一、体外成熟对牛卵母细胞孤雌激活后发育潜力的影响（论文文献综述）
焦亚飞[1]（2020）在《PI3K/Akt信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响》文中指出卵母细胞是动物胚胎工程技术研发的基础,其成熟质量直接影响胚胎工程技术的效率。猪卵母细胞的体外成熟质量显着低于体内成熟,需要进一步完善猪卵母细胞的体外成熟技术体系。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）与卵泡的募集、卵泡颗粒细胞的增殖、黄体的形成以及卵母细胞的成熟有关,但有关猪卵母细胞成熟的研究较少。为此,本研究初步探究了PI3K/Akt信号通路与猪卵母细胞成熟的关系,以期通过调节PI3K/Akt信号通路提高猪卵母细胞的体外成熟质量。1.探讨了EGF激活PI3K/Akt信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果显示,成熟培养基中添加10 ng/m L的EGF可以显着提高卵丘细胞的扩展（P<0.05）,显着提高卵母细胞体外成熟率（P<0.05）;孤雌胚胎的2-细胞率、4-细胞率和囊胚率也显着提高（P<0.05）。通过RT-q PCR分析,PI3K/Akt信号通路的激活使GDF9、Akt、CDC2、Cyclin B1和MOS表达水平发生显着上调（P<0.05）,P34表达水平发生极显着上调（P<0.01）,BMP15表达也发生上调但与对照组相比差异不显着（P>0.05）;Western blot检测发现,10 ng/m L EGF可以显着提高p-Akt Thr308磷酸化水平（P<0.05）。2.研究了PI3K/Akt信号通路激活剂PS48对猪卵母细胞体外成熟和卵丘细胞增殖的影响。通过Hoechst33342对不同浓度培养的卵母细胞进行染色后,发现10μM PS48可以显着促进卵母细胞向MII期发育（P<0.05）,通过RT-q PCR分析,结果显示,GDF9和BMP15的相对表达量显着降低（P<0.05）,MOS和Cyclin B1的表达量极显着升高（P<0.01）,Akt和m TOR的表达量显着升高（P<0.05）,而CDC2的表达量没有显着差异（P>0.05）,Western blot检测显示,10μM的PS48可以显着提高p-Akt Thr308磷酸化水平和Akt蛋白水平（P<0.05）。对卵丘细胞培养和RT-PCR分析发现,10μM PS48可以显着促进卵丘细胞的增殖,提高了卵丘细胞线粒体膜电位（P<0.05）,凋亡相关基因BCL2、Caspase3极显着下调（P<0.01）,BAX发生显着下调（P<0.05）,增殖基因PCNA极显着上调（P<0.01）,周期相关基因P27、CDK4差异不显着（P>0.05）。3.探讨了PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果显示,50μM LY294002对猪卵丘细胞扩展的抑制作用显着（P<0.05）,并能显着抑制卵母细胞的成熟率和2-细胞率（P<0.05）,通过RT-q PCR检测发现,GDF9、BMP15、Akt、CDC2、Cyclin B1和P34基因表达发生了极显着下调（P<0.01）,Western blot结果显示,Akt和p-Akt Thr308均在卵母细胞中表达,而50μM的LY294002对猪卵母细胞中Akt和p-Akt Thr308均有抑制作用,Akt蛋白表达显着降低（P<0.05）,p-Akt Thr308磷酸化水平极显着低于对照组（P<0.01）。综上结果表明,在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加10 ng/ml EGF可以显着提高p-Akt Thr308磷酸化水平,并进一步提高卵母细胞成熟率和孤雌激活胚胎发育的能力,成熟培养基中添加10μM的PS48同样可以提高卵母细胞的成熟率。相反,在成熟培养基中添加50μM的PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002,可以抑制卵母细胞的成熟,以及减少了孤雌囊胚细胞数。
李昊[2]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中提出肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
黄晶晶[3]（2016）在《猪卵母细胞体外成熟调控和MPF、MAPK基因表达研究》文中指出本试验对猪卵母细胞体外成熟及受精技术体系展开了一系列研究,以期获得高质量成熟卵母细胞,降低精子多精入卵现象,提高胚胎可移植效率,从而建立高效的人工授精胚胎体外生产技术体系。1、促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚发育的影响。本研究旨在探讨不同浓度的促性腺激素（FSH、LH）以及处理时间对猪卵母细胞体外成熟质量及其后期发育潜力的影响。试验中,培养液中FSH、LH浓度均为10ug/m L且处理42h为对照组A,猪卵母细胞在不同浓度促性腺激素以及处理时间中培养42 h后,通过猪卵母细胞核的进程、存活率、极体率以及卵子内谷胱甘肽（GSH）含量等质量指标的评价,探讨成熟液中促性腺激素的最佳添加量以及处理的时间,再通过孤雌胚体外发育潜力研究,进一步验证该成熟培养体系。结果表明,4组卵子成熟培养42h都能到达核成熟阶段,存活率和极体率之间差异均不显着（P>0.05）;试验组单个卵母细胞内GSH含量显着高于对照组A（P<0.05）,其中全程添加FSH和LH,且浓度为1ug/m L的组别单个卵母细胞内GSH含量最高。此外,全程添加FSH和LH,且浓度为1ug/m L的试验组孤雌激活后卵裂率和囊胚率均显着高于对照组（P<0.05）。试验结果证明,在猪卵母细胞体外成熟液中全程添加促性腺激素且浓度为1ug/mL,可显着提高卵子成熟质量及后期发育潜力。2、褪黑素对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚发育的影响。探讨成熟液中不同浓度褪黑素对猪卵母细胞体外成熟质量及其后期发育潜力的影响。试验中,0mol/L为对照组,猪卵母细胞在不同MT浓度（0mol/L、10-6mol/L、10-9mol/L和10-12mol/L）的成熟液中培养42 h后,通过猪卵母细胞存活率、极体率、卵子内谷胱甘肽（GSH）含量以及胞质内线粒体和脂肪颗粒成熟分布状态等质量指标的评价,探讨成熟液中褪黑素（melatonin,MT）最佳添加量,再通过孤雌胚体外发育潜力研究,进一步验证该成熟培养体系。结果表明,4组卵子存活率和极体率之间差异均不显着（P>0.05）;试验组单个卵子中GSH含量均显着高于对照组（P<0.05）;而且,试验组卵子内脂肪颗粒和线粒体成熟分布等质量指标也显着优于对照组（P<0.05）;此外,孤雌激活后10-6mol/L和10-9mol/L组卵裂率和囊胚率均显着高于对照组（P<0.05）。