导读:本文包含了美达霉素论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:美达霉素,糖基转移酶,调控蛋白,Red,ET无痕突变
美达霉素论文文献综述
杨婷婷[1]（2016）在《美达霉素生物合成中糖基转移酶Med-ORF8和调控蛋白Med-ORF10的机制研究》一文中研究指出美达霉素是一种芳香聚酮类抗生素,研究表明其具有潜在的抗菌、抗肿瘤等活性。其基因簇中med-ORF8编码C-糖基转移酶(C-glycoysltransferase, C-GT),催化一个稀有氨基糖胺与聚酮母核以C-C糖苷键的方式进行连接；另一基因med-ORF10编码一个小调控蛋白,参与美达霉素的生物合成调控,但机制未知。本文利用Red/ET无痕修饰、凝胶迁移、酵母双杂交等实验方法,对这两个功能基因med-ORF8和med-ORF10进行研究,内容包括以下几个方面：(1)通过点突变研究C-糖基转移酶Med-ORF8的作用机制将包含Med-ORF8在内多个C-GT与O-GT的基因序列进行比对分析,确定了几个明显的差异点,它们可能决定两类GT催化活性的差异。本研究对Med-ORF8中一个可能的活性位点(I~(307))进行点突变(I~(307)突变为D~(307)),以探究这种点突变是否会影响Med-ORF8的催化活性。本实验利用Red/ET重组、ccdB反向筛选的方法,将一个7基因(六个可能的糖基合成酶基因和一个糖基转移酶基因)共表达质粒pAYT55中的糖基转移酶基因med-ORF8替换成med-ORFS* (I~(307)突变为D~(307)),然后将med-ORF8替换后的质粒pAYT55*通过结合转移导入天蓝色链霉菌B135(据报道能够积累未糖基化的底物)中,对发酵产物进行HPLC/MS及HRMS分析。研究结果表明,链霉菌B135确实可以积累一种与美达霉素的母核结构一致的中间产物kalafungin;对照菌(B135/pAYT55)中可以产生美达霉素(pAYT55编码的糖基合成酶和糖基转移酶负责kalafungin的C-糖基化从而合成美达霉素)；菌株B135/pAYT55*依然能产生美达霉素,并没有新的化合物产生,说明我们突变的位点I~(307)可能并不是决定C-GT活性的关键性位点,尽管此位点在C-GT中具有高度保守性。(2)调控蛋白Med-ORF10与DNA之间的相互作用初探前期研究表明,med-ORF10是美达霉素生物合成基因簇中的一个正效调控基因,而且该基因簇中包含med-ORF10的调控靶基因。Med-ORF10具体的调控机制仍不清楚,但可确定它不含DNA-Binding结构域。已经研究发现Med-ORF10不能与靶基因之一med-ORF12的启动子结合。本研究通过凝胶阻滞实验来探究Med-ORF10是否可与另一个靶基因med-ORF29可能的启动子区域有直接结合作用：通过PCR的方式获得med-ORF29可能的启动子区域(149bp的DNA片段Pmed-ORF29),进行生物素标记,并检测标记效率。大量表达纯化获得Med-ORF10蛋白,并进行透析浓缩。然后将标记好的Pmed-ORF29与Med-ORF10蛋白质共孵育,通过非变性的聚丙烯酰氨凝胶电泳分离,最后利用化学发光法进行检测。结果表明,在目前的实验条件下,Med-ORF10与Pmed-ORF29之间并没有明显的结合作用。(3)利用酵母双杂交筛选与Med-ORF10相互作用的蛋白利用EMSA并没有确定能够与Med-ORF10蛋白相互作用的DNA区域,推测Med-ORF10的调控作用可能并不是通过与DNA直接作用来完成的,而是通过蛋白间的相互作用来间接的调控转录过程,因此,我们选择利用酵母双杂交实验来筛选可能与Med-ORF10有相互作用的蛋白质。