一、地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达（论文文献综述）
檀瑞婷[1]（2020）在《Pyrococcus furiosus超高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的表达研究》文中指出α-淀粉酶又称淀粉-1,4-糊精酶,也命名为α-1,4-D-葡聚糖-葡萄糖苷水解酶,其作用于淀粉时,可以从淀粉、多聚糖或寡聚糖分子内部随机地切开α-1,4-葡萄糖苷键,产生葡萄糖、麦芽糖和低聚糖等。α-淀粉酶在食品、药品、纺织、造纸等工业领域广泛应用。超高温α-淀粉酶是指最适温度在90℃以上的α-淀粉酶,它具有更优越的的酶学特性,使得它更适用于淀粉的喷射液化工艺,提高淀粉加工生产效率,降低生产成本。枯草芽孢杆菌是一类革兰氏阳性杆状好氧型细菌,也是芽孢杆菌中的模式生物,被美国食品药物管理局（FDA）和中国农业部等部门批准为食品安全微生物（GRAS）。因此,利用枯草芽孢杆菌表达系统来生产酶制剂在工业上具有很大的价值。实验室前期对枯草芽孢杆菌表达系统有一定研究和改造,现拥有良好的枯草芽孢杆菌表达宿主。本研究将来源于极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus的超高温α-淀粉酶（PFA）基因在Bacillus subtilis中表达,并测定重组超高温α-淀粉酶的酶学性质。通过信号肽筛选、伴侣蛋白共表达和热处理等方式,有效提高PFA在枯草芽孢杆菌中重组表达的胞外酶活。最后在在摇瓶基础上,对发酵培养基成分和发酵条件进行优化,并对优化后的发酵液进行热处理。主要研究结果如下:（1）将极端嗜热古菌P.furiosus来源的超高温α-淀粉酶基因与表达载体pHY300PLK构建成重组质粒pHY300PLK-pfa,并转化宿主B.subtilis WS9中进行重组表达,测得重组菌株胞外酶活为18.33 U·m L-1。探究了重组超高温α-淀粉酶的酶学性质。酶学性质结果显示,重组超高温α-淀粉酶的最适反应温度为100℃,最适反应pH为5.0,且在100℃条件下处理4 h,还保有60%的酶活,重组酶具有非常好的热稳定性。（2）为了提高PFA的重组异源表达,通过应用高通量筛选系统,对枯草芽孢杆菌的173种信号肽进行筛选,得出两种优良信号肽,其中包括Sec途径的YfhK和另一种新的信号肽AspB’。用它们替换表达载体pHY300PLK-pfa上的原始信号肽来构建新的重组表达质粒,并转入宿主B.subtilis WS9中进行发酵培养。结果表明,在37℃下发酵培养60 h,以YfhK作为信号肽的重组菌株胞外酶活可达60.73 U·m L-1,胞外酶活提高了约3.31倍;以AspB’作为信号肽的重组菌株胞外酶活可达119.01 U·m L-1,提高约6.49倍。（3）对于极端嗜热古菌来源的超高温α-淀粉酶在嗜温宿主中异源表达会产生包涵体的问题,实验采用伴侣蛋白共表达策略来进行改善。伴侣蛋白有辅助蛋白折叠、使胞内前体蛋白保持可运输状态等功能。首先选择了来源于枯草芽孢杆菌的伴侣蛋白prsA,构建共表达重组质粒pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa,转入宿主B.subtilis WS9,在TB培养基中摇瓶发酵60 h,胞外酶活达134.15 U·m L-1。较初始表达,提高约7.32倍。再选择来源于嗜热古菌P.furiosus来源的伴侣蛋白Pfefoldinγ和PPlase。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术在B.subtilis WS9基因组中分别插入Pfefoldinγ和PPlase的基因,获得基因组上含有伴侣蛋白基因的宿主菌B.subtilis WS9dinγ和B.subtilis WS9PPlase。将重组质粒pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa转化这两种宿主菌,获得同时含有两种伴侣蛋白组合prsA/Pfefoldinγ和prsA/PPlase共表达的重组菌。