王富强张继波孔令菊刘建生郑德宇
(辽宁医学院解剖学教研室辽宁锦州121001)
【摘要】目的：通过深低温冻存自行构建的人工植骨材料多孔羟基磷灰石(hydroxyapatiteceramic,HA)/骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs)修复兔颅骨缺损，探讨深低温冻存(Cryopreservation)方法对保存HA复合植骨材料的可行性，以方便临床使用。方法：应用无菌培养法获得BMSCs与羟基磷灰石HA复合培养，获得复合植骨材料培养构成人工植骨材料。应用-80℃保存3个月的HA/BMSCs修复兔颅骨12mm缺损模型，同时以未行低温冻存的HA/BMSCs及单纯的HA分别为对照组1和2。在术后第12周进行大体观察、X线观察和HE染色等组织学观察。结果：BMSCs与多孔HA构建出人工植骨材料，BMSCs在HA表面生存良好。三组模型在术后12周实验组和对照1组的骨缺损处愈合大部，有成熟骨小梁通过，有的可见髓腔通畅，塑形较好；对照2组骨痂生成少，骨缺损部分愈合，塑形欠佳，新骨生成有统计学差异（P值<0.05）。结论：低温冻存的复合植骨材料的骨缺损修复能力与新制作的复合材料几乎一致，没有因为冻存而受到影响。
【关键词】骨髓间充质干细胞羟基磷灰石支架材料复合物低温冻存颅骨缺损
【中图分类号】R322-33【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）08-0392-03
前言
临床上，创伤、肿瘤以及感染等疾患引起的大块骨缺损相当普遍，骨缺损的治疗一直是骨科难题之一[1-2]，国内外学者进行了广泛的实研究与临床实践。异种、同种异体、自体及人工合成物质作为修复材料在免疫排斥、材料来源、医学伦理及继发感染等方面的问题目前尚难消除另[3]。应用组织工程的方法构建人工植骨材料是修复大面积骨缺损的有效方法，但是根据骨组织工程方法，从设计、细胞培养等到最后获得组织工程骨需要复杂的过程，体外构建需要一定的时间，不能满足临床上即刻应用骨缺损修复的要求[4-5]。同时，随着组织工程研究的深入，组织工程产品的产业化、市场化的需要使其保存也成为新的研究课题，探索标准化的保存方法，研究组织工程骨的有效保存技术对于组织工程开发和临床应用至关重要[6-8]。在以往的研究中，有低温保存颅骨骨瓣修复颅骨缺损获得成功的报道[9]。本研究拟低温保存自行构建的羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)/骨髓间充质干细胞(bonemarrowderivedmesenchyamlstemcell,BMSCs)修复兔颅骨缺损，探讨深低温冻存下的HA支架材料复合物修复骨缺损的能力以及深低温保存支架材料复合物的可行性。
1.实验材料与方法
1.1实验动物日本大耳白乳兔5只，健康2月龄日本大耳白兔18只，体重2kg，雌雄不限，由辽宁医学院动物实验中心提供。
1.2实验方法
1.2.1骨髓间充质干细胞的分离培养无菌条件下从1日龄健康乳兔股骨和胫骨中分离培养BMSCs，用完全培养基（青霉素200u/ml,链霉素200mg/mg,DMEM,15%FBS）冲洗减去两端骨骺的骨干，所得冲洗液1200r/min离心10分钟，吸弃上清，所得细胞沉淀以1×106/ml密度接种于培养瓶中，于37℃、5%CO2条件下的培养箱内进行，72小时半量换液，以后每2天换液一次。待细胞相互融合达80%生长面积时用0.25%胰蛋白酶进行第一次传代培养。
1.2.2复合植骨材料的构建取106个BMSCs，约1ml与预先用DMEM培养液中浸泡24h后的无菌HA柱（直径1.2cm,厚约2mm）共培养7天。应用扫描电镜观察BMSCs在HA表面的形态、生长状况及胶原分泌情况。
1.2.3复合植骨材料的冻存与复苏将培养1周的支架材料复合物移入含有DMEM保存液(10%DMSO，20%FBS的DMEM培养基)的冻存管中，于4℃环境预冷1h后，将冻存管置于-80℃冰箱中保存3个月。3个月后，取出冻存管，快速置于37℃水浴箱中快速复温至保存液完全融化,置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养过夜。将部分标本应用扫描电镜观察BMSCs在HA表面的形态、生长状况。
1.2.4实验动物造模及复合支架移植在无菌条件下分别应用冻存后的复合材料（实验组）、新制备的复合材料（对照1组）和单纯HA（对照2组）修复兔颅骨1.2cm缺损。术后前3天，连续肌注青霉素80万单位/天，分二次注射。术后12周处死动物，并进行大体观察、X－线检测和HE染色检测骨缺损修复水平。
1.3统计学分析
采用SPSS16.0软件包进行统计学处理，实验数据以均数x-±s标准差表示；组间计量资料行配对t检验，P＜0.05为有统计学意义。
2.实验结果
2.1原代BMSC的培养
原来培养的BMSCs在接种的前3天，并没有明显的细胞贴壁，从第4天开始，在培养瓶的底部能看到一些多角形的细胞或分散存在或聚在一起(图1A)。此后的一周内，细胞的数量开始逐渐增加，直到14左右，细胞相互融合到一起，多平行排列，细胞呈长梭形(图1B)。BMSCs传代后，细胞的生长速度较原代培养快，大约在8天左右能达到80%融合。