首先,利用部分酶切法构建了美达霉素产生菌AM-7161的基因组文库,将酶切后的DNA片段连接到质粒pGBKT7上,组成“猎物”蛋白文库。然后,将med-OKF10基因克隆到另一个质粒pGADT7上,构建了“诱饵”质粒,并对诱饵质粒进行毒性和自激活检测。下一步,将“诱饵”质粒和“猎物”质粒都转到酵母宿主细胞Y2Hgold中,通过下游报告基因的表达情况来筛选目的蛋白,得到的阳性克隆质粒经测序得到其DNA序列。最终,我们获得了3个可能与Med-ORF10有相互作用的质粒,其插入片段所编码的结构域分别属于SPRY_PRY_TRIM76家族、PGRP家族、Amidinotransferases superfamily家族。(本文来源于《华中师范大学》期刊2016-05-01）
郭小霞[2]（2015）在《美达霉素生物合成相关基因的功能研究》一文中研究指出美达霉素是链霉菌产生的聚酮类抗生素,属于苯丙异色烷醌家族(benzoisochromanequinones),具有抗菌和抗肿瘤活性。它结构中含有两个相反的手性中心(C13S/C15R)。本研究以美达霉素生物合成中的后期结构修饰基因med-ORF9和调控基因med-ORF10为对象,展开功能和机制研究,内容如下:(一)关于后期结构修饰基因med-ORF9的功能研究根据GenBank公布的med-ORF9序列,同源性分析认为是编码烯酰还原酶的基因,推测参与美达霉素C15的R构型形成。1.med-ORF9*的功能校正以野生型美达霉素产生菌的基因组DNA为模板,通过PCR扩增med-ORF9基因,测序后发现该基因在野生菌中发生了无义突变(命名为med-ORF9*,相对于数据库中的med-ORF9),推测该基因功能已丧失,但该菌株中美达霉素依然产生,有可能med-ORF9*在美达霉素生物合成中已经不起作用(或不起主要作用)。为了验证野生菌中的med-ORF9*是否有功能,我们开展了基因校正实验:通过基因合成、PCR及亚克隆等分子手段,获得一个与GenBank中序列完全一致的med-ORF9基因。修正后的目的基因克隆在整合型质粒pIJ8600上,构建了 med-ORF9的超表达质粒;将该质粒通过接合转移导入到野生型美达霉素产生菌中,得到了 med-ORF9的超表达菌株。对med-ORF9的超表达菌株与野生型菌株发酵产物进行HPLC及质谱分析,发现校正基因med-ORF9的超表达导致美达霉素量明显增加,而推测为美达霉素手性异构体的物质产量则减少,说明这个校正过的基因可能在美达霉素的手性结构形成中起重要作用。2..med-ORF9*的敲除为了验证野生菌中的med-ORF9*是否有功能,本研究又进行基因敲除实验:以pYH7为载体构建了用于敲除med-ORF9,*的自杀型质粒,将自杀型敲除质粒通过接合转移导入到野生型美达霉素产生菌中,筛选获得了 med-ORF9*基因缺失突变菌株。将缺失突变株发酵产物进行HPLC分析,发现:与野生型菌株相比,缺失突变株还能产生美达霉素,说明这个发生点突变的基因已经丧失原来的烯酰还原酶功能。3.med-ORF9的原核表达为了进行体外酶学研究来验证med-ORF9的功能,我们对该基因进行原核表达:首先选择了 pRSET(A)和pET-28a(+)作为原核表达载体,宿主菌为BL21(DE3),构建了两组表达质粒:分别携带存在突变的med-ORF9*基因和修正了突变位点的med-ORF9基因。转入大肠杆菌宿主细胞进行诱导表达,并将表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测,发现存在突变的med-ORF9*基因不能表达,而修正了突变位点的med-ORF9的表达量虽然很低,但还可以检测到表达。