两种重组菌摇瓶发酵培养60 h,胞外酶活分别可达145.54 U·m L-1,156.67 U·m L-1,较初始表达提高了约7.94倍和8.55倍。（4）在对重组菌发酵培养的过程中,发现重组菌株随着摇瓶发酵培养时间（≤300 h）的增加,酶活逐渐增加。超高温酶热稳定性较好,为了加快超高温α-淀粉酶的有效可溶性表达,对发酵后含菌体的发酵液进行热处理,发现该方法能明显提高超高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的可溶性表达。将重组菌B.subtilisWS9PPlase（pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa）发酵72 h,胞外酶活达233.26 U·mL-1,热处理（90℃水浴加热15 min）含菌体的发酵液样品,离心取上清,此时上清中的超高温α-淀粉酶酶活可达1456.65 U·mL-1。取发酵120 h含菌体的发酵液离心,彻底吸去上清,并加入1 m L去离子水悬浮菌体,90℃热处理15 min,离心获得水悬上清,测定各部分酶活,胞外上清酶活为673.19 U·mL-1,水悬上清酶活为1507.42 U·m L-1,此时总酶活达2108.61 U·mL-1。在摇瓶水平上对重组菌B.subtilis WS9PPlase（pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa）进行发酵条件优化。摇瓶优化结果显示最佳培养基组合成分为:18 g·L-1西王大豆蛋白胨和9 g·L-1的安琪酵母浸粉组成的复合氮源,5 g·L-1葡萄糖的碳源,10 mM Ca2+和3 mM Al3+的金属离子浓度,pH 7.0的初始培养基pH值,33℃的发酵培养温度。发酵培养60 h胞外酶活为282.60 U·m L-1,较优化前提高了约1.80倍。热处理含菌体的发酵液,此时胞外酶活可达1302.79 U·mL-1。摇瓶发酵相同时间内胞外酶活较初始表达总得提高约71.08倍。3-L罐发酵培养120 h,胞外可溶性酶活可达3806.69 U·mL-1。
顾燕,汤伟,王悦,戴宝,卢德鹏,许向阳,何增国[2]（2020）在《耐高温α-淀粉酶分子结构与异源表达研究进展》文中研究指明耐高温α-淀粉酶是数千年前即取得工业化应用的重要工业用酶。由于其具有热稳定性好、液化彻底、易保存等优势,在淀粉制糖、味精、啤酒等食品发酵以及纺织印染等行业都有着广泛的应用。本文首先就耐高温α-淀粉酶的菌种来源、结构与功能、α-淀粉酶酶活性提升、基因工程菌的构建等方面已取得的研究成果进行综述,然后对耐高温α-淀粉酶外源表达最新研究成果进行了总结。文章最后分析讨论了在耐高温α-淀粉酶开发方面国内现有水平与国际领先水平的差距,以期为耐高温α-淀粉酶的开发提供参考及思路。相信随着代谢工程和过量表达等技术手段的相继应用及业界的持续努力,我国耐高温α-淀粉酶的开发必将取得飞跃式发展。
蒋蕊[3]（2019）在《α-淀粉酶共表达系统的研究及在枯草芽孢杆菌中最优信号肽的筛选》文中进行了进一步梳理现如今,α-淀粉酶大量用于食品、饲料产业中,本研究试图通过优化枯草芽孢杆菌表达系统中的信号肽,从而提高淀粉酶产量,解决淀粉酶异源表达中出现的“瓶颈”。另外,随着人们对酶制剂应用的多元化,希望一个蛋白具有多种酶学特性,使生产成本得到降低,因此开发多功能组合酶制剂将成为一定的趋势。在研究淀粉酶的基础上,通过对木聚糖酶和α-淀粉酶融合蛋白共表达的研究,帮助我们更深刻地了解到共表达系统的作用机制,为今后关于不同酶制剂之间融合蛋白的共表达提供一些有价值的参考。1、本研究以曲霉属（Aspergillus lacticoffeatus）的α-淀粉酶AmyCBS 101883和瘤胃真菌类（Neocallimastix patriciarum）木聚糖酶XynCDBFV作为主要研究对象,利用Linker Database数据库筛选三条适用于糖苷水解酶类的连接肽,通过基因重叠延伸技术（Splicing by Ovedap Extension,SOE）的手段构建出木聚糖酶与α-淀粉酶的共表达融合蛋白。