导读:本文包含了人内皮抑素基因论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:内皮抑素,子宫内膜癌HEC1B细胞,细胞凋亡,聚ADP核糖聚合酶-1
人内皮抑素基因论文文献综述
宫莹莹[1]（2017）在《内皮抑素对子宫内膜癌HEC1B细胞凋亡及PARP-1和caspase-3基因表达的影响》一文中研究指出目的:通过重组对子宫内膜癌HEC1B细胞增殖、凋亡影响情况的检测及聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)基因在子宫内膜癌HEC1B细胞中表达的检测,探讨内皮抑素在子宫内膜癌发生、侵袭和转移中可能的作用机制,以及能否调控PARP-1和caspase-3的表达诱导子宫内膜癌HEC1B细胞凋亡。方法:用终浓度为10、50、100、200 mmol·L-1的内皮抑素分别干预子宫内膜癌HEC1B细胞作为实验组,无任何药物处理的子宫内膜癌HEC1B细胞作为阴性对照组。培养48、72 h后,用溴化四唑蓝比色(MTT)法检测各组子宫内膜癌HEC1B细胞增殖情况;采用Hoechst33258荧光染色法检测子宫内膜癌HEC1B细胞凋亡情况;用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测子宫内膜癌HEC1B细胞培养上清液中PARP-1和caspase-3表达水平的变化。用SPSS 18.0软件对上述实验结果进行统计学分析。结果:1.MTT实验结果显示,对照组48 h、72 h细胞增殖抑制率分别为(6.24±0.39)%、(5.63±0.41)%,终浓度为10、50、100、200 mmol·L-1的内皮抑素的实验组48 h、72 h细胞增殖抑制率分别为(6.98±0.52)%、(8.96±0.54)%,(14.36±1.02)%、(23.16±2.45)%,(24.31±2.06)%、(29.48±2.81)%,(28.16±2.13)%、(38.49±0.68)%。与对照组比较,实验组各药物浓度下不同培养时间HEC1B细胞的增殖抑制率均显着升高(P<0.01),且HEC1B细胞的增殖抑制率随着培养时间的延长及药物浓度的增加而增大(P<0.05或P<0.01)。2.Hoechst33258荧光染色法检测结果显示,内皮抑素干预子宫内膜癌HEC1B细胞72 h后,荧光染色可见,与对照组比较,实验组中更多细胞出现细胞核固缩、细胞核碎裂、凋亡小体形成及荧光强度增强等凋亡特征。3.用ELISA法检测50、100、200 mmol·L-1内皮抑素干预的实验组子宫内膜癌HEC1B细胞培养上清中PARP-1的表达量均低于对照组,caspase-3的表达量均明显高于对照组(P<0.05或P<0.01),且呈现一定的浓度依赖性。结论:1.内皮抑素可抑制子宫内膜癌HEC1B细胞的增殖,并促其凋亡。2.子宫内膜癌细胞的增殖抑制率随着药物作用时间的延长逐渐增加。3.子宫内膜癌细胞的增殖抑制率随着内皮抑素药物浓度的增加而增加。4.其机制可能与下调HEC1B细胞PARP-1基因表达及上调caspase-3基因表达从而诱导子宫内膜癌HEC1B细胞凋亡有关。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2017-09-25）
艾静[2]（2017）在《慢病毒载体介导内皮抑素基因转染内皮祖细胞抑制视网膜新生血管的研究》一文中研究指出第一部分 细胞实验--重组慢病毒LV-Endostatin-GFP载体的建立及体外转染内皮祖细胞实验目的内皮抑素(Endostatin,ES)是作用最强的抑制血管生长的因子之一,不影响正常组织周围的血管,而且无毒性和耐药性,增加内源性ES的表达可能成为抑制视网膜新生血管化的一种治疗措施。而同时基于移植健康的EPC已成为了治疗视网膜新生血管疾病的新途径,本研究旨在体外实验构建ES高表达内皮祖细胞株,检测ES高表达对VEGF表达的影响和EPC细胞功能的影响,为动物实验做准备。材料与方法大鼠心脏采血,用密度梯度离心法获取单个核细胞,并将细胞接种于纤维蛋白包被过的培养皿中,常规培养于内皮祖细胞专用培养基(EGM-2-MV)中。分别利用流式细胞术及免疫荧光法鉴定内皮祖细胞。用PCR方法得到Endostatin序列片段,将Endostatin基因插入含绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体质粒(LV5-EF1a-GFP+PURO),通过叁个辅助质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5),采用脂质体 Lipofectamine 2000介导的脂质体转染方法共转染人胚肾HEK293T细胞,获得重组慢病毒(LV-Endostatin-GFP),感染大鼠EPC,使得基因整合入EPC中并持续表达,然后采用最佳筛选浓度的嘌呤霉素溶液进行筛选,以获得稳定转染Endostatin基因的EPC细胞株。