导读:本文包含了核糖开关论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:抑制型核糖开关,激活型核糖开关,基因表达调控,基因电路
核糖开关论文文献综述
魏昭,刘青,邹民吉,李丽,陈瑶[1]（2018）在《不同核糖开关对下游靶基因调控效能的对比研究》一文中研究指出目的比对分属于激活和抑制型中的不同核糖开关的调控功效,为实现基因电路的精准调控奠定基础。方法构建不同核糖开关(add A与M6,TPP与btu B)调控的绿色荧光蛋白amcyan表达载体,通过荧光表达量、RTq PCR分析在不同配体物浓度调控下的amcyan表达,与未含核糖开关载体的表达量进行比较,进行动态调控效能分析。结果在add A与M6激活型核糖开关的调控下,随配体物浓度的增加,绿色荧光表达量增加,且相比M6核糖开关,add A核糖开关拥有更大的动态调控效能;相反,在TPP与btu B抑制型核糖开关的调控下,随配体物浓度的增加,绿色荧光表达量减少,但btu B核糖开关的动态调控效能略大于TPP核糖开关。结论相同作用机制的不同核糖开关调控功效存在差异,拥有动态调控效能优势的激活型开关add A与抑制型开关btu B更适合在大肠杆菌中用于代谢精确调控与靶基因精准表达。(本文来源于《军事医学》期刊2018年02期）
修宇[2]（2017）在《基于RNA核糖开关调控的类黄酮生物传感器的构建与应用》一文中研究指出微生物菌株因生长速度快,操作技术日趋成熟、便于扩大生产、环境友好、代谢终产物浓度高且易分离纯化等优点,而被认为是具有高经济附加值化合物异源合成的理想宿主。然而,目前的重组菌株在生产效率和产量上仍无法符合工业化生产的要求。与传统基于转录因子的代谢调控手段相比,近年报道的核糖开关对配体的响应更为快速,而且结构简单,便于改造。本研究以黄酮类化合物代谢的重要中间产物柚皮素为核糖开关的小分子配体,利用体外SELEX筛选获得能与柚皮素特异识别的适体库,进而以tetA双选择标记基因作为报告基因,在生物体内通过两条不同柚皮素浓度的筛选路径,富集获得具有不同最适检测适应范围的核糖开关库。经测序和柚皮素剂量响应测定证实,所得核糖开关的动态输出荧光激活率范围在1.68-2.77倍,MID系列核糖开关的线性响应范围约在5-100 mg L-1柚皮素,HIGH系列核糖开关的线性响应范围约在80-200 mg L-1柚皮素。本研究继而选用除柚皮素外的27种黄酮类化合物对6个人工核糖开关(M1、M2、M3、O、L、H3)进行平时筛选,以研究人工核糖开关的专一性识别特性,并根据各化合物的物理化学性质及其对应的绿色荧光激发强度,采用支持向量回归法的QSPR建模分析,对核糖开关M1、M2和O建立了具有良好预测能力的鲁棒性模型。通过对与模型呈高度相关的描述符分析知,核糖开关M1和M2有着非常类似的结构特点,其与配体分子结合的适体域应是一个富集正电荷的亲水性区域,该区域对配体分子中的脂肪酮结构具有特异性的识别,对C-3'和C-4'位羟基敏感。而核糖开关O的适体域却极有可能是一个单位体表面积比较小的疏水性区域,它与核糖开关L对多羟基黄酮类化合物的响应力更高。此外,实验结果还表明类黄酮分子结构中A环上的取代基团在核糖开关的激活过程中并不起主要作用。O-糖基化黄酮类衍生物可能受到空间位阻影响,对本研究中的人工核糖开关都不具激活作用。当前,研究人员对合成生物学代谢途径的设计与改造能力已远超所知筛选技术的筛选能力,设计验证的进程也因此被大大拖后。本研究应用上述人工合成RNA核糖开关,首次将共培养的概念应用于高通量筛选策略。本研究指出了影响人工核糖开关传感器性能的一系列关键操作参数,如核糖开关的启动子、核糖开关制动元件中的连接序列及其它会引起胞内RNA空间构象变化的因素、传感系统的宿主菌、发酵时间和培养基等。基于此,构建了双荧光标记的传感器模块(菌),实践了该模块与另一个柚皮素生物合成模块(菌)在共培养后,显示出绿色荧光激发强度与柚皮素产量间具有高度正相关性,建立了一种可信、快捷的高通量筛选方法。研究首次成功构建了具有生物活性的响应柚皮素的RNA核糖开关,评估了核糖开关的柚皮素剂量响应特性、动态检测范围和识别特异性等。尽管目前对RNA空间构象的检测手段还比较有限,但QSPR建模有助于阐明核糖开关-配体复合物结合过程中的理化结构特性。生物感应模块(菌)-代谢物合成模块(菌)共培养技术是对已有微生物共培养技术应用的拓展,并可以扩展到任何适宜的代谢物高通量筛选中。由于模块菌将负责生产的微生物和负责检测的微生物分割成各自独立的个体,从而省去了研究人员在后续模块优化等其它研究中需要更换或取出生物传感器的步骤。(本文来源于《北京化工大学》期刊2017-11-27）