试验结果证明,在猪卵母细胞体外成熟液中添加10-9mol/L-10-6mol/L的MT,可显着提高卵子成熟质量及后期发育潜力。3、褪黑素对卵母细胞MPF和MAPK基因表达的影响。试验采用两种提取RNA的提取方法,并对不同浓度下培养的卵母细胞内MPF和MAPK基因的mRNA表达进行分析。结果表明体外成熟培养液中褪黑素浓度为10-9mol/L时,成熟的卵母细胞中的MPF和MAPK基因mRNA表达量同时上调,且显着高于对照组（P<0.05）。4、咖啡因对猪精子获能以及体外受精的影响。试验探讨了不同浓度咖啡因对猪精子活力、存活时间以及体外受精的影响。试验中,0 mmol/L为对照组,猪精子在不同浓度咖啡因（0、2.5、5、10、20mmol/L）的受精液中获能,每隔30min对精子的活力进行测定,直至活力低于0.6.选择活力最强时候的时间点进行体外受精。结果表明:（1）咖啡因浓度为10、20mmol/L组,获能90min后精子活力明显低于0.6,其他组精子活力均要高于0.6;（2）咖啡因可以显着提高精子入卵率,咖啡因浓度为20mmol/L时多精入卵率显着高于对照组（P<0.05）;（3）咖啡因浓度为2.55.0mmol/L时,更有利于后期胚胎发育。体外成熟培养体系的建立,提高了卵母细胞成熟的质量,对猪胚胎生物技术方面研究具有重要的参考价值。
徐国旗[4]（2016）在《猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎干细胞的分离培养初探》文中提出本试验以从屠宰场采集废弃的猪卵巢为研究材料,对卵母细胞体外成熟培养体系以及孤雌囊胚胚胎干细胞的分离培养进行了探究。首先以亮甲酚蓝染色对成熟培养前的卵母细胞进行筛选,并通过添加db-cAMP来达到核质的同步成熟,进而提高卵母细胞的体外成熟质量;随后以孤雌激活后得到的囊胚为材料,从胚龄、饲养层以及内细胞团的分离几个方面对孤雌胚胎干细胞的分离培养进行了探究。试验主要结果如下:1.以13、26、39、52μmol/L的亮甲酚蓝（brilliant cresyl blue,BCB）对成熟培养前的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）染色90 min,比较不同浓度的BCB对卵母细胞的着色率、成熟率以及孤雌激活胚胎和核移植胚胎的早期发育情况。分析结果显示,BCB浓度为26μmol/L时,经染色的COCs既有较高的着色率,而又不影响其体外成熟的效率。挑选BCB+组卵母细胞进行孤雌激活和核移植试验,其卵裂率和囊胚率均显着高于BCB-组（P<0.05）。胚胎移植试验挑选BCB+组中发育较好的12细胞期重组胚对5头代孕母猪进行了移植,其中2头怀孕,1头顺利产下了6头健康胎儿。2.成熟培养液中分别添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-cAMP时,卵母细胞的成熟率随着浓度的增加依次降低,但浓度为1 mmol/L时,孤雌激活后的囊胚率最高（27.03%）;卵丘细胞单层与卵母细胞共培养时,其成熟率、卵裂率及囊胚率（86.00%、89.04%、28.36%）也得到了显着提高;0.4 mmol/L的db-cAMP和卵丘细胞单层共培养时,其成熟率和卵裂率（85.78%和88.95%）与对照组差异不显着,但囊胚率（35.14%）显着提高。3.试验研究了囊胚的胚龄、饲养层的种类及囊胚的不同处理对猪孤雌囊胚胚胎干细胞分离培养的影响。实验结果显示:①第8天的囊胚贴壁率（25.00%）显着高于第7天和第9天;②以小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层时贴壁率为18.52%,显着高于猪胎儿成纤维细胞和猪子宫上皮细胞饲养层（P<0.05）;③取孤雌激活后第8天的囊胚分成全胚组、孵化囊胚组、去透明带组和分离内细胞团（ICM）组进行体外培养时,分离的ICM贴壁率明显高于其他组（P<0.05）。
莫显红[5]（2014）在《内质网钙通道调控冷冻保存牛卵母细胞钙稳态机制的研究》文中认为生物体细胞内钙稳态对于维持细胞正常机能至关重要。钙稳态受到多种因素的影响,钙稳态失衡可导致细胞内钙浓度异常性升高,即钙超载,从而影响钙信号调控作用,导致细胞及细胞器功能异常,严重时可诱导细胞损伤或凋亡。冷冻保存作为刺激因素可导致卵母细胞内钙稳态失衡,但这种失衡机制及其与冷冻损伤的关系尚不清楚。因此,本研究在玻璃化冷冻保存成熟牛卵母细胞前阻断内质网钙通道,探明介导钙稳态失衡的主要钙通道及其作用机制。此外,本文探讨了LIF（leukemia inhibitory factor,LIF）在牛卵母细胞体外成熟与发育中的调控作用。为提高卵母细胞冷冻保存效率,获得更多高质量体外操作用卵母细胞具有较高的理论意义。在玻璃化冷冻保存卵母细胞前,用内质网Ca2+-ATPase（SERCA）阻断剂毒胡萝卜素（TG）预处理,解冻后的存活率显着降低（p<0.05）;用IP3R特异性的膜渗透性抑制剂10μmol/L2-APB预处理10 min,存活率显着升高。冷冻前用2-APB预处理,解冻后卵母细胞CG异常分布比例（42.40%）显着低于冷冻对照组（51.81%,p<0.05）,胞内GSH含量显着升高,活性氧（ROS）水平显着降低;孤雌激活卵裂率（61.45%vs.87.83%）和囊胚率（25.95%vs.47.31%）显着高于冷冻对照组。玻璃化冷冻保存前用2-APB预处理卵母细胞,解冻后内质网（ER）重组（ER皮质区簇状分布）明显恢复;内质网应激蛋白GRP78和CHOP的表达显着下调;且与细胞凋亡相关蛋白细胞色素C（cytC）,caspase-9及caspase-3的表达量显着降低。在IVM培养液中添加25 ng/mL LIF,分别培养卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes,COCs）和裸卵（denuded oocytes,DOs）,与对照组相比,核成熟率显着提高（72.53%vs.81.23%;60.59%vs.70.04%）;同时,LIF 可显着提高皮质颗粒（cortical granule,CG）迁移率、胞内谷胱甘肽（GSH）水平及受精相关蛋白CD9的表达。体外受精后,LIF处理组的卵裂率（66.52%vs.76.03%）、囊胚率（25.82%vs.35.35%）和囊胚细胞数（67.52 vs.80.75）均显着提高（p<0.05）。LIF相关信号通路MAPK3/1和JAK/STAT3检测结果显示:MAPK3/1和STAT3磷酸化水平显着升高;用MEK抑制剂U0126处理卵母细胞,仅部分抑制了 LIF诱导的卵母细胞核成熟,但胞质成熟被完全抑制;用JAK/STAT3通路抑制剂JAK inhibitor处理卵母细胞后核成熟和胞质成熟均被完全抑制。本研究分别在IVM、IVC及全程（IVM+IVC）添加LIF检测其对早期胚胎发育的影响。IVM中添加LIF,孤雌激活卵裂率和囊胚率显着高于对照组,全程添加LIF囊胚率（57.19%）最高,且囊胚中多潜能基因POU5F1和NANOG表达量显着高于对照组。综上所述,玻璃化冷冻前用2-APB预处理牛卵母细胞,维持了胞内钙稳态平衡,提高了冷冻解冻后的存活率及卵母细胞的发育能力,降低了内质网应激蛋白及细胞凋亡相关蛋白的表达,可保护卵母细胞免受内质网过度应激引发的钙稳态失衡。此外,LIF通过激活MAPK和JAK/STAT3信号通路,可促进牛卵母细胞核质成熟。