(二)调控基因med-ORF10的作用机制med-ORF10是美达霉素生物合成途径中一个参与调控的小基因,前期研究显示该基因敲出后可降低美达霉素的产量,推测是个正调控基因,qRT-PCR分析显示med-ORF10的缺失突变对美达霉素基因簇上一个与手性中心形成相关基因med-ORF12的表达有显着影响。4.调控基因med-ORF10作用机制的研究为了进一步推测美达霉素基因簇中是否还有其它基因的表达受med-ORF10的调控,我们对野生菌和敲出菌中相关基因的转录进行了 qRT-PCR分析。结果显示med-ORF10敲出后,基因簇中许多基因的表达量受到影响(如med-ORF1、med-ORF8、med-ORF11 及 med-ORF12)。然而与预期相反,在 med-ORF10 敲出突变菌中,这些基因的表达量都有了不同程度的提高,如另一个正调控基因med-ORF11表达量提高了约70倍。为了验证med-ORF1、-ORF8以及-ORF12的转录是直接受控于med-ORF10还是直接受控于med-ORF11(有可能调控基因med-ORF11表达量的大量增加导致这几个基因表达量的升高),选取野生型菌株、med-ORF11敲出缺失菌株以及med-ORF11超表达菌株进行qRT-PCR验证。结果表明med-ORF11的过量表达不会导致相关基因表达量的大量增加。说明med-ORF10与美达霉素生物合成基因簇中某些基因的表达量改变直接有关,是美达霉素生物合成的调控基因。5.med-ORF10表达的原位检测和初步Med-ORF10免疫共沉淀实验前期实验中制备了med-ORF10的多克隆抗体,然而以此抗体检测野生菌株中该基因的表达情况时,没有检出预期的蛋白条带。为了提高检出该蛋白抗体的灵敏度,我们将Flag标签的编码序列连接在med-ORF10基因上,以整合型质粒pIJ8600为载体,构建了 med-ORF10的融合蛋白表达质粒(pHSL115),导入野生菌中。用Flag标签抗体进行检测,检出预期大小的目的蛋白。为了进一步研究med-ORF10的调控机制,选择Flag标签融合蛋白表达菌株AM7161/pHSL115进行免疫共沉淀实验,同时选择缺失med-ORF10的突变菌株LJ作为阴性对照。免疫共沉淀实验中,并没有检测到Flag-med10蛋白与美达霉素生物合成相关的两个酶Med-ORF8(糖基转移酶)和Med-ORF12(酮基还原酶)有明显结合。可能Med-ORF10蛋白本身就不以与其它蛋白结合的方式行使调控功能,也可能Med-ORF10蛋白是与Med-ORF8和Med-ORF12之外的蛋白结合,具体机制还需进一步研究。(本文来源于《华中师范大学》期刊2015-05-01）
郭小霞,江雅莉,李爱英[3]（2013）在《美达霉素合成途径中的一个小调控蛋白的融合表达》一文中研究指出链霉菌以其能产生大量的次级代谢产物而为人们所熟知,其次级代谢产物的合成是一个复杂的网络系统,有大量"途径特异性调控因子"参与其中,这些因子可以调控次级代谢产物的产生。随着越来越多的抗生素基因簇的克隆,在特定(本文来源于《2013年湖北省暨武汉微生物学会会员代表大会暨学术年会论文摘要集》期刊2013-11-21）
贺强,孙锐,李爱英[4]（2013）在《美达霉素的吡喃环形成相关基因的研究》一文中研究指出美达霉素是由链霉菌AM-7161产生的具有抗革兰式阳性细菌及多种肿瘤的聚酮类抗生素。其聚酮母核含有并联的两个芳香环和一个带有手性中心的吡喃环,其手性结构分别位于C3和C15。美达霉素结构中手性毗喃环与生物学活性相关,所以研究吡喃环形成对进一步了解美达霉素生物合成具有重要意义。目前,(本文来源于《2013年湖北省暨武汉微生物学会会员代表大会暨学术年会论文摘要集》期刊2013-11-21）