李新风[3]（2017）在《c-di-GMP核糖开关的结构、功能与应用》一文中研究指出核糖开关是mRNA 5'-非翻译区(5'-UTR)的一段RNA序列,包含可以识别并结合配体的保守序列——适配体区(Aptamerdomain,AD),以及结构多变可以调控下游编码基因的表达平台区(Expression platform,EP)。当代谢物分子浓度比较高时,其与适配体区结合,引起下游的表达平台区发生构象变化,进而实现对下游基因的调节。对下游基因的调节可以在转录水平通过形成终止子/抗终止子或在翻译水平形成隔离子/抗隔离子实现。目前已经发现二十多种核糖开关,它们识别不同的配体分子,调控多种多样的生理功能。我们通过生物信息学的方法在全基因组范围内对己完成测序的3079个原核生物基因组中核糖开关的分布、种类以及下游调控基因的功能进行研究。结果表明,绝大多数的原核生物中都含有核糖开关,其下游调控的基因种类繁多,尤其参与调控各种各样的酶类。COG(Cluster of orthologous groups of proteins,蛋白质直系同源簇)注释结果显示,核糖开关下游调控基因功能主要富集到"辅酶代谢[H]"和"氨基酸的转运与代谢[E]"通路中(图1)。c-di-GMP(Cyclic diguanosinemonophosp-hate,环二鸟苷单磷酸)是细菌体内普遍存在的一类核苷类第二信使,在细菌的代谢调控中处于中心调节的地位,广泛参与调控细菌的生长和分化、群体感应、生物被膜的形成和分泌、运动性、毒力等生理功能。c-di-GMP也可以作为配体分子识别特定的RNA序列,即c-di-GMP核糖开关。目前己发现c-di-GMP-I和c-di-GMP-II两类c-di-GMP的核糖开关。它们通过特异性地结合c-di-GMP,调控种类繁多的下游基因的表达。c-di-GMP-I核糖开关分布广泛,调控众多生理功能。c-di-GMP-II核糖开关具备变构核酶的功能,结合c-di-GMP后在其非典型剪切位点处发生结构变化,调节下游基因表达。COG注释结果显示,c-di-GMP核糖开关下游调控基因功能主要富集到"信号转导机制[T]"以及"细胞运动[N]"通路中。这为c-di-GMP调控细菌的运动和信号转导提供了一种解释。此外,我们实验室还在苏云金芽胞杆菌CT-43中发现了3个串联排布的c-di-GMP-I核糖开关,并成功地将该叁串c-di-GMP核糖开关应用于生物传感器,高效筛选c-di-GMP合成酶(图2)。在酶工程研究领域中,需要适时的关闭和激活特定酶的表达,核糖开关作为一种高效可控的遗传元件,在酶工程中具有良好的应用前景。(本文来源于《第十一届中国酶工程学术研讨会论文摘要集》期刊2017-10-18）
李新风,何进[4]（2017）在《c-di-GMP核糖开关的结构、功能与应用》一文中研究指出核糖开关是mRNA 5'-非翻译区(5'-UTR)的一段RNA序列,包含可以识别并结合配体的保守序列——适配体区(Aptamer domain,AD),以及结构多变可以调控下游编码基因的表达平台区(Expression platform,EP)。当代谢物分子浓度比较高时,其与适配体区结合,引起下游的表达平台区发生构象变化,进而实现对下游基因的调节。对下游基因的调节可以在转录水平通过形成终止子/抗终止子或在翻译水平形成隔离子/抗隔离子实现。目前已经发现二十多种核糖开关,它们识别不同的配体分子,调控多种多样的生理功能。我们通过生物信息学的方法在全基因组范围内对己完成测序的3079个原核生物基因组中核糖开关的分布、种类以及下游调控基因的功能进行研究~([1])。结果表明,绝大多数的原核生物中都含有核糖开关,其下游调控的基因种类繁多,尤其参与调控各种各样的酶类。COG(Cluster of orthologous groups of proteins,蛋白质直系同源簇)注释结果显示,核糖开关下游调控基因功能主要富集到"辅酶代谢[H]"和"氨基酸的转运与代谢[E]"通路中(图1)。