孟永芳[6]（2013）在《C-型钠肽对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响》文中研究表明卵母细胞体外成熟（in vitro maturation, IVM）技术是体外生产胚胎的基础，可为体外受精、体细胞克隆等技术研究与应用批量提供体外成熟卵母细胞，卵母细胞体外成熟培养还是研究卵泡发育和卵母细胞成熟的常用体外模型。牛卵母细胞体外成熟培养技术已趋于成熟和完善，获得的卵母细胞虽然数量具有优势，但是卵母细胞的后续发育率远不如体内成熟卵母细胞。C-型钠肽（C-type natriuretic peptide, CNP）是一种卵泡液中天然存在的旁分泌因子。已有研究证明，CNP在猪和小鼠抑制卵母细胞减数分裂恢复中起着重要作用，但是CNP在牛卵母细胞体外成熟过程中的作用以及CNP是否有利于提高IVM卵母细胞质量和支持后续胚胎发育的能力尚有待研究。因此，本研究主要探讨了CNP对牛卵母细胞体外成熟及成熟后孤雌胚胎发育的影响。结果如下：1.对屠宰场来源的牛卵巢卵母细胞体外减数分裂进程进行了研究，结果显示：体外培养8h时，牛卵母细胞已经发生GVBD；培养8～16h时发育到MI期；培养至24h时达到MII期的卵母细胞比例较高。2.在卵母细胞体外成熟培养液中添加20，40，80160nmol/L和160nmol/LCNP的成熟培养液中培养牛卵母细胞8h后，卵母细胞均已完成GVBD并有部分卵母细胞进入GVBD之后的发育进程，说明成熟培养液中添加CNP未影响牛卵母细胞GVBD发育进程。3.以常规成熟培养24h为对照，在CNP添加浓度为20，40，80nmol/L和160nmol/L的成熟液中分别培养8，12h和16h后转入常规培养至24h，检测其核进程。各试验组处于MII期的卵母细胞比例均升高，且以20nmol/L CNP-OM液培养12h后转常规培养至24h后MII期卵母细胞比例最高。可以选择20nmol/L CNP-OM液培养12h后转常规培养至24h作为牛卵母细胞体外成熟培养方案。4.卵母细胞成熟培养液中添加C-型钠肽进行牛卵母细胞体外成熟培养，未影响牛MI/MII期卵母细胞的微丝、α-微管的正常分布。5.牛卵母细胞在添加20nmol/L的CNP-OM液中培养12h后转入常规培养至24h，成熟卵母细胞进行孤雌激活后，进行孤雌胚胎体外培养，其卵裂率为73.58%，囊胚率为46.14%，均显着高于对照组。6.应用实时荧光定量PCR对孤雌囊胚发育、凋亡等相关基因进行了检测，结果显示：相对于体外常规成熟培养24后孤雌激活胚后培养得到的囊胚，在添加CNP的试验组成熟卵母细胞，Bax、P53、Oct-4和Xist的mRNA表达量均显着性升高（P<0.05），尤其是染色体失活相关基因Xist上调最为明显，而H19在两组间则无显着差异（P>0.05）。综上所述，牛卵母细胞在20nmol/L CNP-OM液中培养12h后转常规培养至24h为本研究的适宜体外培养方案，此方案可以达到提高IVM牛卵母细胞质量的目的。
乔利敏,乔富强,姚华,张京和,雷莉辉,关伟军[7]（2012）在《不同培养液对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响》文中研究表明为研究表皮生长因子（EGF）、β-巯基乙醇（β-ME）、亚硫磺酸（HTAU）对牛卵母细胞体外成熟（IVM）及孤雌激活胚胎体外发育（IVC）效果的影响,实验采集牛卵巢采用切割法收集卵丘-卵母细胞复合体（COCs）随机处于不同浓度EGF、β-ME培养液成熟培养24 h后孤雌激活,研究其在不同胚胎培养液中的后续发育,以期筛选出最好的牛卵母细胞IVM-IVC条件。结果表明:添加25、50、100 ng/mL EGF组的成熟率、卵裂率均高于对照组,其中50 ng/mL EGF组的成熟率、卵裂率与对照组差异显着（P<0.05）;50、100、500μmol/L的β-ME对牛卵母细胞体外成熟没有促进作用;50 ng/mL EGF与50、100μmol/Lβ-ME组合并无协同作用;胚胎培养基中添加不同浓度EGF对早期胚胎的体外发育无显着影响;而添加100μmol/Lβ-ME组的囊胚率、囊胚细胞数均极显着高于对照组（P<0.01）;在成熟液中添加50 ng/mL EGF和100μmol/Lβ-ME、胚胎培养液中添加0.5 mmol/L HTAU孤雌胚发育最好。
任晶晶,赵学明,秦彤,杜卫华,郝海生,刘岩,王栋,朱化彬[8]（2012）在《小鼠卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响》文中进行了进一步梳理本实验通过牛生发泡（GV）期无卵丘细胞卵母细胞-裸卵（denuded oocytes,DOs）与小鼠卵丘细胞（mouse cumulus cells,mCCs）共培养,研究异种mCCs对牛DOs体外成熟和孤雌激活后发育的影响,进而探讨卵丘细胞对卵母细胞的作用机制,为牛卵母细胞体外成熟效率提高提供实验依据。牛卵母细胞分为COCs（cumulus-oocytes complexes）组、DOs+bCCs（bovine cumulus cells,bCCs）组、DOs+mCCs组和DOs组4个组合,体外成熟2224h后,检测各组卵母细胞第一极体排出率、MⅡ期卵母细胞中谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量和孤雌激活后的发育能力,以及卵母细胞内骨形态发生蛋白15（BMP15）和生长分化因子9（GDF9）mRNA相对表达水平。结果表明:（1）DOs+mCCs组和DOs+bCCs组卵母细胞核成熟率[（68.48±5.71）%,（71.00±4.27）%]显着低于COCs组（84.70±3.41）%（P<0.05）,但均显着高于DOs组（54.26±5.03）%（P<0.05）;（2）DOs+mCCs组MⅡ卵母细胞GSH含量和孤雌激活囊胚率[（2.48±0.24）pmol/oocyte,（44.19±4.03）%]与DOs+bCCs组[（2.49±0.18）pmol/oocyte,（48.57±5.20）%]和DOs组[（2.40±0.17）pmol/oocyte,（43.47±7.34）%]之间没有差异,但分别显着低于COCs组[（9.67±0.18）pmol/oocyte,（59.93±6.13）%]（P<0.05）,各组孤雌激活卵裂率之间没有显着差异[（98.85±4.32）%,（92.11±2.00）%,（95.40±4.11）%,（93.18±3.19）%]（P>0.05）;（3）DOs+mCCs组、DOs+bCCs组和COCs组卵母细胞中BMP15和GDF9 mRNA相对表达水平均显着性高于DOs组（P<0.05）,其中,DOs+mCCs组和COCs组GDF9 mRNA相对表达水平显着高于DOs+bCCs组（P<0.05）。实验结果表明,mCCs能提高牛DOs的核成熟率及BMP15和GDF9 mRNA相对表达水平,但对牛DOs的细胞质成熟和MⅡ卵母细胞孤雌激活胚胎囊胚发育没有促进作用,说明卵丘细胞通过一些旁分泌因子促进卵母细胞核成熟,且这些因子的作用可能没有种属特异性。