通过实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法和蛋白质印迹法(Western blot)验证Endostatin在EPC细胞的表达。同时测定Endostatin转染对于VEGF表达的变化。检测内皮祖细胞转染前后的细胞活性(增殖能力、迁移率、分化能力、凋亡和细胞周期)。结果构建重组慢病毒载体(LV-Endostatin-GFP),转染内皮祖细胞后,利用最佳筛选浓度的嘌呤霉素(1μg/ml,4天),成功构建携带内皮抑素基因的内皮祖细胞稳转株。qRT-PCR和Western blot试验显示Endostatin在EPC细胞中表达明显增高(P<0.001),但VEGF的表达水平明显下降(p<0.05)。内皮祖细胞转染前后细胞的活性检测发现Endostatin高表达可抑制细胞活性,与阴性对照组相比,Endostatin高表达内皮祖细胞增殖率明显下降(P<0.001),迁移率明显下降(O<0.01)和分化能力明显下降(P<0.001),凋亡率明显增高(P<0.001);流式细胞仪检测Endostatin高表达后细胞分裂停留在G1期明显增多(P<0.001),而S和G2期细胞则显着减少(P<0.001),细胞生长明显受到抑制。而阴性对照组细胞活性未见明显影响。结论EPC细胞可以被携带内皮抑素基因的慢病毒载体(LV-Endostatin-GFP)转染并高表达内皮抑素,VEGF的分泌显着减少,同时Endostatin高表达可促使EPC凋亡,降低EPC的增殖、迁移及分化能力,细胞生长受到抑制,从而降低细胞活性。而阴性对照组细胞活性没有受到影响,说明转染过程本身没有对细胞的活性造成影响。转染了内皮抑素基因的EPC细胞可能通过分泌内皮抑素发挥细胞内的直接及旁分泌作用(抑制VEGF的分泌),从而抑制血管生成的作用。但体外实验结果须动物实验加以验证。第二部分 动物实验——玻璃体腔注射携带Endostatin基因EPC抑制大鼠视网膜新生血管生成的实验研究实验目的本研究以慢病毒-内皮抑素(LV-ES)体外转染外周血EPC后的细胞(ES-EPCs)移植入大鼠视网膜新生血管模型,探讨EPC导向的内皮抑素基因抑制视网膜新生血管生成的可行性和有效性,为抑制视网膜新生血管疾病血管生成的基因治疗提供依据。材料与方法新生7d(P7)的SD大鼠分为两大组:一组暴露于70%高氧环境5天,另一组为正常环境空白对照。分别于鼠龄P14,P15,P17,P19时用眼底血管造影(FFA)观察视网膜新生血管形成,确定氧诱导的的视网膜病变(OIR)模型的构建。又将模型大鼠随机分为四组,于出生后第14天(P14)四组大鼠经玻璃体腔注入相同体积的质粒或细胞(分别为空载LV,LV-ES,EPC以及LV-ES-EPC)。并设置同龄幼鼠置空白对照组。每组选3只大鼠,于注射后第1h、1d、3d、5d进行活体FFA的检测,比较各组新生血管的渗漏面积(于检测当日注射荧光素钠),于注射后5 d进行活体FFA检测后处死,取右眼进行组织切片,利用苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin,HE)染色法,观察并计数突破视网膜内界膜的视网膜新生血管内皮细胞核数。并通过免疫组化方法(ICC)检测视网膜新生血管组织的Endostatin、VEGF、CD31 及 CD133 的表达。结果FFA检查发现,实验组荧光素明显渗漏,对照组未见荧光渗漏,说明视网膜新生血管形成,OIR模型成功建立.FFA结果显示:注射LV-ES(OIR+ESOE)组:与空白对照组比,荧光渗漏每个时间点都没有显着性差异,说明新生血管被显着抑制;与NC组(注射空载LV)比,荧光渗漏在第3天(P<0.01)和第5天(P<0.001)显着减少,说明OIR+ES OE组显着抑制新生血管。注射EPC(OIR+EPCs)组:与空白对照比,每个时间点,荧光渗漏增加(P<0.05);与NC比,每个时间点没有统计学差异;与OIR+ESOE组比,1天(P<0.05),3天(P<0.01),5天(P<0.001)荧光渗漏均增加,说明OIR+EPCs组确实没有抑制新生血管的作用,但不会促进血管渗漏及新生血管形成。注射LV-ES-EPC(OIR+ES-EPCs)组:与空白对照组比,每个时间点荧光渗漏都没有显着性差异,说明新生血管被显着抑制;与NC比,第5天时荧光渗漏显着减少(P<0.001);与OIR+ESOE组比,每个时间点荧光渗漏均无显着性差异,说明OIR+EPCs组有与OIR+ESOE 一样的抑制新生血管的作用;与OIR+EPCs组比,1天(P<0.05),3天(P<0.01),5天(P<0.001)荧光渗漏均显着减少,说明OIR+ES-EPCs组有明显抑制新生血管的作用。HE结果:空白对照组,视网膜新生血管较少;与空白对照组比,OIR+NC和OIR+EPCs组血管内皮细胞核明显增多(P<0.01),说明新生血管显着增多,与NC比,OIR+ES-OE和OIR+ES-EPCs组血管内皮细胞核显着减少(P<0.05),说明新生血管显着减少;与OIR+ESOE组比,OIR+EPCs组血管内皮细胞核明显增多(P<0.05),说明新生血管显着减少;与OIR+EPCs组比,OIR+ES-EPCs组血管内皮细胞核明显减少(P<0.01),说明新生血管显着减少。