c-di-GMP(Cyclic diguanosinemonophosp-hate,环二鸟苷单磷酸)是细菌体内普遍存在的一类核苷类第二信使,在细菌的代谢调控中处于中心调节的地位,广泛参与调控细菌的生长和分化、群体感应、生物被膜的形成和分泌、运动性、毒力等生理功能。c-di-GMP也可以作为配体分子识别特定的RNA序列,即c-di-GMP核糖开关。目前己发现c-di-GMP-I和c-di-GMP-II两类c-di-GMP的核糖开关。它们通过特异性地结合c-di-GMP,调控种类繁多的下游基因的表达。c-di-GMP-I核糖开关分布广泛,调控众多生理功能。c-di-GMP-II核糖开关具备变构核酶的功能,结合c-di-GMP后在其非典型剪切位点处发生结构变化,调节下游基因表达。COG注释结果显示,c-di-GMP核糖开关下游调控基因功能主要富集到"信号转导机制[T]"以及"细胞运动[N]"通路中。这为c-di-GMP调控细菌的运动和信号转导提供了一种解释。此外,我们实验室还在苏云金芽胞杆菌CT-43中发现了3个串联排布的c-di-GMP-I核糖开关,并成功地将该叁串c-di-GMP核糖开关应用于生物传感器,高效筛选c-di-GMP合成酶[2](图2)。在酶工程研究领域中,需要适时的关闭和激活特定酶的表达,核糖开关作为一种高效可控的遗传元件,在酶工程中具有良好的应用前景。(本文来源于《第十一届中国酶工程学术研讨会论文摘要集》期刊2017-10-18）
马爱静[5]（2017）在《嘌呤核糖开关识别配体小分子的计算研究》一文中研究指出核糖开关(Riboswitch)是一类位于非编码mRNA特定区域上的能够直接结合小分子代谢物并通过构象变化以调控下游目的基因的转录和翻译的RNA结构元件。核糖开关具有高度保守性,对配体小分子识别具有高特异性和选择性,这使其成为一类新型的核酸药物靶点和新型抗生素靶标。嘌呤核糖开关是指特异性识别嘌呤及其嘌呤类似物的核糖开关。嘌呤核糖开关因其结构较为简单,最早解析了其晶体结构,成为目前研究最广泛的模型系统之一。尽管对嘌呤核糖开关在生物化学、遗传和结构等实验方面已展开了较广泛的研究及部分理论研究,但是嘌呤核糖开关识别配体分子作用机制还需要全方面、多层次的研究。分子动力学模拟可以从原子水平上来分析嘌呤核糖开关与配体小分子的作用特点,可以将配体与嘌呤核糖开关相互作用的微观结构信息与实验上宏观特性相联系,有利于进一步的理解嘌呤核糖开关的分子识别机制,对嘌呤核糖开关作为新型药物靶标和新型抗生素靶点的研发提供理论支撑。本论文基于分子动力学模拟和热力学积分算法研究了嘌呤核糖开关特异性识别嘌呤及其类似物的本质,并进一步研究了复合物构象变化和配体高选择性的机制。选用AMBER力场和TIP3P水分子模型,对研究体系进行了全原子分子动力学模拟。主要研究了四个配体(GUA、6GU、2BP和XAN)与两个不同类型的嘌呤核糖开关(鸟嘌呤核糖开关及其C74U变异)的相互作用和核糖开关的构象变化,具体包括以下内容,用热力学积分算法计算了鸟嘌呤核糖开关(GR)结合四个配体的相对结合自由能,研究了GR复合物相对其C74U变异(GRA)复合物的相对结合自由能,并分析了配体分子分别与两类核糖开关作用的氢键形成、关键残基对配体的识别、6GU/2BP和GUA复合物比对、嘌呤核糖开关关键残基C74突变成U74以及和配体结合后的构象变化情况等。主要研究结果如下:1.热力学积分计算相对结合自由能。用热力学积分算法计算了GUA结合鸟嘌呤核糖开关(GUA-GR)相对其他叁个配体复合物的相对结合自由能。基于相同算法获得GR复合物相对GRA复合物的相对结合自由能预测值。研究结果表明:预测值大小顺序与实验数据相符合;范德瓦尔斯相互作用和极性相互作用在核糖开关与不同配体作用和不同核糖开关与相同配体作用中贡献大小不同;同时,表明了极性相互作用对嘌呤核糖开关识别配体分子的选择性起重要作用。2.配体与核糖开关关键残基的识别和相互作用。利用氢键分析和结合自由能分解法得到了鸟嘌呤核糖开关识别配体小分子的六个关键残基,分别是A21、U22、U51、A52、C74和U75。残基U51和C74在结合配体时形成氢键,主要表现为静电相互作用,而A21、U22、A52、U75则在此过程中表现为碱基堆迭作用,即范德华力。3.配体结合的构象变化。长时间的分子动力学模拟(1微秒)发现,根据是否识别配体,嘌呤核糖开关分为结合配体的关闭状态和未结合配体的开放状态两种。嘌呤核糖开关在结合配体时有着适度的折迭,当去掉配体后,构象重组会造成更大的构象变化。4.C74突变成U74的影响。