乔利敏,乔富强,姚华,李向臣,关伟军,马月辉[9]（2011）在《不同化学激活方法及卵丘细胞层数对牛体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响》文中提出为探索适宜的牛体外成熟卵母细胞孤雌激活方式,提高核移植效率及研究胚胎孤雌发育。研究比较了不同浓度的乙醇（EH）、离子霉素（ionomycin）、钙离子载体A23187与蛋白激酶抑制剂6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）、细胞松驰素（cytochalasin B,CCB）对牛卵母细胞激活发育的影响,并在相同条件下,比较了不同卵丘细胞层数对卵母细胞激活后胚胎发育能力的影响。结果表明:（1）5μmol.L-1Ionomyc in,10μmol.L-1A23187,7%EH分别联合2 mmol.L-16-DMAP,CCB均可以有效地激活牛孤雌胚,其中以Ionomyc in+6-DMAP+CCB组囊胚发育率极显着高于其他各组（P<0.01）,并且激活液中CCB的存在对牛孤雌胚胎的发育有利;（2）卵母细胞包被的卵丘细胞层数不同对卵母细胞成熟激活有显着的影响,卵丘细胞层数3～5层和多于6层的卵丘—卵母细胞复合体（COCs）孤雌激活的分裂率和囊胚率分别为69.09%,31.58%和75.14%,38.85%,这2组之间差异不显着（P>0.05）,但其显着高于1～2层组与混合组（P<0.05）,因此,这2组细胞是最佳的试验研究材料。
潘瑞[10]（2011）在《山羊卵母细胞核质成熟同步化研究》文中进行了进一步梳理卵母细胞体外成熟培养过程中,由于脱离了在体状态下的核成熟抑制机制,而出现细胞核与细胞质成熟的明显不同步性,表现为细胞核首先完成成熟发育,而细胞质成熟则相对滞后。由于卵母细胞核成熟进程影响细胞质的成熟,而细胞质成熟对细胞核成熟又具有促进作用,只有当核质成熟发育同步进行时,卵母细胞才具备受精和受精卵继续发育的能力。周期依赖性蛋白激酶（roscovitine, ROS）为卵母细胞核成熟抑制剂,能可逆性、竞争性地抑制ATP与P34cdc2的结合,阻止cdc2激酶的正常磷酸化过程,从而抑制成熟促进因子（MPF）的激活,延缓卵母细胞核的成熟过程,使体外成熟培养的卵母细胞达到核质成熟时间接近一致。本研究以山羊卵母细胞为研究对象,在卵母细胞成熟培养液中添加梯度浓度的ROS,对山羊卵母细胞进行不同时间的全程核成熟抑制培养（8 h, 16 h, 24 h）,并进行卵母细胞阶段性核成熟抑制培养（8 h, 16 h）和抑制后常规培养（16 h, 8 h）。在此基础上,按照筛选的阶段性抑制培养方案进行卵母细胞培养和培养后卵母细胞孤雌激活及孤雌胚胎体外培养,根据孤雌胚胎体外发育能力,确定利用ROS进行山羊卵母细胞核质成熟同步化培养的方案。研究结果如下:1.常规体外成熟培养条件下卵母细胞核成熟时程山羊卵母细胞在常规体外成熟培养过程中,24 h以内随着培养时间的延长第一极体排出率逐渐增加,培养至24 h时第一极体的排出率最高（67.13±3.10%）,继续培养到26 h28 h时,随着培养时间的延长第一极体的排出率呈下降趋势。2.卵母细胞全程核成熟抑制培养在卵母细胞成熟培养液中分别添加不同浓度的核成熟抑制剂ROS,对山羊卵母细胞分别进行8, 16 h和24 h全程核成熟抑制培养。结果表明,核成熟抑制培养8 h时,核成熟抑制组和对照组卵母细胞核成熟率均较低,说明此时卵母细胞尚未进入核成熟发育进程。核成熟培养16 h时,10, 20μmol/L和40μmol/L ROS添加组卵母细胞核成熟率与对照组差异不显着（P>0.05）;80, 120, 160μmol/L和200μmol/LROS添加组核成熟率均显着低于对照组（P<0.05）。核成熟抑制培养24 h时,10μmol/L和20μmol/L ROS添加组卵母细胞核成熟率与对照组差异不显着（P>0.05）,ROS添加浓度≥40μmol/L时,卵母细胞核成熟率均显着低于对照组（P<0.05）,并表现剂量-效应关系。3.卵母细胞阶段性核成熟抑制培养在添加不同浓度ROS的成熟培养液中,分别对卵母细胞进行核成熟抑制培养16 h后转入常规培养8 h（16 h+8 h）或抑制培养8 h后转入常规培养16 h （8 h+16 h）,并以常规培养24 h作为对照组。结果表明,ROS对山羊卵母细胞的核成熟抑制作用具有时间-效应关系和浓度-效应关系。4.适宜核成熟抑制培养条件下卵母细胞核成熟时程卵母细胞全程核成熟抑制培养和阶段性核成熟抑制培养结果初步证明,在成熟培养液中添加40μmol/L核成熟抑制剂ROS,在核成熟抑制培养8 h后转入常规培养至24 h为卵母细胞核质成熟同步化的适宜培养方案。进一步利用该培养方案进行卵母细胞核成熟抑制培养,验证核成熟抑制培养效果并分析核成熟时程。结果表明,在成熟培养液中添加40μmol/L核成熟抑制剂ROS进行山羊卵母细胞核成熟抑制培养8 h后转入常规成熟培养,在成熟培养的16 h以内,阶段性核成熟抑制培养组（8 h+常规成熟培养）与常规成熟培养组之间第一极体排出率差异不显着（P>0.05）;在成熟培养的18, 20 h和22 h,阶段性核成熟抑制培养组第一极体排出率均显着低于培养相同时间的对照组;在培养的24 h时,阶段性核成熟抑制培养组第一极体排出率（61.01±5.98%）与对照组（67.13±3.10）接近（P>0.05）,说明成熟液中添加40μmol/L ROS进行核成熟抑制培养8 h后转入常规成熟培养,可有效延迟在常规成熟培养条件下培养18 h～22 h时完成核成熟分裂的卵母细胞的减数分裂恢复,从而使这部分卵母细胞的核成熟分裂延迟到接近24 h时完成。5.不同浓度核成熟抑制培养条件下成熟卵母细胞孤雌激活与孤雌胚胎体外发育当成熟培养液中添加不同浓度的核成熟抑制剂ROS抑制培养山羊卵母细胞8 h后转入常规成熟培养至24 h,40μmol/LROS组孤雌激活胚胎的卵裂率和4-8细胞胚率与对照组均无显着性差异,桑椹胚率（69.33±1.83%）和囊胚率（41.33±4.43%）高于对照组（65.19±2.70%、33.09±3.54%）,其余各组孤雌激活胚的整体发育能力低于对照组,没有囊胚形成。孤雌激活胚的培养结果表明,成熟培养液中添加40μmol/LROS核抑制剂抑制培养山羊卵母细胞8 h后,转入常规成熟培养至24 h,可以提高孤雌激活胚胎的体外发育能力。综上所述,成熟培养液中添加40μmol/L核成熟抑制剂ROS抑制培养山羊卵母细胞8 h后再转入常规成熟培养至24 h为山羊卵母细胞体外核质成熟同步化培养的最适方案;此方案可以有效抑制核成熟卵母细胞的减数分裂提前恢复,达到培养24 h核质同步成熟,提高体外培养卵母细胞质量的目的。