ICC结果显示:Endostatin的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC组表达减少(P<0.05);与 NC 比,OIR+ES-OE 和 OIR+ES-EPCs 组表达增多(P<0.01);与 OIR+ES OE 组比,OIR+EPCs 组表达减少(P<0.05);与 OIR+EPCs 组比,OIR+ES-EPCs 组表达增多(P<0.05)。VEGF的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC组表达增多(P<0.05);与NC比,OIR+ES-OE,OIR+EPCs 和 OIR+ES-EPCs 组表达没有显着差异;OIR+ES-OE,OIR+EPCs和OIR+ES-EPCs叁组也没有显着性差异。CD31的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC和OIR+EPCs组表达增多(P<0.05);与 NC 比,OIR+ES-OE 组表达减少(P<0.05);与 OIR+ES-OE 组比,OIR+EPCs组表达显着增多(P<0.05);但和OIR+EPCs组比,OIR+ES-EPCs组表达没有显着差异。CD133的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC,OIR+EPCs组和OIR+ES-EPCs组表达减少(P<0.05);与NC比,OIR+ES-OE组表达增加(P<0.05);与OIR+ES-OE组比,OIR+EPCs 和 OIR+ES-EPCs 组表达显着减少(P<0.05);但和 OIR+EPCs组比,OIR+ES-EPCs组表达没有显着差异。结论FFA法,HE染色和ICC法的联合研究证实,Endostatin基因转染的EPC可明显抑制视网膜新生血管生成,单纯的EPC不会促进新生血管的形成,为视网膜新生血管疾病新治疗方向提供依据。(本文来源于《浙江大学》期刊2017-09-01）
姜秋颖,金英华,张冉冉,陈春红,黄大勇[3]（2016）在《重组人血管内皮抑素联合紫杉醇化疗对人乳腺癌MDA-MB-435细胞抗凋亡基因Bcl-2的影响》一文中研究指出目的探讨重组人血管内皮抑素(恩度)联合紫杉醇对人乳腺癌MDA-MB-435细胞抗凋亡基因Bcl-2的影响。方法将BALB/c裸鼠32只进行细胞培养,随机分为4组,其中3个化疗组(恩度组、紫杉醇组及恩度联合紫杉醇组)和1个对照组,每组8只。化疗组为腹腔注射给药,第1、8天各给药1次,给药剂量:恩度10 mg/kg、紫杉醇注射液10 mg/kg。对照组腹腔注射生理盐水,第1、8天各注射1次。给药15 d后处死小鼠并取出瘤体,将瘤体组织行HE染色和免疫组化SP法染色。原位末端标记法检测细胞凋亡,并计算癌细胞凋亡指数(AI)。结果恩度组、紫杉醇组及恩度联合紫杉醇组Bcl-2表达均显着低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。恩度联合紫杉醇组Bcl-2表达分别显着低于恩度组、紫杉醇组,差异有统计学意义(P<0.05)。恩度组、紫杉醇组及恩度联合紫杉醇组AI均显着高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。恩度联合紫杉醇组AI分别显着高于恩度组、紫杉醇组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论抗凋亡基因Bcl-2可能参与了乳腺癌的发生、发展过程,恩度联合紫杉醇化疗可降低Bcl-2表达,促进乳腺癌细胞凋亡,因此,Bcl-2水平检测在恩度联合紫杉醇治疗乳腺癌效果及预后评估中有重要的参考价值。(本文来源于《中国医药导报》期刊2016年35期）
陈蓉,余辉,安艳丽[4]（2016）在《表达内皮抑素基因的内皮祖细胞治疗肝癌的初步研究》一文中研究指出目的 :观察内皮抑素(endostatin,ES)基因转染的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)对小鼠肝癌细胞H22增殖的影响,探讨联合自体EPCs和ES基因治疗肝癌的可行性和有效性。方法:构建表达ES基因的慢病毒载体,培养小鼠骨髓源EPCs,运用q PCR检测培养内皮细胞表面标记CD31、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)、血管性血友病因子(von Willebrand factor,v WF)表达,电镜观察内皮细胞特征小体。实验分EPCs组、EPCs+LV空病毒载体组、EPCs+ES组。CCK-8法检测各组细胞增殖的情况。同时构建原位肝癌小鼠模型,尾静脉注射3组细胞后不同时间点处死小鼠,测量肿瘤大小并进行统计分析。