通过分析表明,嘌呤核糖开关的高特异选择性主要取决于74号残基。当C74突变为U74时,大大影响了GUA的亲和力。对比其他嘌呤类似物可知,U74和C74识别不同配体,其构象重组和结合模式发生变化。这对今后设计高选择性的新型配体具有指导意义。本论文主要内容分五章。第一章为绪论部分,主要介绍了核糖开关的结构功能关系,分类方式以及调控机制;嘌呤核糖开关的结构功能,目前国际研究进展及未来应用前景。第二章主要介绍了分子动力学模拟的基本思想,包括分子动力学模拟方法的基本理论,力场及其分类,AMBER软件/力场和动力学模拟在嘌呤核糖开关的应用。第叁章是研究对象与方法。主要介绍了模拟前期的系统准备、具体分子动力学模拟方法和热力学积分算法。第四章为研究结果与分析。首先利用热力学积分算法计算了鸟嘌呤核糖开关(GR)结合四个配体的相对结合自由能,GR复合物相对GRA复合物的相对结合自由能,预测值与实验值对比分析、四个配体分别与两类核糖开关作用的氢键形成、结合自由能分解法分析了关键核苷酸对配体的识别、不同复合物之间结合模式的比对、嘌呤核糖开关关键残基C74突变成U74和配体结合后的构象变化情况。第五章为总结和展望,总结了本文工作的主要结论和创新点。希望本文研究能够辅助实验研究促进对嘌呤核糖开关识别配体的认识,并对相关新药设计和研发提供理论支持。(本文来源于《山东师范大学》期刊2017-05-21）
郑军[6]（2017）在《SHAPE化学探测法预测SAM-V核糖开关二级结构》一文中研究指出近几十年来,越来越多的研究表明RNA的非编码基因能够在转录及转录后水平上调节蛋白编码基因的表达,具有应用在诊断和治疗疾病等多方面的潜在价值。RNA的非编码基因包含非编码RNA和编码蛋白的mRNA的非编码区(untranslated region,UTR)。对于编码蛋白的mRNA的研究,人们通常喜欢研究mRNA的可读框(open reading frame,ORF),而对于mRNA非编码区的研究却较少。但在2002由Breaker研究小组发现和证实位于mRNA非编码区的某些结构元件同样能够调节基因的表达,并且将这种结构命名为“riboswitch”(核糖开关)后,从此掀起了核糖开关研究热。核糖开关位于mRNA的非编码区(UTR),在大多数细菌、真菌和植物中都有广泛的分布,是一类能够通过与代谢小分子结合引起构象变化从而调控下游基因表达的mRNA分子。目前已经有许多文献报道了核糖开关的诸多应用,比如核糖开关参与新基因的研究和基因表达调控以及核糖开关为新型分子传感器和新型抗生素的研制提供了新思路等。由于核糖开关的诸多应用,近几十年来,越来越多的研究者们开始将研究重点放在核糖开关的研究上。目前,核糖开关的种类已经发现了20多种,其中S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)核糖开关家族由于其成员最多,调控机理最多样化从而成为人们主要关注的对象。现在已经报道了SAM核糖开关家族的五个成员,分别为SAM-I~SAM-V型核糖开关,它们因结合同一配体S-腺苷甲硫氨酸而得名。SAM-I~SAM-III型核糖开关结构和功能已经被诸多生物学专家所研究报道,而SAM-IV和SAM-V型核糖开关的结构和功能却是现有的报道较少。其中有关SAM-V核糖开关结构的报道仅是对其二级结构的预测,由于SAM-V型核糖开关和SAM-II型核糖开关的保守序列及其相似,它的二级结构也是根据SAM-II型核糖开关预测的。对于核糖开关结构和功能的研究通常通过X射线晶体衍射和多维核磁共振等技术对其晶体进行分析。虽然通过这些技术可以直观的看到核糖开关的叁维结构图以及配体的结合位点,但却不能检测出核糖开关在结合配体前后的结构变化。本文的立意点和创新点是利用SHAPE化学法研究SAM-V核糖开关RNA保守序列在结合配体SAM前后的二级结构变化的情况,为后续的研究其晶体结构做好前期的铺垫。SHAPE化学法是目前应用于分析和预测RNA二级结构最简便也最实用的一种化学方法,它的基本原理是利用一种亲电试剂和RNA松散结构上的2位羟基发生反应,形成稳定的加成物,在后期的反转录过程中在此位点变会终止转录,这样便形成了不同大小片段的c DNA片段,通过后续的跑胶或者微卫星检测确定修饰位点,进而分析RNA二级结构。本项研究起初在根据Kevin A Wilkinson,Edward J Merino&Kevin M Weeks在2006 NATURE上发表的‘Selective 2?