李乐,李爱英[5]（2013）在《抗肿瘤抗生素美达霉素合成途径中的糖基合成酶Med-15的原核表达》一文中研究指出芳香聚酮抗生素美达霉素具有抗肿瘤抗活,其生物合成中的C-糖基化步骤涉及两个过程:"安哥拉糖胺的合成"以及"安哥拉糖胺与聚酮糖苷C-C糖苷键连接"。安哥拉糖胺由脱氧己糖(DOH)途径产生,预测DOH途径后期由3-氨基在N-甲基转移酶催化下连接两个甲基。(本文来源于《2013年湖北省暨武汉微生物学会会员代表大会暨学术年会论文摘要集》期刊2013-11-21）
吕金[6]（2013）在《嗜碱放线菌功能基因以及美达霉素生物合成调控相关基因的研究》一文中研究指出为了开发和挖掘更多的微生物基因资源,人们一方面对极端环境微生物投入更多目光,因为这些极端微生物蕴含着具有独特生理特性的功能基因；另一方面,是对分离自普通陆地环境的微生物类群进行功能基因的研究,通过遗传工程技术对这些基因进一步加以开发和利用。本研究包括两个方面的内容：(1)对分离自极端环境的一株嗜碱放线菌(氧化微杆菌HSL10)进行产碱性蛋白酶的研究：我们建立了一种简化培养基(仅含有底物脱脂奶粉或干酪素和琼脂)对HSL10进行平板分析,首次发现氧化微杆菌HSL10可以分泌产生碱性蛋白酶,而脱脂奶粉较之干酪素是更适合的底物；我们利用HSL10的蛋白水解活性建立了一种新型的蛋白酶水解圈染色方法：利用考马斯亮蓝G250对HSL10产生的水解圈进行染色,对比度提高并形成更加清晰可见的水解圈。同时,此方法可对肉眼无法分辨的水解圈染色,形成同样对比清晰的水解圈；同时还可以使水解圈和浑浊圈界限清晰。我们对HSL10野生型菌株的碱性蛋白粗酶酶活进行初步分析发现：该酶最适反应温度为55℃,最适pH为9.0,可能具有较高的工业应用价值。同时,我们还对这个基因进行了成功克隆和表达。通过Blast比对分析表明,该基因与GenBank数据库中基因遗传距离差异明显,是一个尚未被报道的基因。(2)一种抗肿瘤抗生素产生菌中小调控蛋白的基因敲除：链霉菌AM-7161(Streptomyces sp. AM-7161)能够产生具有抗菌、抗肿瘤活性的抗生素美达霉素(medermycin)。目前为止,美达霉素的生物合成途径尚未完全阐明。Streptomyces sp. AM-7161的基因med-ORF10与Actinorhodin (ACT,放线紫红素)生物合成基因簇中表达的一种调控蛋白基因ac/VI-ORFA同源性相近,推测二者功能一致。前期在异源细胞(天蓝色链霉菌CH999)中比较野生美达霉素基因簇与敲除med-ORF10的突变基因簇的功能,发现目的基因敲除可以降低美达霉素的合成,但在野生菌AM-7161中一直未得到基因敲除突变菌。本实验中,我们成功对链霉菌AM-7161med-ORF10进行敲除并进行分子水平上的。野生型AM-7161和突变菌LJ(敲除med-OKF10的菌株)产素颜色发生明显差异：野生型AM-7161产素颜色为红褐色；而LJ的产素颜色为咖啡色；同时通过发酵液萃取物HPLC分析表明,二者在HPLC谱图也有明显差异。我们还对这个野生菌株产其它抗生素的情况进行初步研究：利用紫外诱变获一株抗菌活性提高3-4倍的突变菌,而HPLC检测发现这个突变菌抗菌活性的提高跟发酵液中一个未知的化合物的产量提高有相关性,我们也对个化合物结构做了初步分析和推测。(本文来源于《华中师范大学》期刊2013-05-01）
江雅莉[7]（2013）在《美达霉素生物合成途径中调控基因med-ORF10作用机制的初步研究》一文中研究指出链霉菌AM-7161(Streptomyces sp. AM-7161)能产生次级代谢产物美达霉素(medermycin)。美达霉素是一种聚酮类抗生素,具有潜在的抗菌抗肿瘤生物学活性。在美达霉素的生物合成基因簇中,med-ORF10基因是一个功能未知基因,前期研究推测其参与美达霉素合成的调控作用。本文围绕med-ORF10基因的调控机制展开初步研究,具体包括以下几个方面：1. med-ORF10对靶基因的表达调控前期半定量PCR实验已初步得出med-ORF10对同一基因簇中的酮基还原酶编码基因med-ORF12存在一定的调控作用。