCs,通过荧光显微镜下观察绿色荧光的含量和通过RT-PCR技术检测HO-1mRNA的含量来验证HO-1是否转染入细胞内并进行了过表达。2.采用Caco-2细胞来模拟肠粘膜上皮以期研究肠粘膜上皮细胞的一些结构和功能的变化。应用TNF-α处理Caco-2细胞建立肠粘膜上皮损伤模型。通过免疫荧光技术、RT-PCR技术和Western blot技术验证了本实验条件下TNF-α的最佳浓度和处理时间。3.将HO-1、hUC-MSCs及HO-1/hUC-MSCs通过Transwell、室进行间接共培养,采用RT-PCR技术证明了Ad-HO-1转入了细胞并进行了大量的表达,同时采用免疫荧光、RT-PCR及Western blot技术检测Caco-2细胞上紧密连接蛋白的形态及Occludin与ZO-1的含量变化,采用ELISA方法检测IL-10及IL-6等细胞因子的变化。结果：1.培养的第叁代hUC-MSCs细胞大多数表达CD29-CD44,几乎不表达或很少表达CD34、CD45。2.分别应用INF-α以0μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L的浓度及0h、6h、12h和24h的时间处理Caco-2细胞,通过免疫荧光技术、RT-PCR技术和Western blot技术验证了本实验条件下TNF-α的最适浓度是100μg/L,最佳处理时间是24h。3.实验分六组,第一组：单纯CaCo-2细胞；第二组：CaCo-2细胞+TNF-α；第三组：CaCo-2细胞+TN F-α+Ad-HO-1；第四组：CaCo-2细胞+TNF-α+hUC-MSCs；第五组：CaCo-2细胞+TNF-α+hUC-MSCs+Ad-HO-1:第六组：CaCo-2细胞+TNF-α+HO-1/hUC-MSCs。荧光显微镜下观察CaCo-2细胞间紧密连接蛋白的完整性发生变化,表现为紧密连接断裂,表达荧光数量减少：与第二组相比,第一、叁、四、五、六组的红色荧光与绿色荧光均有所增加,且第六组明显多于叁、四、五组；RT-PCR检测发现：与第二组相比,第一、叁、四、五、六组的Occludin mRNA口ZO-1mRNA表达差异倍数都大于1,第六组与第叁、四、五组相比,差异倍数也均大于1,具有统计学意义；Western blot检测发现：与第二组相比,第一、叁、四、五、六组的Occludin和ZO-1蛋白表达量均增高,且第六组明显多于第叁、四、五组,具有统计学意义；ELISA检测发现：与第二组相比,第叁、四、五、六组的IL-6水平下降,而IL-10水平上升,尤以第六组最明显,有统计学意义,而第一组表达极低。结论：1.采用直接组织块法分离培养获得高纯度、高含量及状态好的脐带间充质干细胞；将带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白和HO-1基因的重组质粒并进行腺病毒包装后,将重组腺病毒转染入脐带间充质干细胞中,可以形成稳定表达的HO-1/hUC-MSCs。2.在体外用Caco-2细胞建立稳定的肠粘膜上皮模型。3.采用Transwell小室成功建立“目的细胞”与Caco-2细胞的间接共培养体系；HO-1、hUC-MSCs、HO-1+hUC-MSCs和HO-1/hUC-MSCs可以促进肠上皮紧密连接蛋白及mRNA的表达,降低炎性因子的释放和促进抗炎因子的释放,从而保护肠粘膜上皮细胞。而HO-1/hUC-MSCs对上述的保护作用强于单纯HO-1、hUC-MSCs及HO-1+hUC-MSCs。(本文来源于《天津医科大学》期刊2014-05-01）
肠粘膜上皮论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:构建稳定的沙门氏菌表达载体,在此基础上构建鼠伤寒沙门氏菌spv基因回补株并研究其稳定性。体外建立鼠伤寒沙门氏菌感染Henle-407的细胞模型,观察沙门菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制。为探讨鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spvC致病机制提供理论和实验依据,并为后续利用动物模型进行该基因功能的研究提供工具和手段。