-hydroxyl acylation analyzed by primer extension(SHAPE):quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution’文章里的SHAPE步骤完成SAM-V的SHAPE实验时发现存在一系列问题,如SHAPE实验结果中,c DNA全长消失,修饰信号较低等。因此本项研究的第一步工作是先对SHAPE化学法进行优化,得到一个较优的可用于SAM-V核糖开关的SHAPE实验体系,从而为后续的分析预测SAM-V核糖开关保守序列在结合配体SAM前后的二级结构变化打下坚实的基础。SHAPE化学探测法应用在预测RNA二级结构中的一般步骤包括:RNA的纯化,RNA的折迭,RNA的修饰,RNA的引物延伸以及最后的测序结果分析。从中可以看出获得纯净的RNA是至关重要的一步,本项研究通过体外转录获取目的RNA,体外转录需要目的基因和T7 RNA聚合酶,其中获得目的基因又需要Taq DNA聚合酶。因此本项研究的第一步是将Taq和T7质粒导入BL21感受态细胞进行表达和纯化,获得实验所需的工具酶。通过PCR扩增技术获得目的基因SAM-V的结构模板,然后通过体外转录获取足够的目的RNA,再通过聚丙烯酰胺凝胶分离,离心浓缩等步骤获得纯净的目的RNA。本项研究起初根据文献里报道的SHAPE化学实验里描述的步骤,选择目的RNA的初浓度为0.1μM,修饰物NMIA的浓度为13m M完成SHAPE实验时,发现最后的SHAPE实验结果是失败的。因此研究针对RNA的初浓度和修饰物NMIA的浓度进行优化。根据SHAPE化学实验的步骤,首先对RNA的初浓度进行优化,在得到较优的RNA初浓度后,在较优的RNA初浓度的基础上在进行NMIA浓度的优化,所得实验结果使用聚丙烯酰氨凝胶检测同时进行荧光检测分析。其中有关SAM-V核糖开关RNA初浓度优化的结果表明,当反应体系为10μl,反转录酶都为1μl时,RNA初浓度在0.3μM和1μM时,最后SHAPE实验结果的RNA全长较低,RNA初浓度在2-6μM时,SHAPE实验结果的RNA全长较浓且无较大差别,因此决定在后续SHAPE实验时选用RNA初浓度2μM完成SHAPE实验;修饰物NMIA的优化结果表明,随着修饰物(NMIA)浓度的增加,SHAPE化学实验得到c DNA的全长浓度逐渐降低,并且随着修饰物(NMIA)浓度的增加,修饰信号也逐渐减弱,当NMIA的浓度为13m M时,SHAPE实验结果的全长已经较低同时测序信号也较弱,此种实验结果不利于最终的结果分析,当NMIA的浓度为1.3m M时,SHAPE实验结果的全长较浓同时测序信号也较好,此种实验结果有利于最终的结果分析,可用于最后的RNA二级结构的分析预测。最后利用优化后的SHAPE实验数据完成SAM-V核糖开关二级结构的初级预测发现,实验结果与文献所报道的SAM-V核糖开关二级结构有几个位点差异,但是其最终结果有待于研究证实。(本文来源于《东华大学》期刊2017-01-11）
毕茹茹,范文廷,马萍,顾兵[7]（2016）在《核糖开关在细菌耐药性中的应用进展》一文中研究指出近年来,多重耐药菌日益泛滥,细菌耐药现状越来越严峻,传统的抗生素的抗菌作用有限,急需我们研发新的抗菌策略。核糖开关(riboswitch)是直接结合小分子化合物及代谢物发生构象变化而调控下游基因表达的RNA片段。随着核糖开关研究的不断深入,发现其在研发新型抗生素的靶点、与配体结合的抗菌效应、测序技术应用及发现新型耐药机制方面都有极大的应用潜力。核糖开关的发现拓宽了抗菌机制,为耐药性研究提供了新的思路,将会在医疗领域发挥重大作用。本文就其在核糖开关细菌耐药性的潜在应用做一综述。(本文来源于《临床与病理杂志》期刊2016年09期）
马爱静,扈国栋,王吉华[8]（2016）在《鸟嘌呤核糖开关识别配体小分子》一文中研究指出鸟嘌呤核糖开关是一类位于mRNA的非翻译区,可直接结合有机代谢物,通过调整自身构象变化从而调控基因表达的mRNA元件.鸟嘌呤核糖开关识别配体具有高度特异性和选择性.用动力学模拟的方法,研究鸟嘌呤核糖开关特异识别配体小分子的本质和用热力学积分算法计算核糖开关与配体分子的相对结合自由能.研究发现,核糖开关的结合口袋与配体通过氢键形式相互作用,不同配体与核糖开关结合的亲和力不同.嘌呤配体2-号位对核糖开关的结合必不可少,6-号位对核糖开关的结合关系复杂.(本文来源于《德州学院学报》期刊2016年04期）