并将其分别导入大肠杆菌与毕赤酵母中诱导表达。以单一酶Amy-E2和Amy-pGAP为参照,研究其酶学特性。结论如下:在pH适应性与稳定性方面:Amy-E2与融合蛋白Xyn-Amy-E2中α-淀粉酶最适pH均为7.5,当pH低于7.0时Amy-E2酶活迅速下降,而Xyn-Amy-E2在pH 4.5-7.5之间其相对剩余酶活仍保持在70%以上,在酸性条件下有较好的适应性。Linker 1连接的融合蛋白,不仅在pH 6.5及pH 7.5的环境下相对剩余酶活仍保持在95%左右,pH 8.5碱性条件下的适应性也最优,且使融合蛋白中的α-淀粉酶活性提高了23%。此外,在真核表达系统中,α-淀粉酶的pH适应性均属中偏碱性,且融合蛋白α-淀粉酶在酸性条件下优于参照酶。在温度适应性与稳定性方面:Xyn-Amy-E2热稳定性最优,耐受处理50 min后接近半衰期。融合蛋白Xyn-L2-Amy-pGAP和Xyn-L3-Amy-pGAP在55-70℃范围内有很好的适应性,相对剩余酶活在65%以上,优于参照酶Amy-pGAP。通过以上融合表达发现:在同一表达系统中,融合后表达的α-淀粉酶活性均低于单一α-淀粉酶。Xyn-Amy、Xyn-L1-Amy、Xyn-L2-Amy、Xyn-L3-Amy分别下降了36.9%、21.6%、59.0%、39.0%。当引入连接肽Linker 1时,使融合α-淀粉酶活性提高了23%。大肠杆菌中α-淀粉酶的平均酶活为0.571 U/mL,真核系统中α-淀粉酶的活性为4.208 U/mL。2、本研究以枯草芽胞杆菌表达系统pBE-S为骨架,构建来源于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）α-淀粉酶基因（DL-3-4-1）的混合信号肽筛选文库。通过电转化的方法转入到枯草芽孢杆菌（B.subtilis）菌株RIK1285中。基于96孔板微量培养,对1920株菌株的发酵液上清进行检测,对酶活位于前100的菌株进行测序。经筛选获得14条优化表达的信号肽:yomL、PhrA、PhrF、YvbX、YoqH、mpr、YuaB、YqxI、YjcM、ywoF、PhrK、peI、YceG、YddT、yobb。其中,引导α-淀粉酶最高效分泌的信号肽yomL,酶活为113.251 U/mL。进一步对其酶学性质进行分析如下:最适pH为6.5,且在中偏碱性条件下的稳定性较好,最适温度为65℃。在65℃、70℃、80℃条件下耐受1 h,其半衰期依次为80 min、70 min、40 min,表明其热稳定性较强。其中Triton x-100、Mn2+、EDTA、Ni2+、Co2+对DL-3-4-1有激活作用;SDS、Al 3+、Cu2+对该酶有一定抑制作用;Ag+、β-mercaptoethanol对该酶完全抑制。此外,该酶对来自植物种子、根茎类的粗淀粉均有很好的水解作用,有较为广泛的运用价值。
刘小胖,张宁,李炳学[4]（2019）在《出芽短梗霉中α-淀粉酶基因的克隆表达及生物信息学分析》文中研究表明为获知出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）α-淀粉酶基因及其功能,为以后的体外功能验证奠定理论基础,对α-淀粉酶基因的克隆及其结构、表达、性质与功能进行了初步分析,采用反转录PCR结合普通PCR技术成功克隆出芽短梗霉α-淀粉酶基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明:克隆的出芽短梗霉α-淀粉酶基因cDNΑ的全长1 782bp,编码区长度1 692bp,编码的蛋白质含有563个氨基酸,分子质量约为63.32kDa,理论等电点（pI）为7.24;预测该蛋白是亲水性蛋白,无跨膜结构域,无信号肽切割位点,在47～453个氨基酸存在淀粉酶结构域。α-淀粉酶的二级结构主要由无规则卷曲组成,其中无规则卷曲占47.42%,α-螺旋占27.35%,延伸链占20.06%,β-转角占4.62%。成功克隆α-淀粉酶基因并在各个时段均有表达,在108h表达量最高。出芽短梗霉普鲁兰多糖的产量随培养时间增加而增加,而粘度随着培养时间增加而降低。