在这里我们利用实时荧光定量PCR进一步量化其调控效果：选取了美达霉素基因簇异源表达菌株CH999/pIK340(异源野生菌株)和敲除了med-ORF10的突变菌株CH999/pAYT64(异源突变菌株),提取两者的总RNA,将其反转录为cDNA,以看家基因23S rRNA基因作为内参,利用实时荧光定量PCR检测“异源野生菌株”和“异源突变菌株”中med-ORF12基因的转录水平变化。实验结果表明,med-ORF12在“异源突变菌株”中较“异源野生菌株”转录水平下降了约5倍,这与前期推测med-ORF10为一正调控基因相符,表明此基因在美达霉素合成基因簇中行使着重要的调控作用。2. med-ORF10基因的原核表达和抗体制备为了能进一步研究med-ORF10的调控机制,我们对med-ORF10基因进行原核表达和多克隆抗体的制备。首先从含有美达霉素合成全基因簇的pIK340质粒上PCR得到med-ORF10基因,将其克隆到pT7Blue载体上,亚克隆至表达载体pET28a(+)上,转化至表达菌株BL21(DE3)中,构建了原核表达系统BL21(DE3)/pHSL79。优化诱导表达条件获得高表达的可溶性Med-ORF10蛋白,大量纯化Med-ORF10蛋白,将纯化的Med-ORF10蛋白多次免疫新西兰大白兔和昆明小鼠制备多克隆抗体,通过Western blot检测抗体的特异性较高。3.研究Med-ORF10蛋白与靶基因启动子的相互作用前期实验表明,med-ORF10基因是一个正效转录调控基因,调节的靶基因之一为med-ORF12,且调控效果非常明显,但具体调控机制也还未确定。我们试图通过凝胶迁移阻滞实验(EMSA)检测Med-ORF10蛋白是否与med-ORF12的启动子区域直接结合发挥其调控作用。首先得到med-ORF12启动子Pmed-ORF12片段,对其进行生物素标记。将纯化透析的Med-ORF10蛋白与标记了的Pmed-ORF12共孵育,混合物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；转膜后X光曝光显示,在目前条件下Med-ORF10蛋白与Pmed-ORF12无明显结合现象,推测二者可能无直接相互作用,或二者即便有直接相互作用,但结合的条件较为苛刻。(本文来源于《华中师范大学》期刊2013-05-01）
李爱英[8]（2012）在《抗肿瘤抗生素美达霉素的生物合成与调控》一文中研究指出抗癌新药的研发对于癌症治疗是非常重要的。芳香聚酮抗生素美达霉素作为一种新颖的烷化试剂可以阻断多种肿瘤细胞的信号传导。野生菌中美达霉素生物合成机制有待阐明,且产量极低。美达霉素生物合成基因簇已经克隆,基因簇中存在合成相关的结构基因和多个调节基因。我们对其中几个生物合成基因及其调控基因已进行功能分析和初步的机制研究:美达霉素结构中手性吡喃环与生物学活性相关,推测基因簇中一个手性专一性酮基还原酶编码基因参与C3手性形成,通过种间互补和多基因共表达实验对此基因进行了功能验证;美达霉素生物合成末期是糖基化修饰,利用基因敲除和互补验证了一个糖基转移酶基因的功能,并构建糖基合成酶表达体系,对抗生素进行糖基修饰;利用基因敲除和超表达对基因簇中一个SARP蛋白基因进行功能测定,证明此基因作为正调控因子参与美达霉(本文来源于《2012年鄂粤微生物学学术年会——湖北省暨武汉微生物学会成立六十年庆祝大会论文集》期刊2012-10-08）