二、体外成熟对牛卵母细胞孤雌激活后发育潜力的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、体外成熟对牛卵母细胞孤雌激活后发育潜力的影响（论文提纲范文）
（1）PI3K/Akt信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.卵母细胞体外成熟的研究进展 |
| 1.1 卵母细胞成熟过程 |
| 1.2 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 2.PI3K/Akt信号通路对卵母细胞成熟的影响 |
| 2.1 PI3K/Akt信号通路的研究进展 |
| 2.2 PI3K/Akt信号通路对卵母细胞成熟的影响 |
| 3.研究目的及意义 |
| 第二章 激活剂EGF对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 前言 |
| 1.试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.4 结果生物统计与分析 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 激活剂EGF对猪卵丘细胞扩展的影响 |
| 2.2 激活剂EGF对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后胚胎发育的影响 |
| 2.3 10 ng/mL EGF对猪卵母细胞成熟相关基因表达的影响 |
| 2.4 10 ng/mL EGF对猪卵母细胞p-Akt~(Thr308)蛋白表达的影响 |
| 3.讨论与分析 |
| 3.1 激活剂EGF对猪卵丘扩展和卵母细胞成熟的影响 |
| 3.2 10ng/mL EGF对猪卵母细胞成熟相关基因和p-Akt~(Thr308)蛋白水平的影响 |
| 4.小结 |
| 第三章 激活剂PS48对猪卵母细胞体外成熟及卵丘细胞增殖的影响 |
| 前言 |
| 1.试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.4 结果统计与分析 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 激活剂PS48对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.2 10μM PS48对卵母细胞成熟相关基因表达的影响 |
| 2.3 10μM PS48 对猪卵母细胞p-Akt~(Thr308)和Akt蛋白表达的影响 |
| 2.4 不同浓度PS48对猪卵丘细胞扩展以及增殖的影响 |
| 2.5 10μM PS48对猪卵丘细胞增殖、凋亡、周期相关基因表达及线粒体膜电位的影响 |
| 3.讨论与分析 |
| 3.1 激活剂PS48对猪卵母细胞成熟及孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.2 10μM PS48 对猪卵母细胞成熟相关基因以及p-Akt~(Thr308)和Akt表达的影响 |
| 3.3 10μM PS48对猪卵丘细胞增殖、凋亡、周期相关基因表达及线粒体膜电位的影响 |
| 4.小结 |
| 第四章 抑制剂LY294002对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 前言 |
| 1.试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.4 结果统计与分析 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 抑制剂LY294002对猪卵丘颗粒细胞扩展的影响 |
| 2.2 抑制剂LY294002对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.3 50μM LY294002对猪卵母细胞成熟相关基因表达的影响 |
| 2.4 50μM LY294002 对猪卵母细胞Akt和 p-Akt~(Thr308)蛋白表达的影响 |
| 2.5 50μM LY294002对猪囊胚细胞数的影响 |
| 3.讨论与分析 |
| 3.1 抑制剂LY294002对猪卵丘细胞扩展和卵母细胞成熟的影响 |
| 3.2 50μM LY294002 对猪卵母细胞成熟相关基因、Akt、p-Akt~(Thr308)蛋白表达及囊胚细胞数的影响 |
| 4.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表学术论文 |
（2）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）猪卵母细胞体外成熟调控和MPF、MAPK基因表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 猪卵母细胞体外成熟研究进展 |
| 1.1 卵母细胞的体外成熟特征 |
| 1.2 谷胱甘肽、线粒体及脂肪颗粒与卵母细胞成熟的关系 |
| 1.3 卵母细胞成熟过程中MPF和MAPK的变化规律 |
| 1.4 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.5 培养条件 |
| 2 猪卵母细胞体外受精研究进展 |
| 2.1 精子获能 |
| 2.2 精子获能效果的评定 |
| 3 孤雌激活 |
| 4 早期胚胎的体外培养 |
| 第二章 促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试剂及仪器设备 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同浓度的促性腺激素和处理时间对猪卵母细胞核成熟的影响 |
| 2.2 不同浓度的促性腺激素和处理时间对猪卵母细胞存活率以及极体率的影响 |
| 2.3 不同浓度的促性腺激素和处理时间对猪卵母细胞内谷胱甘肽含量影响的研究 |
| 2.4 猪卵母细胞孤雌胚发育潜力研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同浓度促性腺激素和处理时间对卵母细胞核成熟的影响 |
| 3.2 不同浓度促性腺激素和处理时间对GSH含量的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 褪黑素对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 试验设计 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 褪黑素对猪卵母细胞活率和极体率影响的研究 |
| 2.2 褪黑素对猪卵母细胞内谷胱甘肽含量影响的研究 |
| 2.3 猪卵母细胞脂肪颗粒和线粒体成熟分布状态研究 |
| 2.4 猪卵母细胞孤雌胚发育潜力研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 褪黑素对猪卵母细胞活率和极体率影响的研究 |