范青云[9]（2016）在《苏云金芽胞杆菌BMB171中c-di-AMP核糖开关调控机制的研究》一文中研究指出环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)是新近发现的一种核苷类第二信使分子,调控着细菌的多种生理功能,包括渗透压的调节、脂肪酸的合成以及离子的运输等。二腺苷酸环化酶(含有保守的DAC结构域)和磷酸二酯酶(含有保守的DHH-DHHA1或HD结构域)分别负责c-di-AMP的合成与降解。c-di-AMP普遍在翻译后水平发挥功能,通过影响受体蛋白的结构与功能来调控细菌的各种生理过程。近来研究表明,c-di-AMP也可以通过核糖开关在转录水平或转录后水平调控细菌的生长代谢过程。核糖开关是位于转录本5'-UTR或3'-UTR的RNA元件,在与配体特异结合后,导致自身结构发生变化,从而调节下游基因的表达。Rfam数据库显示,苏云金芽胞杆菌BMB171中存在四个c-di-AMP核糖开关,我们依据它们在基因组上的先后顺序,将其分别命名为Bt1、Bt2、Bt3和Bt4。Bt1下游基因编码假定蛋白,Bt2下游基因编码Kdp家族蛋白,Bt3下游基因编码氨基酸透性酶,Bt4下游基因同样编码假定蛋白。本研究首先通过序列比对,发现这四个核糖开关广泛分布于Bacillus cereus group菌株中,且在基因组上的位置比较保守。接着我们对这四个核糖开关的二级结构进行了分析。经Softberry网站的FindTerm软件的预测得知,核糖开关Bt2和Bt3适配体区的下游存在不依赖于p因子的终止子结构,因此,这两个核糖开关通过形成终止子或抗终止子结构在转录水平上调节下游基因的表达。而在核糖开关Bt1和Bt4适配体区的下游并没有预测到终止子结构,可能存在其他未知的调控模式。我们首先构建了表达载体pHT1K-PxlacZ(Px为P1、P2、P3或P4,分别表示含有核糖开关Bt1、Bt2、Bt3或Bt4的启动子区),将其分别电转入出发菌株BMB171和c-di-AMP合成酶双敲菌株ΔdisAΔcdaS中,实验结果表明在低c-di-AMP浓度的ΔdisAΔcdaS菌株中,β-半乳糖苷酶活性升高。其次通过RT-qPCR实验发现,AdisAΔcdaS菌株中四个核糖开关下游基因的转录量也都升高。接着我们将表达载体pRP-Btx-/acZ(x 表示 1、2、3 或 4)和 pET28b-disA 共转化入大肠杆菌 BL21(DE3)中,通过对β-半乳糖苷酶活性的验证发现当c-di-AMP浓度升高时,β-半乳糖苷酶活性降低,因此异源验证了核糖开关的下游基因受到c-di-AMP的抑制。最后通过双荧光报告系统进一步验证了这四个核糖开关属于“关”的核糖开关。综上所述,核糖开关Bt1、Bt2、Bt3和Bt4与c-di-AMP作用后,能够抑制下游基因的表达。接下来,本课题选取核糖开关Bt2下游的kdp操纵子进行了深入研究。我们首先通过RT-PCR实验确定了 BMB171中的kdp操纵子的六个结构基因sipW、kdpF、kdpA、kdpB、kdpC和kdpD存在共转录。然后通过RT-qPCR实验发现kdp操纵子在钾离子浓度为1 mM时的表达量是钾离子浓度为30 mM时的10倍以上,低钾环境能够诱导kdp操纵子的表达。接下来,我们将含有表达载体pHT1K-P0-lacZ(P0表示仅含启动子区,不含核糖开关Bt2)和pHT1K-P2-lacZ的菌株在高钾与低钾培养基中培养,β-半乳糖苷酶活性实验的结果表明,BMB171中kdp操纵子的启动子活性并不受低钾环境的影响,核糖开关Bt2能够感应胞内钾离子的浓度变化从而调控kdp操纵子的表达。当钾离子的浓度低时核糖开关处于“开”的状态,下游基因表达量高,当钾离子的浓度高时核糖开关处于“关”的状态,下游基因表达量低。最后我们敲除了染色体上的核糖开关Bt2和kdpD基因,RT-qPCR实验结果表明ΔBt2菌株中的ksp操纵子不再受到低钾环境的诱导,而ΔkdpD菌株中的kdp操纵子仍可受到低钾环境的诱导。以上结果表明,BMB171菌株中kdp操纵子5'-UTR的核糖开关Bt2为调控其表达的关键元素,它既能够响应细菌体内的钾离子浓度,又可以受到c-di-AMP的调控。总之,本课题不仅证实了 BMB171菌株中四个受c-di-AMP调控的核糖开关,而且发现其中Bt2不仅受c-di-AMP,还受K+的调控,丰富了钾离子转运系统kdp操纵子的调控机制。(本文来源于《华中农业大学》期刊2016-06-01）