万娟,江雅莉,黄璐瑶,曾爱兵,王慧利[9]（2012）在《利用核糖体再生因子构建美达霉素高产菌》一文中研究指出核糖体再生因子在蛋白翻译过程中起重要作用,主要是在翻译终止后参与tRNA从核糖体上解离,使得核糖体得到重复利用。该基因的超表达可以提高蛋白产量,调节多种生理功能。链霉菌抗生素在野生菌中的合成表达往往较低,核糖体再生因子作为一个促进蛋白表达的基因,可以作为一个多效调控因子在抗生素合成过程中发挥作用。鉴于抗肿瘤抗生素美达霉素产量较低,我们首先在美达霉素野生菌中克隆了核糖体再生因子,序列分析为一个新基因;构建了一个链霉菌超表达质粒,导入(本文来源于《第四届全国微生物基因组学学术研讨会论文集》期刊2012-08-01）
王蔚[10]（2012）在《美达霉素生物合成基因簇中几个调控基因与结构基因的功能研究》一文中研究指出聚酮类抗生素美达霉素(medermycin)是链霉菌AM-7161(Streptomyces sp.AM-7161)的次生代谢产物,具有抗革兰氏阳性菌及多种肿瘤的生物学活性。美达霉素生物合成基因簇中存在几个可能的调控基因,如medd-ORF11和med-ORF10可能都参与美达霉素的合成正调控;而med-ORF9可能编码参与吡喃环成环的烯酰还原酶。本研究利用遗传学及分子生物学技术在美达霉素野生型产生菌链霉菌AM-7161中对这些基因的功能展开初步分析,具体内容包括以下几方面:一、关于正调控基因med-ORF11同源性分析揭示med-ORF11属于链霉菌抗生素调控因子蛋白(Streptomyces antibiotic regulatory proteins,SARPs)家族(SARPs家族是抗生素生物合成途径中广泛分布的正调控因子),所以推测med-ORF11通过正调控机制参与美达霉素生物合成,但其确切的功能及具体的调控机制尚未阐明。(1)在野生菌中超量表达med-ORF11本研究首先从美达霉素产生菌AM-7161基因组上克隆了 med-ORF11基因,测序正确后再克隆到链霉菌整合型表达载体pIJ8600上,获得了用于med-ORF11超表达的质粒,命名为pHSL49;通过接合转移将pHSL49导入链霉菌AM-7161中,经过抗性筛选和分子水平验证筛选出med-ORF11超量表达菌株。在R4产素平板上培养后,观察固体培养物的红褐色素的积累(代表美达霉素的产生),发现med-ORF11超量表达菌株产生美达霉素的能力较野生型链霉菌AM-7161略高,说明med-ORF11的功能与文献推测相符,初步表明了 med-ORF11在美达霉素生物合成中起正向的调控作用。(2)在野生菌中敲除medd-ORF11将med-ORF11上游的同源左臂和下游的同源右臂连接后克隆到具有遗传不稳定性的pYH7载体上,构建了用于med-ORF11基因敲除的质粒pHSL47,通过接合转移将质粒pHSL47导入链霉菌AM-7161,经过松弛培养以及抗性验证及分子水平验证后,筛选出med-ORF11敲除突变菌株。首先在R4固体产素培养基上固体培养。结果表明med-ORF11突变菌株产素能力较野生型链霉菌AM-7161大大降低(根据美达霉素特征性红褐色);然后进行液体发酵。HPLC分析液体发酵上清液中的美达霉素的积累情况,也发现med-ORF11敲除突变菌株中,美达霉素积累水平下降。结合基因敲除和超表达实验表明med-ORF11是一个参与美达霉素生物合成的正向调控基因。二、关于正调控基因medd-ORF10前期发现medd-ORF10参与美达霉素生物合成调控,机制未知;根据对同源基因actVI-ORFA研究推测及部分实验证明med-ORF10可以调控同一基因簇中的med-ORF12(编码酮基还原酶,参与吡喃环手性结构的形成)的表达。但med-ORF10是否可以作用于靶基因med-ORF12的启动子(Pmed-ORF12)还未曾阐明。