| 3.2 褪黑素对猪卵母细胞胞质内容物影响的研究 |
| 4 小结 |
| 第四章 褪黑素对卵母细胞MPF和MAPK基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试剂及仪器设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 两种提取方法RNA纯度分析 |
| 2.2 溶解曲线和扩增曲线 |
| 3 讨论 |
| 3.1 两种提取RNA方法的比较 |
| 3.2 褪黑素作用卵母细胞MPF和MAPK基因mRNA的表达 |
| 4 小结 |
| 第五章 咖啡因对猪精子获能以及体外受精的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 试验设计 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 咖啡因对精子不同时间活力的影响 |
| 2.2 咖啡因对体外受精影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 咖啡因对卵母细胞活力及存活时间的影响 |
| 3.2 咖啡因对精子体外受精的影响 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（4）猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎干细胞的分离培养初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 卵母细胞体外成熟的研究概况 |
| 1.2 卵母细胞体外成熟的机理 |
| 1.3 猪卵母细胞体外成熟的研究进展 |
| 1.3.1 卵巢的采集 |
| 1.3.2 卵母细胞的采集及挑选 |
| 1.3.3 体外成熟培养基及添加物 |
| 1.3.4 体外培养的条件、方法 |
| 1.3.5 卵丘细胞对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 1.3.6 减数分裂抑制剂对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 1.4 猪胚胎干细胞建系的研究概况 |
| 1.5 猪胚胎干细胞的分离、培养、传代及鉴定 |
| 1.5.1 内细胞团的分离 |
| 1.5.2 培养体系 |
| 1.5.3 ES细胞的传代 |
| 1.5.4 猪胚胎干细胞的鉴定 |
| 1.5.5 问题与展望 |
| 第二章 亮甲酚蓝对猪卵母细胞体外成熟及核移植胚胎发育的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 BCB浓度对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.2.2 BCB染色筛选对孤雌激活胚胎体外发育潜力的影响 |
| 2.2.3 BCB染色筛选对核移植胚胎体外发育潜力的影响 |
| 2.2.4 BCB筛选成熟卵母细胞的验证 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 db-cAMP和卵丘细胞单层对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育潜力的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 COCs细胞及胚胎发育情况 |
| 3.2.2 不同浓度db-cAMP对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2.3 MAP激酶活性检测 |
| 3.2.4 卵丘细胞对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2.5 db-cAMP与卵丘细胞单层共培养对卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 猪孤雌胚胎干细胞的分离培养 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同时期囊胚对猪胚胎干细胞分离培养的影响 |
| 4.2.2 不同饲养层对猪胚胎干细胞分离培养的影响 |
| 4.2.3 囊胚不同处理对猪胚胎干细胞分离培养的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）内质网钙通道调控冷冻保存牛卵母细胞钙稳态机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文章综述 |
| 第一章 钙稳态 |
| 1.1 钙稳态失衡 |
| 1.2 钙稳态失衡与内质网应激及细胞凋亡 |
| 第二章 玻璃化冷冻保存卵母细胞的研究 |
| 2.1 玻璃化冷冻 |
| 2.2 卵母细胞玻璃化冷冻损伤 |
| 2.3 牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展 |
| 第三章 牛卵母细胞的体外成熟的研究进展 |
| 3.1 牛卵母细胞体外成熟概况 |
| 3.2 影响牛卵母细胞体外成熟的因素 |
| 第四章 白血病抑制因子在哺乳动物生殖中的作用 |
| 4.1 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF) |
| 4.2 LIF调控卵母细胞减数分裂恢复及相关信号通路 |
| 4.3 LIF在哺乳动物早期胚胎发育中的作用 |
| 4.4 LIF在胚胎附植中的作用 |
| 第二部分 研究论文 |
| 第一章 内质网钙通道对牛卵母细胞冷冻后存活率的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二章 2-APB对冷冻后卵母细胞发育能力的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三章 2-APB对冷冻后卵母细胞内质网应激和细胞凋亡的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四章 LIF促进牛卵母细胞体外成熟及其作用机制 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第五章 LIF对牛卵母细胞发育能力和多潜能基因表达的影响 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验设计 |
| 4. 实验结果 |
| 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 博士期间发表的论文 |
（6）C-型钠肽对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活研究概述 |