李婷璐[5]（2016）在《耐高温α-淀粉酶定点突变及在枯草芽孢杆菌中的表达》文中进行了进一步梳理淀粉酶作为目前工业上最重要的酶制剂之一,约占整个工业酶生产的50%。其中,耐高温α-淀粉酶由于具备高温条件下水解淀粉的能力,使其在食品、发酵、纺织、造纸等工业都具有极高的用途。目前,工业用的耐高温α-淀粉酶主要为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶（BLA）。然而,使用野生型地衣芽孢杆菌做为生产BLA的发酵宿主具有产酶量小,杂蛋白多等缺陷,因此需要开发新的工程菌来作为BLA表达宿主以满足其大量的工业需求。另外,在某些更加极端苛刻的工业环境下,野生型BLA已经难以满足其要求。开发耐受更高温度,适应更低pH,且不依赖Ca2+的新型耐高温α-淀粉酶已成为淀粉酶研究主要方向之一。本研究首先通过查阅相关文献以及专利,确定了两个BLA氨基酸突变位点,即将野生型BLA成熟肽第190位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸,第264位的谷氨酰胺突变为丝氨酸,从而使其具有更高热稳定性以及更低Ca2+依赖性。随后将突变后的氨基酸序列针对枯草芽孢杆菌表达宿主进行了密码子优化,合成了突变型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因amyLM。在枯草芽孢杆菌168菌株中实现了amyLM的成功表达,90℃下测得耐高温淀粉酶酶活为46U/ml。其次,本研究为进一步提高amyLM在枯草芽孢杆菌中发酵液中的酶活进行了优化。改用缺少8个蛋白酶的枯草芽孢杆菌WB800n工程菌作为表达宿主,并且对强启动子P43介导amyLM的表达进行分子层面的深入研究。通过改变amyLM基因与P43启动子SD序列之间的距离,研究了不同距离对于amyLM表达量的影响,优化了P43的使用方法。结果表明,当使用距离P43启动子的SD序列为9bp的起始密码子ATG作为amyLM的起始密码子时,发酵液中BLA酶活最高,达到422U/ml,是未优化前的9.17倍。本研究中对于P43介导amyLM的表达所进行的分子层面的优化为后续使用P43介导其他外源蛋白的表达提供了思路。最后,本研究还使用麦芽糖诱导型启动子Pglv介导amyLM以及野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因amyL在WB800n中的表达。其中,突变型amyLM在WB800n发酵液酶活分别为268U/ml,是野生型amyL酶活144U/ml的1.86倍。为后期进一步对比研究amyLM与amyL的酶学特性做铺垫。
王慧[6]（2016）在《芽孢杆菌遗传操作体系初建及工程菌株分子改良》文中研究表明芽孢杆菌（Bacillus）是革兰氏阳性菌,不含内毒素,能够将蛋白质分泌到胞外,是多种重要工业酶的生产菌株。随着分子生物学和基因工程的迅速发展,芽孢杆菌作为基因表达系统得以不断完善,并展现出良好的应用前景。本研究旨在建立和优化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）表达系统,对工业用野生型芽孢杆菌的遗传操作系统进行改良,以进一步提高工程菌株的表达量,并建立具有应用潜力的芽孢杆菌高效表达体系。本文首先对枯草芽孢杆菌表达系统载体进行建立及优化,其中包括含有不同启动子的表达载体（如:组成型启动子P43、乳糖诱导型启动子Pgrac、木糖诱导型启动子Pxyl、淀粉酶启动子PamyQ）、含有不同筛选标记的克隆载体（如:卡那霉素Kan、红霉素Em、氯霉素Cm、四环素Tet）、以及含不同整合位点的整合载体的构建;其次对枯草芽孢杆菌转化方法进行优化,有效的提高了遗传转化效率,从而建立了一套完善的枯草芽孢杆菌表达技术,为外源基因的高效分泌和表达提供平台。利用该表达体系,实现了氨肽酶基因lapB在枯草芽孢杆菌中的高效表达,其摇瓶水平上的酶活达到了58.8 U/mL。