方法:一、鼠伤寒沙门氏菌spv基因荧光回补株的构建及其稳定性的研究。以低拷贝克隆载体pACYC-184为基础,根据GenBank数据库中公布的eGFP基因序列,上游增加Trc Promoter启动子,下游增加rrnB ribosomal终止子,两端位点上、下游序列设计相应酶切位点,采用多重PCR的方法合成pACYC184-eGFP载体,并依次调取及克隆aphA-hok-parDE基因和spv基因,构建得到pACYC184-eGFP-HOK载体、pACYC184-spvB-eGFP-HOK载体及pACYC184-spvC-eGFP-HOK载体,分别电转化入对应的鼠伤寒沙门氏菌spv基因缺陷变异株得到相应的回补株,并对质粒的稳定性及荧光蛋白表达情况进行检测。二、沙门氏菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制的研究。携带spv基因(Salmonella plasmid virulence genes)的野生型鼠伤寒沙门氏菌211、敲除spvC的缺陷变异株(ST211-△-e-spvC)及回补株(ST211-c-spvC)与Henle-407细胞共培养,取不同干预时间点的细胞进行实验。荧光显微镜观察细胞核形态学改变和胞内菌数量;Promega荧光素酶发光法检测Caspase3/7活性;Western blot法检测ERK和p-ERK表达水平;胞内集落形成单位的检测采用平板菌落计法。结果:一、鼠伤寒沙门氏菌spv基因回补株的构建及其稳定性的研究。1.经PCR及基因测序证实成功构建鼠伤寒沙门菌spvB、spvC基因荧光回补株。2.含有低拷贝质粒的回补株在连续培养12代或144h都未发生丢失,在细菌感染细胞模型中用荧光显微镜可观察到细菌带绿色荧光。二、沙门氏菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制的研究。1.荧光显微镜下ST211感染组与ST211-c-spvC感染组细胞在4h出现大量的细胞核呈波纹状或折缝样、部分染色质凝聚等早期细胞凋亡形态学改变,而ST211-△-e-spvC感染组及空白对照组无明显凋亡形态学改变。感染24h,ST211感染组与ST211-c-spvC感染组细胞的染色质高度凝聚边缘化、产生凋亡小体并出现大量以坏死为特征的形态学改变,ST211-△-e-spvC仅部分细胞存在凋亡、坏死形态学改变。2.Caspase-3/7活性检测结果显示,各组Caspase-3/7活性随感染时间的延长而升高,0h和4h,叁个感染组间的Fluorescence值无明显差异(P>0.05);感染后4h,细菌感染组较空白对照组出现显着差异(P<0.01);感染的8h、12h和24h,ST211-△-e-spvC感染组较ST211-eGFP感染组和ST211-c-spvC感染组的Fluorescence值有差异(P<0.05)。3.p-ERK蛋白的比值分别为(24h;空白对照组,0.89±0.03;ST211-eGFP感染组,0.12±0.02;ST211-△-e-spvC感染组,0.74±0.05;ST211-c-spvC感染组,0.11±0.04),ST211-eGFP感染组与ST211-c-spv C感染组的p-ERK蛋白的比值较ST211-△-e-spvC感染组显着降低(P<0.01)。4.共培养的前4h,组间胞内活菌数无明显差异(P>0.05)。在干预后8h、12h和24h,ST211-eGFP感染组与ST211-c-spvC感染组胞内活菌数高于ST211-△-e-spvC感染组(P<0.05)。结论:1.高度稳定且含有绿色荧光蛋白标签的沙门氏菌表达载体及spv基因回补株构建成功,为深入研究鼠伤寒沙门菌毒力基因的功能奠定了基础。2.沙门菌质粒毒力基因spvC可通过诱导细胞凋亡促进细菌在宿主细胞内的存活和增殖,进而加重细胞损伤,这一作用可能与其影响ERK的磷酸化水平有关。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
肠粘膜上皮论文参考文献
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