结果:(1)酶切和测序、PCR鉴定证实成功构建慢病毒载体p Lenti6.3-ES-Monomer-Ds Red;(2)q PCR显示培养细胞表达内皮细胞标志CD31、VEGFR、v WF,透射电镜下在细胞质内可见多个散在内皮细胞特征性WeibelPalade小体(WP小体);(3)慢病毒载体Lenti6.3-ES-Monomer-Ds Red转染小鼠骨髓源性EPCs后荧光显微镜下可见细胞呈红色荧光;EPCs+ES组细胞上清较对照组上清液对小鼠肝癌细胞H22体外增殖具有明显抑制作用,体内实验显示EPCs+ES组肝癌生长速度慢于对照组。结论:小鼠骨髓源单个核细胞体外可以诱导培养为内皮祖细胞,负载ES基因的EPCs体外可以抑制小鼠肝癌细胞H22的增殖,体内可以抑制小鼠肝癌生长。(本文来源于《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊2016年10期）
周宇,简嘉,王志刚,许燕[5]（2016）在《中性微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡携内皮抑素基因经超声转染治疗裸鼠乳腺癌种植瘤的实验研究》一文中研究指出目的研究中性微泡(NMB)、阳离子微泡(CMB)及靶向阳离子微泡(CMB105)携内皮抑素(ES)质粒在超声作用下转染治疗MDA-MB-231细胞裸鼠种植瘤,观察其对肿瘤模型生长的影响及治疗作用。方法 18只裸鼠均注射MDA-MB-231细胞悬液建立种植瘤模型,随机分为3组(NMB组、CMB组及CMB105组),每组6只。NMB、CMB及CMB105携ES质粒在超声作用下转染MDA-MB-231种植瘤,每只裸鼠左侧肿瘤接受治疗,右侧肿瘤为对照。治疗前和治疗后每3 d观察记录肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线;治疗后15 d处死裸鼠,剥取肿瘤计算抑瘤率,行荧光定量聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹法分别检测Endostatin m RNA及蛋白表达情况。结果于转染后12 d开始,CMB组和CMB105组治疗侧肿瘤生长均受到抑制。转染后15 d,CMB105组治疗侧抑瘤率为(53.18±5.69)%,明显高于CMB组治疗侧[(27.57±3.02)%]和NMB组治疗侧[(10.63±1.47)%],差异均有统计学意义(均P<0.05)。CMB组和CMB105组ES m RNA及蛋白表达增加,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论携载ES质粒的CMB105在超声作用下其抗肿瘤治疗效应明显优于携载ES质粒的CMB及NMB,可在一定程度上延缓裸鼠种植瘤生长。(本文来源于《临床超声医学杂志》期刊2016年05期）
许燕[6]（2015）在《超声辐照阳离子微泡介导内皮抑素基因治疗视网膜新生血管的实验研究》一文中研究指出第一部分普通脂质及阳离子微泡制备及性能检测目的构建普通脂质微泡(NMB)、阳离子微泡(CMB),并检测其基本物理特征；比较NMB和CMB携载内皮抑素质粒(pEZ-M46-ES)的能力。方法采用机械震荡法构建两种不同的脂质微泡,通过在成膜材料中加入DC-胆固醇(DC-cholesterol)使微泡表面带正电荷从而构建阳离子微泡(CMB),光镜下观察不同微泡基本形态,并检测其浓度、粒径、表面电位及载基因能力等基本特性。结果NMB、CMB均成功构建,光镜下大小均一,分散度较好；其表面电荷、粒径及浓度分别为+25.62±4.38 mV,1.64±0.28μm,4.16±0.18×109/ml。固定微泡的浓度为5×108/ml,两者的载基因量分别为2.01±0.74μg和19.02±0.76μg。结论NMB及CMB制备成功。第二部分超声辐照阳离子微泡介导内皮抑素基因转染人视网膜血管内皮细胞目的研究NMB、CMB携内皮抑素质粒在超声作用下转染HRECs细胞转染效率,以及对细胞周期、体外血管成型及细胞迁移的影响。并与脂质体载体进行对比。方法实验分组：①空白对照组(C)②质粒+普通离子微泡+超声辐照组(NMB)③质粒+脂质体组(L)④质粒+阳离子微泡+超声辐照组(CMB)。①组以空白对照组,②组以超声辐照普通微泡介导内皮抑素基因转染作为阳性对照,③组以脂质体2000介导基因转染作为阳性对照,④组以超声辐照阳离子微泡介导内皮抑素基因进行转染。超声(1 MHz,1 W/cm2, and 50% duty cycle (DC),30 seconds)作用下转染HRECs,转染后收集细胞行流式细胞检测转染效率及细胞周期,qPCR及Western-blot分别检测endostatin, VEGF. bcl-2和bcl-xl mRNA及蛋白表达情况,通过体外血管成型及细胞迁移评价内皮抑素质粒在不同载体介导转染后的治疗效果。