(3)在异源宿主BL21(DE3)中构建双质粒系统验证Med-ORF10与靶基因medd-ORF12启动子的关系本研究将含有med-ORF12的可能的启动子区域(Pmed-oRF12)的启动子探针质粒pHSL33导入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用Wetern blot可以检测到位于(Pmed-ORF12)下游的GFP基因的表达(尽管表达量很低),初步说明这个区域具有启动子活性,并且可以被大肠杆菌中的转录酶系识别。我们拟利用大肠杆菌中的双质粒系统来检测Med-ORF10是否可以作用(Pmed-ORF12):在大肠杆菌BL21(DE3)中导入含有med-ORF10的表达质粒pHSL79(衍生于表达载体pET28a(+);前期实验证明Med-ORF10可以在这个系统下有效表达),然后将含有Pmed-ORF12的启动子探针质粒pHSL33导入BL21(DE3)/pHSL79中。这两个衍生质粒携带不同抗性基因,理论上利用抗生素强制筛选可以保持二者共存。但我们发现两个质粒在双抗筛选条件下二者发生重组整合,说明在BL21(DE3)中不适合构建pHSL33和pHSL79的双质粒系统。叁、烯酰还原酶基因medd-ORF9(4)med-ORF9序列分析首先在基因序列分析过程中发现AM-7161美达霉素基因簇中的med-ORF9与放线紫红素基因簇中的同源基因actVI-ORF2在N端序列差异较大,这种差异有可能导致med-ORF9的催化效率较低甚至没有功能。(5)构建同源基因actVI-ORF2高表达质粒鉴于美达霉素和放线紫红素聚酮母核的合成机制可能类似,我们拟用actVI-ORF2在AM-7161中进行种间表达,看是否可以与med-ORF9发生功能协同或者互补以提高美达霉素合成水平。所以从天蓝色链霉菌基因组上克隆了actVI-ORF2基因,构建了高表达质粒,体内功能验证在进行中。(本文来源于《华中师范大学》期刊2012-05-01）
美达霉素论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
美达霉素是链霉菌产生的聚酮类抗生素,属于苯丙异色烷醌家族(benzoisochromanequinones),具有抗菌和抗肿瘤活性。它结构中含有两个相反的手性中心(C13S/C15R)。本研究以美达霉素生物合成中的后期结构修饰基因med-ORF9和调控基因med-ORF10为对象,展开功能和机制研究,内容如下:(一)关于后期结构修饰基因med-ORF9的功能研究根据GenBank公布的med-ORF9序列,同源性分析认为是编码烯酰还原酶的基因,推测参与美达霉素C15的R构型形成。1.med-ORF9*的功能校正以野生型美达霉素产生菌的基因组DNA为模板,通过PCR扩增med-ORF9基因,测序后发现该基因在野生菌中发生了无义突变(命名为med-ORF9*,相对于数据库中的med-ORF9),推测该基因功能已丧失,但该菌株中美达霉素依然产生,有可能med-ORF9*在美达霉素生物合成中已经不起作用(或不起主要作用)。为了验证野生菌中的med-ORF9*是否有功能,我们开展了基因校正实验:通过基因合成、PCR及亚克隆等分子手段,获得一个与GenBank中序列完全一致的med-ORF9基因。修正后的目的基因克隆在整合型质粒pIJ8600上,构建了 med-ORF9的超表达质粒;将该质粒通过接合转移导入到野生型美达霉素产生菌中,得到了 med-ORF9的超表达菌株。对med-ORF9的超表达菌株与野生型菌株发酵产物进行HPLC及质谱分析,发现校正基因med-ORF9的超表达导致美达霉素量明显增加,而推测为美达霉素手性异构体的物质产量则减少,说明这个校正过的基因可能在美达霉素的手性结构形成中起重要作用。2..med-ORF9*的敲除为了验证野生菌中的med-ORF9*是否有功能,本研究又进行基因敲除实验:以pYH7为载体构建了用于敲除med-ORF9,*的自杀型质粒,将自杀型敲除质粒通过接合转移导入到野生型美达霉素产生菌中,筛选获得了 med-ORF9*基因缺失突变菌株。