王静[10]（2016）在《基于核糖开关筛选体系的产N-乙酰神经氨酸重组大肠杆菌的进化》一文中研究指出核糖开关作为合成生物学研究中一类重要的核心元件,由配体结合区和表达调控区两部分组成,配体结合区通过与配体分子的结合而引起表达调控区域的结构变化,从而影响到表达调控区域下游基因的表达。天然存在的核糖开关在细菌细胞的代谢通路调控中起着重要的作用,诸如氨基酸的转运与结合、嘌呤碱基核苷酸的合成等,但由于其存在的数量及种类较少不能满足目前研究的需要,研究者们已开发出配体指数富集系统进化技术(SELEX),人工设计出可响应目的化合物的核糖开关,这大大扩展了核糖开关在合成生物学研究中的应用。N-乙酰神经氨酸(NeuAc)是一类最常见的唾液酸,同时也是合成其他多种唾液酸的重要前体物质,在自然界中广泛地存在。N-乙酰神经氨酸在许多生理和病理过程中发挥着重要的作用,在制药领域也有着很大的应用潜力,因此,它的合成与应用已经引起了科学研究者广泛的关注。我们实验室通过微生物代谢工程技术在大肠杆菌体内构建了一条N-乙酰神经氨酸的合成途径,并取得了很好的效果。但传统的代谢工程中,每一步的代谢改造,每一个代谢合成元件的替换,都需要发酵实验进行产量的验证,过程耗时耗力,且结果并不十分理想。如果将细胞内合成神经氨酸的量与可直接观察或易于检测的外向表征连系起来,就可以大大简化代谢改造的过程,缩短菌株进化的时间。本研究根据前人筛选获得的响应神经氨酸的核糖开关,设计了开关筛选组件,将神经氨酸的产量与细胞的生长相偶联。此核糖开关由可结合神经氨酸的适配子区和可进行自剪切的锤头型核酶两部分构成,适配子区通过与神经氨酸的结合而改变开关的构象引起核酶的自剪切,从而降低下游基因的mRNA的丰度。将下游基因设计为可影响细胞生长的报告基因,即可完成筛选组件的构建。参照文献报道利用重组PCR的方法合成了此神经氨酸核糖开关序列,并将其下游连上gfp绿色荧光蛋白报告基因,得到开关验证质粒pE-rsgfp,并将其转化入大肠杆菌DH5α中,通过外源添加神经氨酸的培养实验,发现随着神经氨酸添加量的增多,菌液的相对荧光强度减弱,验证了此核糖开关可以在大肠杆菌体内响应神经氨酸并抑制下游报告基因的表达。验证了神经氨酸核糖开关的体内活性后,本实验将下游的gfp替换为tetA四环素抗性基因,构建得到神经氨酸核糖开关筛选组件。tetA表达的TetA蛋白是一种结合在细菌细胞膜上的双向转运蛋白,可向胞外运出四环素,向胞内运入镍离子,而镍离子对细胞的生长有毒害作用。在培养基中添加一定浓度的镍离子的前提下,当细胞内存在神经氨酸时,神经氨酸会结合在核糖开关上抑制tetA的表达,那么TetA运入细胞内的镍离子较少,使得细胞获得较快的生长速率,通过多次转接多轮进化,就可使高产神经氨酸的细胞得到富集。将构建好的核糖开关筛选组件通过外源添加和内源合成神经氨酸两种方式验证了功能之后,将其构建在质粒p15A上,得到开关筛选组件质粒p15A-rstetA;将实验室保存的神经氨酸生产质粒pB上的四个基因neuB、slr1975、GNAg1、glmS的RBS区域随机化得到一个质粒突变库pBM,以期通过优化神经氨酸合成途径中关键基因的表达强度来提高神经氨酸的产量。将质粒库pBM转入已含有p15A-rstetA的神经氨酸生产菌株大肠杆菌DN5中,在添加有镍离子的进化培养基中开始进化过程,每轮转接叁次,共进行叁轮,最终筛选富集得到含有质粒库中相对高产神经氨酸质粒的大肠杆菌,证明了本论文所构建的NeuAc核糖开关筛选组件可响应胞内合成的N-乙酰神经氨酸并对下游基因进行调控,在合适的筛选培养基和镍离子浓度下,可对高产神经氨酸的菌体细胞进行富集。本实验成功地构建了可响应大肠杆菌胞内神经氨酸并调控下游基因表达的神经氨酸核糖开关筛选组件,并通过进化从产神经氨酸质粒突变库中富集得到高产质粒,为N-乙酰神经氨酸的微生物代谢改造生产提供了新的研究思路与策略。(本文来源于《山东大学》期刊2016-05-20）
核糖开关论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