结果 各组转染pEZ-M46-ES质粒后24h基因转染率分别为：1.20±0.21%,28.25±0.57%,30.74±7.50%和41.8±8.90%；转染后24h及48h流式细胞术检测细胞周期显示CMB组处于G1期的细胞较其他各组明显增多；MTT检测结果显示CMB组对HRECs的生长曲线较其他各组有明显抑制作用；qPCR及Western blot检测显示CMB组endostatin mRNA及蛋白表达较其他各组明显增加,而VEGF、bcl-2和bcl-xl的mRNA及蛋白表达较其他各组明显减少；各组HRECs形成网状新生血管的数量分别为26.47±3.52,15.17±1.52,13.19±3.43,8.42±1.02个；各组HREC细胞迁移数量分别为：30±1.57,22.4±2.07,21.6±2.17,15.4±2.7个。结论与普通脂质微泡和脂质体作为基因载体相比,CMB组基因转染效率明显提高；普通脂质微泡与脂质体也可增加基因转染效率,但两者基因转染效率无明显差别。超声辐照微泡介导内皮抑素基因转染HRECs,可明显抑制体外血管成型及细胞生长、增殖及迁移。第叁部分 内皮抑素基因对小鼠视网膜新生血管的抑制作用目的分别以脂质体、普通微泡和阳离子微泡作为基因载体,后两者联合超声辐照,介导内皮抑素基因转染小鼠视网膜,比较其抑制新生血管的效果并探讨其可能机制。方法分别将普通微泡,脂质体及阳离子微泡与pEZ-M46-ES质粒进行孵育,得到载基因的脂质体或微泡。采用高浓度氧诱导C57BL/6J小鼠建立OIR (Oxygen-inducedretinopathy,氧诱导视网膜病变)动物模型。将60只视网膜新生血管模型小鼠,随机分为以下3组：①质粒+普通离子微泡+超声辐照组(NMB)②质粒+脂质体组(L)③质粒+阳离子微泡+超声辐照组(CMB)。①组以超声辐照普通微泡介导内皮抑素基因转染,②组以脂质体2000介导基因转染,③组以超声辐照阳离子微泡介导内皮抑素基因转染。小鼠视网膜新生血管模型建造后用微量注射器按以上分组右眼玻璃体腔注射基因及载体复合物2μl,①、③组在注射后立即使用超声辐照眼球。左眼作为对照组(C)。于注射后5天行视网膜组织切片HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目；注射后5、14、28d激光共聚焦显微镜下观察各组pEZ-M46-ES的荧光表达强度,qPCR法检测各组视网膜组织中endostatin、VEGF、bcl-2和bcl-xl mRNA的表达情况,Western blot法检测各组视网膜组织中endostati、VEGF、bcl-2和bcl-xl的蛋白表达情况。结果视网膜组织切片HE染色结果示CMB组小鼠突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数较其他各组显着减少,各组细胞核个数分别为：41.7±6.1,26.1±1.4,23.1±3.5,16.4±1.2个。激光共聚焦显微镜下观察并计算视网膜色素上皮层荧光强度所有数值的平均值,统计结果显示,转染后5及14d, NMB组、L组及CMB组的pEZ-M46-ES荧光表达强度均逐渐增强,转染后28d各组pEZ-M46-ES荧光表达强度较第14d减弱,CMB组与NMB组及L组相比有统计学差异；NMB组与L组在转染后5d及14d两组之间的荧光表达强度无明显统计学差异,但在转染后28d, NMB组的pEZ-M46-ES荧光表达强度较L组强,其差异具有统计学意义。视网膜组织qPCR及Western blot检测显示CMB组endostatin的mRNA及蛋白表达较其他各组明显增加,而VEGF、bcl-2和bcl-xl的mRNA及蛋白表达较其他各组明显减少。结论超声辐照阳离子微泡介导内皮抑素基因转染与普通微泡及脂质体相比可显着加强对小鼠视网膜新生血管生成的抑制作用。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2015-05-01）
杨益金[7]（2015）在《人与鼠源内皮抑素基因合成和原核表达及功能验证》一文中研究指出目的：血管内皮抑素最初是从小鼠血管内皮瘤细胞株的培养基中分离纯化而来,一种内源性血管生成抑制剂,是胶原蛋白18C末端的一个片段,能特异性地抑制新生血管内皮细胞的增殖从而抑制血管的增生,内皮抑素不影响已生成成熟血管的功能,因此是一种理想的新生血管生成抑制剂,在临床上用于抑制肿瘤血管生成从而达到肿瘤治疗目的,重组内皮抑素主要通过大肠杆菌原核表达系统获得,其中绝大部分是以包涵体形式存在。人与鼠源内皮抑素基因具有高度的同源性和相似的生物学功能。本文将确定人与鼠源内皮抑素基因并构建不同表达标签的原核表达载体探讨内皮抑素的可溶性表达以及验证重组人源内皮抑素对新生血管的抑制作用。