| 1.1 卵母细胞的发育过程 |
| 1.2 卵母细胞减数分裂阻滞与恢复 |
| 1.2.1 卵母细胞减数分裂阻滞 |
| 1.2.2 卵母细胞减数分裂的恢复 |
| 1.3 卵母细胞核成熟和胞质成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞核成熟及其成熟标志 |
| 1.3.2 卵母细胞质成熟及其成熟标志 |
| 1.4 卵母细胞体外成熟培养 |
| 1.5 卵母细胞的孤雌激活 |
| 1.5.1 卵母细胞激活机制 |
| 1.5.2 卵母细胞孤雌激活方法 |
| 1.5.3 孤雌胚胎的体外发育 |
| 试验研究 |
| 第二章 CNP 对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试剂及配制 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 牛卵母细胞采集 |
| 2.2.2 卵母细胞体外成熟培养 |
| 2.2.3 CNP 对体外成熟牛卵母细胞的影响 |
| 2.3 试验数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 体外培养不同时间牛卵母细胞减数分裂进程 |
| 2.4.2 牛卵母细胞在 CNP-OM 液中培养 8 h 的核发育进程检测结果 |
| 2.4.3 不同浓度的 CNP-OM 液阶段性体外培养后转入常规培养至24h |
| 2.4.4 CNP 对体外成熟牛卵母细胞质量和细胞骨架分布的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 牛卵母细胞常规体外成熟培养条件下的成熟发育 |
| 2.5.2 不同浓度 CNP 对牛卵母细胞体外成熟培养的影响 |
| 2.5.3 不同浓度CNP-OM液阶段性培养后转入常规培养至24h的卵母细胞成熟情况 |
| 2.5.4 CNP 对体外成熟牛卵母细胞质量和细胞骨架分布的影响 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 C-型钠肽对牛成熟卵母细胞孤雌激活及孤雌胚体外发育的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试剂及配制 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 牛卵母细胞采集与体外成熟培养 |
| 3.2.2 卵母细胞孤雌激活 |
| 3.2.3 成熟卵母细胞孤雌激活及孤雌激活胚胎的培养 |
| 3.2.4 孤雌发育囊胚细胞计数 |
| 3.2.5 实时荧光定量 PCR |
| 3.3 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 牛卵母细胞体外成熟培养后孤雌激活胚胎发育 |
| 3.4.2 卵母细胞孤雌激活后第 7 天囊胚细胞计数结果 |
| 3.4.3 牛孤雌激活囊胚凋亡与发育相关基因实时荧光定量PCR结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 CNP 对牛孤雌激活胚体外发育的影响 |
| 3.5.2 CNP 对孤雌囊胚凋亡和发育相关基因表达的影响 |
| 3.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）不同培养液对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 卵巢和卵母细胞的采集 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟培养 |
| 1.4 成熟卵母细胞的孤雌激活及培养 |
| 1.5囊胚细胞染色计数 |
| 1.6 试验设计 |
| 1.6.1 EGF对卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎发育的影响 |
| 1.6.2 β-ME对卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎发育的影响 |
| 1.6.3 EGF、β-ME协同作用分析 |
| 1.6.4 EGF对早期胚胎体外发育的影响 |
| 1.6.5 β-ME对早期胚胎体外发育的影响 |
| 1.6.6 HTAU对EGF、β-ME成熟液处理的早期胚胎体外发育的影响 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 EGF对牛卵母细胞体外成熟及激活后卵裂的影响 |
| 2.2 β-ME对牛卵母细胞体外成熟及激活后卵裂的影响 |
| 2.4 EGF对牛孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.5 β-ME对早期胚胎体外发育的影响 |
| 2.6 HTAU对上面较好的成熟培养体系处理的早期胚胎体外发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 EGF对牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响 |
| 3.2 β-ME对牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响 |
（8）小鼠卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响（论文提纲范文）
| 1 结果与分析 |
| 1.1 体外培养的牛和小鼠卵丘细胞 |
| 1.2 m CCs对牛DOs核成熟的影响 |
| 1.3 mCCs对牛DOs内GSH含量的影响 |
| 1.4 mCCs对牛卵母细胞内BMP15和GDF9mRNA相对表达水平的影响 |
| 1.5 mCCs对牛MⅡ卵母细胞孤雌激活胚胎发育的影响 |
| 2 讨论 |
| 2.1 mCCs对牛DOs核成熟的影响 |
| 2.2 mCCs对牛DOs细胞质成熟的影响 |
| 2.3 m CCs对牛卵母细胞内BMP15和GDF9mRNA相对表达水平的影响 |
| 2.4 m CCs对牛MⅡ卵母细胞孤雌胚胎发育的影响 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 主要试剂和配制方法 |
| 3.1.1 卵丘细胞培养液 |
| 3.1.2 卵母细胞体外成熟溶液 |
| 3.1.3 孤雌激活溶液 |
| 3.1.4 胚胎培养液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 牛卵母细胞体外成熟培养 |
| 3.2.2 小鼠卵丘细胞培养 |
| 3.2.3 牛卵丘细胞培养 |
| 3.2.4 卵母细胞核成熟率统计 |
| 3.2.5 卵母细胞谷胱甘肽含量测定 |
| 3.2.6 BMP15和GDF9 mRNA相对表达水平测定 |