微生物菌株因生长速度快,操作技术日趋成熟、便于扩大生产、环境友好、代谢终产物浓度高且易分离纯化等优点,而被认为是具有高经济附加值化合物异源合成的理想宿主。然而,目前的重组菌株在生产效率和产量上仍无法符合工业化生产的要求。与传统基于转录因子的代谢调控手段相比,近年报道的核糖开关对配体的响应更为快速,而且结构简单,便于改造。本研究以黄酮类化合物代谢的重要中间产物柚皮素为核糖开关的小分子配体,利用体外SELEX筛选获得能与柚皮素特异识别的适体库,进而以tetA双选择标记基因作为报告基因,在生物体内通过两条不同柚皮素浓度的筛选路径,富集获得具有不同最适检测适应范围的核糖开关库。经测序和柚皮素剂量响应测定证实,所得核糖开关的动态输出荧光激活率范围在1.68-2.77倍,MID系列核糖开关的线性响应范围约在5-100 mg L-1柚皮素,HIGH系列核糖开关的线性响应范围约在80-200 mg L-1柚皮素。本研究继而选用除柚皮素外的27种黄酮类化合物对6个人工核糖开关(M1、M2、M3、O、L、H3)进行平时筛选,以研究人工核糖开关的专一性识别特性,并根据各化合物的物理化学性质及其对应的绿色荧光激发强度,采用支持向量回归法的QSPR建模分析,对核糖开关M1、M2和O建立了具有良好预测能力的鲁棒性模型。通过对与模型呈高度相关的描述符分析知,核糖开关M1和M2有着非常类似的结构特点,其与配体分子结合的适体域应是一个富集正电荷的亲水性区域,该区域对配体分子中的脂肪酮结构具有特异性的识别,对C-3'和C-4'位羟基敏感。而核糖开关O的适体域却极有可能是一个单位体表面积比较小的疏水性区域,它与核糖开关L对多羟基黄酮类化合物的响应力更高。此外,实验结果还表明类黄酮分子结构中A环上的取代基团在核糖开关的激活过程中并不起主要作用。O-糖基化黄酮类衍生物可能受到空间位阻影响,对本研究中的人工核糖开关都不具激活作用。当前,研究人员对合成生物学代谢途径的设计与改造能力已远超所知筛选技术的筛选能力,设计验证的进程也因此被大大拖后。本研究应用上述人工合成RNA核糖开关,首次将共培养的概念应用于高通量筛选策略。本研究指出了影响人工核糖开关传感器性能的一系列关键操作参数,如核糖开关的启动子、核糖开关制动元件中的连接序列及其它会引起胞内RNA空间构象变化的因素、传感系统的宿主菌、发酵时间和培养基等。基于此,构建了双荧光标记的传感器模块(菌),实践了该模块与另一个柚皮素生物合成模块(菌)在共培养后,显示出绿色荧光激发强度与柚皮素产量间具有高度正相关性,建立了一种可信、快捷的高通量筛选方法。研究首次成功构建了具有生物活性的响应柚皮素的RNA核糖开关,评估了核糖开关的柚皮素剂量响应特性、动态检测范围和识别特异性等。尽管目前对RNA空间构象的检测手段还比较有限,但QSPR建模有助于阐明核糖开关-配体复合物结合过程中的理化结构特性。生物感应模块(菌)-代谢物合成模块(菌)共培养技术是对已有微生物共培养技术应用的拓展,并可以扩展到任何适宜的代谢物高通量筛选中。由于模块菌将负责生产的微生物和负责检测的微生物分割成各自独立的个体,从而省去了研究人员在后续模块优化等其它研究中需要更换或取出生物传感器的步骤。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
核糖开关论文参考文献
[1].魏昭,刘青,邹民吉,李丽,陈瑶.不同核糖开关对下游靶基因调控效能的对比研究[J].军事医学.2018
[2].修宇.基于RNA核糖开关调控的类黄酮生物传感器的构建与应用[D].北京化工大学.2017
[3].李新风.c-di-GMP核糖开关的结构、功能与应用[C].第十一届中国酶工程学术研讨会论文摘要集.2017
[4].李新风,何进.c-di-GMP核糖开关的结构、功能与应用[C].第十一届中国酶工程学术研讨会论文摘要集.2017
[5].马爱静.嘌呤核糖开关识别配体小分子的计算研究[D].山东师范大学.2017
[6].郑军.SHAPE化学探测法预测SAM-V核糖开关二级结构[D].东华大学.2017
[7].毕茹茹,范文廷,马萍,顾兵.核糖开关在细菌耐药性中的应用进展[J].临床与病理杂志.2016
[8].马爱静,扈国栋,王吉华.鸟嘌呤核糖开关识别配体小分子[J].德州学院学报.2016
[9].范青云.苏云金芽胞杆菌BMB171中c-di-AMP核糖开关调控机制的研究[D].华中农业大学.2016
[10].王静.基于核糖开关筛选体系的产N-乙酰神经氨酸重组大肠杆菌的进化[D].山东大学.2016