方法：根据文献报道和NCBI数据库确定Human Endostatin ( IE)和Mouse Endostatin (ME) DNA序列,DNA合成法分别获得人与鼠源内皮抑素基因,加入不同酶切位点设计引物,进行PCR扩增后胶回收,分别与携带谷胱甘肽巯基转移酶(GST)表达标签的原核表达质粒pGEX-4T1和携带硫氧还蛋白A(TrxA)表达标签的原核表达质粒pET-32a进行双酶切处理、T4DNA连接酶连接,构建原核表达质粒pGEX-4T1-HE 和 pET-32a-ME,将两种质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达,确定人与鼠源内皮抑素的诱导表达条件,将诱导后的菌液超声破碎,离心后上清和沉淀分别进行蛋白电泳确定蛋白分布,将内皮抑素包涵体洗涤、变性、复性、浓缩后获得重组蛋白,最后通过鸡胚绒毛尿囊膜实验验证人源重组内皮抑素蛋白的抗血管生成活性。结果：测序分析表明成功合成人与鼠源内皮抑素基因,通过PCR扩增确定人与鼠源内皮抑素基因大小为560bp左右,与理论符合,通过分子克隆分别将人与鼠源内皮抑素基因连接进入原核表达质粒pGEX-4T1和pET-32a,经PCR、双酶切、测序分析显示原核表达载体pGEX-4T1-HE和 pET-32a-ME构建成功,在37℃,1mmol/LIPTG浓度下,大肠杆菌BL21(DE3)中人、鼠源内皮抑素成功表达,通过SDS-PAGE分析,与空白组相比,实验组出现目的条带,其中人源内皮抑素重组蛋白在46 kDa处出现,鼠源内皮抑素重组蛋白在39 kDa处出现,与理论相符,人与鼠源内皮抑素主要以包涵体形式表达,在破碎后的菌体上清中没有发现内皮抑素的分布,通过对包涵体的洗涤、纯化、复性获得人与鼠源重组内皮抑素蛋白,在鸡胚绒毛尿囊膜实验中,与对照组相比,实验组的血管数少,血管管径细。结论：研究结果表明获得了长度为554 bp的人源内皮抑素基因和长度为565 bp的鼠源内皮抑素基因,成功构建了人与鼠源内皮抑制素基因不同标签表达载体,在大肠杆菌中成功诱导表达。成功获得人与鼠源ES重组蛋白；CAM实验结果也证明了纯化复性后的人源重组蛋白能明显抑制新生血管的生长。我们的研究结果也表明TrxA标签和GST标签对增进重组ES可溶表达没有显着差异,两组标签的重组蛋白都主要存在于包涵体内。(本文来源于《广西医科大学》期刊2015-05-01）
张春梅,郭玉平,郝豪皓,季旸,吴向菊[8]（2015）在《超声微泡介导内皮抑素基因转染人脐静脉内皮细胞的实验研究》一文中研究指出目的探讨超声微泡介导内皮抑素(endostatin,ES)基因对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)转染的效率及可行性。方法 HUVECs种于24孔板内,培养24 h后加入5μg p IRES2-EGFP-ES质粒及超声造影剂Sono Vue微泡,启动超声照射进行转染,设定MI分别为0.7、1.0、1.5,辐照时间分别为10 s、30 s、60 s、120 s,微泡浓度分别为10%、20%、50%。转染24 h后观察绿色荧光蛋白表达,计数活细胞数,MTT检测细胞增殖抑制率。结果超声爆破微泡介导了内皮抑素基因转染HUVECs,并具有强度、时间及微泡浓度依赖关系,但随着强度、微泡浓度增加及辐照时间延长,细胞凋亡率增加、细胞活力下降,转染率随之下降,当超声强度MI1.5、辐照时间60 s、微泡浓度20%转染率相对最高。结论超声微泡可介导内皮抑素基因转染脐静脉内皮细胞,但转染受多因素影响,在相对最佳转染条件下可实现内皮抑素的高表达。(本文来源于《哈尔滨医科大学学报》期刊2015年02期）
常爱华,郑爱青,宋现让,王兴武,魏玲[9]（2014）在《HIF-1α RNA干扰与内皮抑素基因联合对肺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用》一文中研究指出目的探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)RNA干扰与内皮抑素(endostatin,ET)基因联合对人肺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法 SPCA1/HIF-1α(-)人肺癌细胞的裸鼠,给予脂质体-内皮抑素基因转染,观察转然瘤组织7、14、21天的HIF-1α、内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达及微血管生成数量。结果 HIF-1α RNA干扰明显降低瘤组织内VEGF蛋白表达;HIF-1α RNA干扰、ET及联合治疗均显着抑制肿瘤微血管生成;至接种后21天,HIF-1α RNA干扰ET联合组肿瘤体积为(312.7±78.6)mm3,抑瘤率为64.3%,与对照组比(P<0.01)显着高于HIF-1α RNA干扰组(39.8%)和单用内皮抑素组(43.1%)。结论 HIF-1α RNA干扰与ET基因联合应用,显着抑制人肺癌裸鼠移植瘤生长。(本文来源于《华南国防医学杂志》期刊2014年12期）