| 3.2.7 卵母细胞孤雌激活和培养 |
| 3.2.8 实验设计 |
| 3.2.9 数据分析统计 |
（10）山羊卵母细胞核质成熟同步化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述部分 |
| 第一章 山羊卵母细胞体外核质成熟同步化研究进展 |
| 1.1 卵母细胞的体外成熟培养 |
| 1.1.1 卵母细胞成熟机制 |
| 1.1.2 卵母细胞的发育能力 |
| 1.2 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.2.1 卵母细胞的来源 |
| 1.2.2 体外培养条件 |
| 1.2.3 颗粒细胞与卵丘细胞 |
| 1.2.4 血清、激素和卵泡液 |
| 1.2.5 核质协调性 |
| 1.3 卵母细胞的成熟调控 |
| 1.3.1 成熟促进因子 |
| 1.3.2 蛋白激酶A 和环化核苷酸 |
| 1.3.3 蛋白质磷酸化抑制剂 |
| 1.3.4 成熟抑制因子 |
| 1.3.5 细胞生长抑制因子 |
| 1.3.6 促性腺激素和细胞生长因子 |
| 1.3.7 卵母细胞与卵泡的关系 |
| 1.3.8 核质成熟及其关系 |
| 1.4 卵母细胞孤雌激活 |
| 1.4.1 卵母细胞孤雌激活的方法 |
| 1.4.2 孤雌胚的发育 |
| 1.4.3 活化的主要途径 |
| 试验研究 |
| 第二章 山羊卵母细胞核质成熟同步化研究 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 山羊卵巢 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.1.4 主要操作液和培养液 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 卵母细胞的采集 |
| 2.2.2 卵母细胞的体外成熟培养 |
| 2.2.3 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 常规成熟培养不同时间山羊卵母细胞的核成熟情况 |
| 2.3.2 卵母细胞全程核成熟抑制培养24 h 的培养结果 |
| 2.3.3 卵母细胞全程核成熟抑制培养16 h 的培养结果 |
| 2.3.4 卵母细胞全程核成熟抑制培养8 h 的培养结果 |
| 2.3.5 卵母细胞核成熟抑制培养8 h 和16 h 并转入常规培养至24 h 的培养结果 |
| 2.3.6 山羊卵母细胞核成熟抑制培养中核成熟时程 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 山羊卵母细胞常规体外成熟培养条件下的成熟发育 |
| 2.4.2 ROS 添加浓度对山羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.4.3 ROS 抑制培养时间对山羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 核质同步成熟山羊卵母细胞孤雌激活及孤雌胚培养 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器设备 |
| 3.1.3 主要操作液和培养液 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 ROS 抑制培养24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育 |
| 3.2.2 ROS 抑制培养16 小时转入常规培养至24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育 |
| 3.2.3 ROS 抑制培养8 小时转入常规培养至24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育 |
| 3.2.4 核成熟抑制培养的卵母细胞孤雌激活 |
| 3.2.5 激活孤雌胚的体外培养 |
| 3.2.6 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ROS 抑制培养24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育结果 |
| 3.3.2 ROS 抑制培养16 小时转入常规培养至24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育结果 |
| 3.3.3 ROS 抑制培养8 小时转入常规培养至24 小时山羊卵母细胞孤雌激活及体外发育结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 高浓度ROS 影响胚胎的发育能力 |
| 3.4.2 低浓度ROS 对山羊孤雌激活胚体外发育的影响 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、体外成熟对牛卵母细胞孤雌激活后发育潜力的影响（论文参考文献）
- [1]PI3K/Akt信号通路对猪卵母细胞体外成熟的影响[D]. 焦亚飞. 广西大学, 2020(02)
- [2]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [3]猪卵母细胞体外成熟调控和MPF、MAPK基因表达研究[D]. 黄晶晶. 天津农学院, 2016(10)
- [4]猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎干细胞的分离培养初探[D]. 徐国旗. 青海大学, 2016(08)
- [5]内质网钙通道调控冷冻保存牛卵母细胞钙稳态机制的研究[D]. 莫显红. 中国农业大学, 2014(02)
- [6]C-型钠肽对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响[D]. 孟永芳. 西北农林科技大学, 2013(02)
- [7]不同培养液对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响[J]. 乔利敏,乔富强,姚华,张京和,雷莉辉,关伟军. 中国畜牧杂志, 2012(23)
- [8]小鼠卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响[J]. 任晶晶,赵学明,秦彤,杜卫华,郝海生,刘岩,王栋,朱化彬. 农业生物技术学报, 2012(04)
- [9]不同化学激活方法及卵丘细胞层数对牛体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响[J]. 乔利敏,乔富强,姚华,李向臣,关伟军,马月辉. 浙江农业学报, 2011(04)
- [10]山羊卵母细胞核质成熟同步化研究[D]. 潘瑞. 西北农林科技大学, 2011(05)