将缺失突变株发酵产物进行HPLC分析,发现:与野生型菌株相比,缺失突变株还能产生美达霉素,说明这个发生点突变的基因已经丧失原来的烯酰还原酶功能。3.med-ORF9的原核表达为了进行体外酶学研究来验证med-ORF9的功能,我们对该基因进行原核表达:首先选择了 pRSET(A)和pET-28a(+)作为原核表达载体,宿主菌为BL21(DE3),构建了两组表达质粒:分别携带存在突变的med-ORF9*基因和修正了突变位点的med-ORF9基因。转入大肠杆菌宿主细胞进行诱导表达,并将表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测,发现存在突变的med-ORF9*基因不能表达,而修正了突变位点的med-ORF9的表达量虽然很低,但还可以检测到表达。(二)调控基因med-ORF10的作用机制med-ORF10是美达霉素生物合成途径中一个参与调控的小基因,前期研究显示该基因敲出后可降低美达霉素的产量,推测是个正调控基因,qRT-PCR分析显示med-ORF10的缺失突变对美达霉素基因簇上一个与手性中心形成相关基因med-ORF12的表达有显着影响。4.调控基因med-ORF10作用机制的研究为了进一步推测美达霉素基因簇中是否还有其它基因的表达受med-ORF10的调控,我们对野生菌和敲出菌中相关基因的转录进行了 qRT-PCR分析。结果显示med-ORF10敲出后,基因簇中许多基因的表达量受到影响(如med-ORF1、med-ORF8、med-ORF11 及 med-ORF12)。然而与预期相反,在 med-ORF10 敲出突变菌中,这些基因的表达量都有了不同程度的提高,如另一个正调控基因med-ORF11表达量提高了约70倍。为了验证med-ORF1、-ORF8以及-ORF12的转录是直接受控于med-ORF10还是直接受控于med-ORF11(有可能调控基因med-ORF11表达量的大量增加导致这几个基因表达量的升高),选取野生型菌株、med-ORF11敲出缺失菌株以及med-ORF11超表达菌株进行qRT-PCR验证。结果表明med-ORF11的过量表达不会导致相关基因表达量的大量增加。说明med-ORF10与美达霉素生物合成基因簇中某些基因的表达量改变直接有关,是美达霉素生物合成的调控基因。5.med-ORF10表达的原位检测和初步Med-ORF10免疫共沉淀实验前期实验中制备了med-ORF10的多克隆抗体,然而以此抗体检测野生菌株中该基因的表达情况时,没有检出预期的蛋白条带。为了提高检出该蛋白抗体的灵敏度,我们将Flag标签的编码序列连接在med-ORF10基因上,以整合型质粒pIJ8600为载体,构建了 med-ORF10的融合蛋白表达质粒(pHSL115),导入野生菌中。用Flag标签抗体进行检测,检出预期大小的目的蛋白。为了进一步研究med-ORF10的调控机制,选择Flag标签融合蛋白表达菌株AM7161/pHSL115进行免疫共沉淀实验,同时选择缺失med-ORF10的突变菌株LJ作为阴性对照。免疫共沉淀实验中,并没有检测到Flag-med10蛋白与美达霉素生物合成相关的两个酶Med-ORF8(糖基转移酶)和Med-ORF12(酮基还原酶)有明显结合。可能Med-ORF10蛋白本身就不以与其它蛋白结合的方式行使调控功能,也可能Med-ORF10蛋白是与Med-ORF8和Med-ORF12之外的蛋白结合,具体机制还需进一步研究。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
美达霉素论文参考文献
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