邵佳甲,于音,姜涛[10]（2014）在《体外构建内皮抑素基因真核表达载体抑制血管生成》一文中研究指出背景:胶质瘤的根除治疗至今仍是一大难题,抗血管生成治疗胶质瘤有望成为新的有效途径。目的:证实内皮抑素在体外对血管生长的抑制作用,为今后利用其抑制肿瘤生长奠定实验室基础。方法:取Wistar大鼠肝脏,提取mRNA后利用RT-PCR获取内皮抑素cDNA片段。碱裂解法小量提取质粒pcDNA3。重组质粒pcDNA3-Endo的构建。重组pcDNA3-Endo真核表达载体转染骨髓间充质干细胞。RT-PCR及Western Blot检测内皮抑素基因的表达。MTT法检测ECV-304细胞增殖抑制实验。体外实验共分成4个组:重组质粒组、空载质粒组、脂质体对照组及空白对照组。结果与结论:成功构建pcDNA3-Endo重组真核表达质粒,pcDNA3-Endo质粒能在体外有效转录并分泌内皮抑素基因,转染了外源pcDNA3-Endo质粒的ECV-304细胞增殖明显受到抑制。结果提示内皮抑素基因能在体外有效抑制血管内皮细胞的增殖。(本文来源于《中国组织工程研究》期刊2014年29期）
人内皮抑素基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
第一部分 细胞实验--重组慢病毒LV-Endostatin-GFP载体的建立及体外转染内皮祖细胞实验目的内皮抑素(Endostatin,ES)是作用最强的抑制血管生长的因子之一,不影响正常组织周围的血管,而且无毒性和耐药性,增加内源性ES的表达可能成为抑制视网膜新生血管化的一种治疗措施。而同时基于移植健康的EPC已成为了治疗视网膜新生血管疾病的新途径,本研究旨在体外实验构建ES高表达内皮祖细胞株,检测ES高表达对VEGF表达的影响和EPC细胞功能的影响,为动物实验做准备。材料与方法大鼠心脏采血,用密度梯度离心法获取单个核细胞,并将细胞接种于纤维蛋白包被过的培养皿中,常规培养于内皮祖细胞专用培养基(EGM-2-MV)中。分别利用流式细胞术及免疫荧光法鉴定内皮祖细胞。用PCR方法得到Endostatin序列片段,将Endostatin基因插入含绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体质粒(LV5-EF1a-GFP+PURO),通过叁个辅助质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5),采用脂质体 Lipofectamine 2000介导的脂质体转染方法共转染人胚肾HEK293T细胞,获得重组慢病毒(LV-Endostatin-GFP),感染大鼠EPC,使得基因整合入EPC中并持续表达,然后采用最佳筛选浓度的嘌呤霉素溶液进行筛选,以获得稳定转染Endostatin基因的EPC细胞株。通过实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法和蛋白质印迹法(Western blot)验证Endostatin在EPC细胞的表达。同时测定Endostatin转染对于VEGF表达的变化。检测内皮祖细胞转染前后的细胞活性(增殖能力、迁移率、分化能力、凋亡和细胞周期)。结果构建重组慢病毒载体(LV-Endostatin-GFP),转染内皮祖细胞后,利用最佳筛选浓度的嘌呤霉素(1μg/ml,4天),成功构建携带内皮抑素基因的内皮祖细胞稳转株。qRT-PCR和Western blot试验显示Endostatin在EPC细胞中表达明显增高(P<0.001),但VEGF的表达水平明显下降(p<0.05)。内皮祖细胞转染前后细胞的活性检测发现Endostatin高表达可抑制细胞活性,与阴性对照组相比,Endostatin高表达内皮祖细胞增殖率明显下降(P<0.001),迁移率明显下降(O<0.01)和分化能力明显下降(P<0.001),凋亡率明显增高(P<0.001);流式细胞仪检测Endostatin高表达后细胞分裂停留在G1期明显增多(P<0.001),而S和G2期细胞则显着减少(P<0.001),细胞生长明显受到抑制。而阴性对照组细胞活性未见明显影响。结论EPC细胞可以被携带内皮抑素基因的慢病毒载体(LV-Endostatin-GFP)转染并高表达内皮抑素,VEGF的分泌显着减少,同时Endostatin高表达可促使EPC凋亡,降低EPC的增殖、迁移及分化能力,细胞生长受到抑制,从而降低细胞活性。而阴性对照组细胞活性没有受到影响,说明转染过程本身没有对细胞的活性造成影响。转染了内皮抑素基因的EPC细胞可能通过分泌内皮抑素发挥细胞内的直接及旁分泌作用(抑制VEGF的分泌),从而抑制血管生成的作用。但体外实验结果须动物实验加以验证。第二部分 动物实验——玻璃体腔注射携带Endostatin基因EPC抑制大鼠视网膜新生血管生成的实验研究实验目的本研究以慢病毒-内皮抑素(LV-ES)体外转染外周血EPC后的细胞(ES-EPCs)移植入大鼠视网膜新生血管模型,探讨EPC导向的内皮抑素基因抑制视网膜新生血管生成的可行性和有效性,为抑制视网膜新生血管疾病血管生成的基因治疗提供依据。材料与方法新生7d(P7)的SD大鼠分为两大组:一组暴露于70%高氧环境5天,另一组为正常环境空白对照。分别于鼠龄P14,P15,P17,P19时用眼底血管造影(FFA)观察视网膜新生血管形成,确定氧诱导的的视网膜病变(OIR)模型的构建。