图1原代培养的BMSCs
A:原代培养第4天，可见细胞呈多角形散在分布在培养瓶底部。B：原代培养第14天，细胞呈长梭形，平行排列。
2.2HA复合成骨诱导后BMSCs构成的复合植骨材料应用成骨诱导的BMSCs与多孔HA共培养7天后，扫描电位观察BMSCs在HA表面的生长状态。在多孔HA的表面，可见BMSCs伸出了突起，相互接触，彼此连接成片，有的细胞已经伸入到HA的孔隙内。在部分BMSCs之间有丝状纤维连接，在细胞表面也可见到有大小不等的白色钙质颗粒（2A）。复合植骨材料冻存并复苏后，多孔HA的表面及孔隙内的BMSCs的状态与冻存前并没有明显的区别，细胞也没有从HA表面脱落的趋势（2B）。
图2HA和BMSCs构成的植骨材料A：BMSCs与HA复合培养7天，BMSCs在HA表面生长状态良好，通过突起互相连接在一起，在细胞表面可见到白色的颗粒状物质。B：BMSCs与HA复合培养7天，冻存3个月，复苏后培养1天。BMSCs在HA表面的生长状况良好，并没有从HA表面脱落的趋势。细胞表面可见到散在的白色颗粒状物质。
2.3复合材料原位成骨结果
术后所有动物全身状况良好，正常进食。切口无红肿及渗出液，部分动物术区周围有一定程度的肿胀，虽然未进行特殊处理，这些肿胀也逐渐自行消退。无动物死亡的现象发生，所有动物均计入实验统计。
2.3.1大体观察：手术后第12周：实验组和对照1组植骨材料完全被骨样组织包裹，并形成连续性骨痂，塑形较好。对照2组的支架材料与自体骨间界限模糊，结合处被骨痂包绕，在某些植骨材料的表面多为纤维样组织包裹。
2.3.2X线观察术后12周：实验组与对照1组可见支架材料大部分已经与自体骨融合，只有少许的透光区；材料内部的密度较周围正常骨高，但有些部位接近正常组织。有连续性骨样组织通过断端(见图3A、B)；对照2组材料与周围颅骨的边界仍较清楚，骨痂量少，塑形欠佳；支架内部的密度明显高于周围骨组织，说明改建不良，内部的低密度透光区也较多，说明骨形成不良(见图3C)。
图3术后12周的X线片
A：实验组，植骨材料与骨缺损间连在一起，内部出现透光区。B：对照1组，植骨材料与周围骨组织的密度相近，内部有透光区，骨痂样结构减少。C：对照2组，植骨材料的界限仍然清晰可见，骨缺损的边缘还有大量的骨痂样组织。
2.3.3组织学观察
术后的所有时间中，在材料周围均未发现明显的炎性细胞浸润的情况。
术后12周：A组、B组支架材料与自体骨之间可见大量新生骨组织，有规则骨小梁通过，局部可见有少量的皮质骨形成，内部可见小血管。C组支架材料与自体骨间也见新生骨组织但较少且骨质薄，中间的空隙多数为纤维结缔组织相连，近骨断端侧有骨小梁形成，但尚没有与HA表面的组织形成有效的连接、贯通(图4)。
图4术后12周植骨材料的HE染色
A：实验组，在复合植骨材料内部可见有部分HA降解，内部的骨岛形成增加，小血管常见偶见骨髓再生。B：对照1组，在植骨材料的内部的新骨形成，HA降解程度明显，呈岛状包裹在新骨中，在骨质中可见小血管和骨髓。C：对照2组，在羟基磷灰石表面，薄层骨质较8周时增厚，但仍未能充添整个缝隙中，其余部分是纤纤维结缔组织，HA内部降解明显增多。
HA：羟基磷灰石，B：骨组织，F：纤维结缔组织，V：小血管，M：骨髓
讨论
应用自体骨是修复骨缺损的金指标，但由于各种原因造成的大范围的骨缺损难以获得足够的自体骨缺损修复材料。应用组织工程的方法可以获得较理想的骨缺损修复材料，但是从组织工程骨的设计到获得能应用的人工植骨材料需要一个漫长的过程，不能满足即刻应用的目的[10-12]。所以部分研究者和临床工作者开始将目光转向组织工程骨的保存上。虽然临床上有应用冻存自体颅骨骨瓣修复的报道，但对于组织工程骨的报道较少。本实验室以往的研究表明HA复合自体的BMSCs具有良好的骨缺损修复效果，但这种复合材料在冻存后是否还具有骨缺损修复效果也不清楚。本实验将骨缺损修复材料在－80℃冻存3个月后，应用冻存后材料修复颅骨缺损，于术后12周，通过大体观察，X－线检测和HE染色的方法，可以初步证实冻存后的植骨材料的骨缺损修复效果与新构建的植骨材料的骨缺损修复效果相似，明显优于单纯的HA的骨缺损修复效果。颅骨的最大载荷结果也与上述的实验结果一致，应用冻存后的材料修复的颅骨的载荷与新构建的植骨材料一致。可见应用低温冻存方法可以简单有效的保存HA支架材料复合物，可以满足临床上即刻应用的要求。
低温冻存技术的发展，在许多新的领域具有很大的发展空间和潜力，但也有许多关键环节需要更深入的探讨。本实验仅对深低温冻存3个月的支架材料复合物进行初步研究，延长冻存时间或者增加冻存保护剂或者改变冻存方式（玻璃化冻存），尹宏宇等[13]实验证明，对于组织工程骨而言，玻璃化冻存是更具有发展潜力的深低温保存方法。蓝旭[14]研究了冻存保护剂对低温保存的组织工程骨修复骨缺损的影响，发现选择适宜的冻存保护剂对组织工程骨的生物活性有一定的保护作用。随着科学实验和技术的发展，研究各类细胞、组织、器官的低温耐受性和生物材料的传热规律的成熟，寻求减轻损伤的技术，最终会实现器官的低温保存[15-16]。
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