又将模型大鼠随机分为四组,于出生后第14天(P14)四组大鼠经玻璃体腔注入相同体积的质粒或细胞(分别为空载LV,LV-ES,EPC以及LV-ES-EPC)。并设置同龄幼鼠置空白对照组。每组选3只大鼠,于注射后第1h、1d、3d、5d进行活体FFA的检测,比较各组新生血管的渗漏面积(于检测当日注射荧光素钠),于注射后5 d进行活体FFA检测后处死,取右眼进行组织切片,利用苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin,HE)染色法,观察并计数突破视网膜内界膜的视网膜新生血管内皮细胞核数。并通过免疫组化方法(ICC)检测视网膜新生血管组织的Endostatin、VEGF、CD31 及 CD133 的表达。结果FFA检查发现,实验组荧光素明显渗漏,对照组未见荧光渗漏,说明视网膜新生血管形成,OIR模型成功建立.FFA结果显示:注射LV-ES(OIR+ESOE)组:与空白对照组比,荧光渗漏每个时间点都没有显着性差异,说明新生血管被显着抑制;与NC组(注射空载LV)比,荧光渗漏在第3天(P<0.01)和第5天(P<0.001)显着减少,说明OIR+ES OE组显着抑制新生血管。注射EPC(OIR+EPCs)组:与空白对照比,每个时间点,荧光渗漏增加(P<0.05);与NC比,每个时间点没有统计学差异;与OIR+ESOE组比,1天(P<0.05),3天(P<0.01),5天(P<0.001)荧光渗漏均增加,说明OIR+EPCs组确实没有抑制新生血管的作用,但不会促进血管渗漏及新生血管形成。注射LV-ES-EPC(OIR+ES-EPCs)组:与空白对照组比,每个时间点荧光渗漏都没有显着性差异,说明新生血管被显着抑制;与NC比,第5天时荧光渗漏显着减少(P<0.001);与OIR+ESOE组比,每个时间点荧光渗漏均无显着性差异,说明OIR+EPCs组有与OIR+ESOE 一样的抑制新生血管的作用;与OIR+EPCs组比,1天(P<0.05),3天(P<0.01),5天(P<0.001)荧光渗漏均显着减少,说明OIR+ES-EPCs组有明显抑制新生血管的作用。HE结果:空白对照组,视网膜新生血管较少;与空白对照组比,OIR+NC和OIR+EPCs组血管内皮细胞核明显增多(P<0.01),说明新生血管显着增多,与NC比,OIR+ES-OE和OIR+ES-EPCs组血管内皮细胞核显着减少(P<0.05),说明新生血管显着减少;与OIR+ESOE组比,OIR+EPCs组血管内皮细胞核明显增多(P<0.05),说明新生血管显着减少;与OIR+EPCs组比,OIR+ES-EPCs组血管内皮细胞核明显减少(P<0.01),说明新生血管显着减少。ICC结果显示:Endostatin的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC组表达减少(P<0.05);与 NC 比,OIR+ES-OE 和 OIR+ES-EPCs 组表达增多(P<0.01);与 OIR+ES OE 组比,OIR+EPCs 组表达减少(P<0.05);与 OIR+EPCs 组比,OIR+ES-EPCs 组表达增多(P<0.05)。VEGF的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC组表达增多(P<0.05);与NC比,OIR+ES-OE,OIR+EPCs 和 OIR+ES-EPCs 组表达没有显着差异;OIR+ES-OE,OIR+EPCs和OIR+ES-EPCs叁组也没有显着性差异。CD31的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC和OIR+EPCs组表达增多(P<0.05);与 NC 比,OIR+ES-OE 组表达减少(P<0.05);与 OIR+ES-OE 组比,OIR+EPCs组表达显着增多(P<0.05);但和OIR+EPCs组比,OIR+ES-EPCs组表达没有显着差异。CD133的表达情况:与空白对照组比,OIR+NC,OIR+EPCs组和OIR+ES-EPCs组表达减少(P<0.05);与NC比,OIR+ES-OE组表达增加(P<0.05);与OIR+ES-OE组比,OIR+EPCs 和 OIR+ES-EPCs 组表达显着减少(P<0.05);但和 OIR+EPCs组比,OIR+ES-EPCs组表达没有显着差异。结论FFA法,HE染色和ICC法的联合研究证实,Endostatin基因转染的EPC可明显抑制视网膜新生血管生成,单纯的EPC不会促进新生血管的形成,为视网膜新生血管疾病新治疗方向提供依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
人内皮抑素基因论文参考文献
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标签：内皮抑素; 子宫内膜癌HEC1B细胞; 细胞凋亡; 聚ADP核糖聚合酶-1;