通过菌种改良获得了能够进行内源性BamHI甲基化修饰的枯草芽孢杆菌菌株,通过对转化质粒的甲基化修饰,以及感受态制备条件的摸索,建立了中温α-淀粉酶工业生产菌株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BF.7658的遗传转化方法。以该高效分泌淀粉酶的菌株为宿主菌,实现了碱性蛋白酶基因的高效异源分泌表达,重组解淀粉芽孢杆菌工程菌株AprEA在摇瓶培养72小时的分泌表达水平可达7800 U/mL,具有较好的应用潜力。解淀粉芽孢杆菌K11是本研究室保存的一株能高效分泌中性蛋白酶的野生型菌株,在摇瓶水平上其中性蛋白酶分泌水平可达到2700 U/mL。为进一步提高其中性蛋白酶的表达水平,本研究克隆了解淀粉芽孢杆菌K11的中性蛋白酶基因K11npr,并构建了游离型表达载体pKan300-K11npr和pUB110-K11npr。将多拷贝的游离型重组质粒转化K11菌株后获得解淀粉芽孢杆菌重组菌F20和110N-6。重组菌F20和110N-6在牛奶初筛平板上的蛋白酶活性明显要高于野生型菌株K11。通过发酵条件优化,重组菌110N-6在摇瓶水平上的酶活力可达到8995 U/mL,比野生型菌株提高了2倍多,在15升发酵罐的酶活力可达到24,000-28,000 U/mL,是目前已报道表达水平最高的中性蛋白酶。重组表达质粒的不稳定性很大程度上限制了含高拷贝游离质粒的重组芽孢杆菌的广泛应用。本研究所构建的两个游离型表达载体pKan300-K11npr和pUB110-K11npr,其最大的差异是前者含有能在大肠杆菌中复制的pBR322-ori复制元件,而后者中只含有芽孢杆菌复制元件。对重组菌的遗传稳定性分析结果表明:重组菌F20的遗传稳定性远远不如重组菌110N-6,在无选择压力的培养基上连续传代,重组菌F20传至第八代后质粒即全部丢失,而重组菌110N-6传至一百代,质粒稳定性仍保持在90%以上。推测表达载体中同时含有两种不同的复制元件可能是质粒在芽孢杆菌中不稳定的重要原因之一。本研究所构建的重组质粒pUB110-K11npr在菌株110N-6中非常稳定,可以满足工业化大生产要求。枯草芽孢菌株AS.1398是经过长期诱变获得的表达中性蛋白酶的商业菌株。通过研究不同浓度的氨苄青霉素对菌株细胞壁合成的抑制作用,建立了AS.1398菌株的遗传转化方法。将重组表达载体pUB110-K11npr导入AS.1398菌株中获得的解淀粉芽孢杆菌重组菌,其中性蛋白酶的分泌能力比AS.1398菌株的酶活力提高一倍,在摇瓶水平上其酶活力可达到9295 U/mL。本研究从多个方面对枯草芽孢杆菌表达系统进行了优化,并尝试了多种野生型芽孢杆菌的转化条件,成功建立了针对野生型芽孢杆菌的遗传转化体系,同时解决了芽孢杆菌中重组质粒不稳定的难题,为工业菌株发展成为新的基因工程表达体系提供新的思路。
李潇,孙海彦,阮孟斌,王霈虹,彭明[7]（2015）在《地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究》文中指出从地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）中克隆到耐高温α-淀粉酶基因全长,构建了原核表达载体,转入大肠杆菌（Escherichia coli）中,使用IPTG于28℃诱导6小时后,通过SDS-PAGE检测到目的蛋白,分子量约为55 kDa,并通过酶活力检测实验证明该蛋白具有耐高温α-淀粉酶活性。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体,通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导瞬时转化烟草（Nicotiana tabacun）下表皮细胞并在荧光显微镜下观察,发现在烟草下表皮细胞的细胞质和液泡中均有绿色荧光。使用I2-KI溶液对乙醇脱色后的烟草叶片进行染色,显色反应表明在烟草中表达的耐高温α-淀粉酶具有酶活性。最后,采用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥（Arabidopsis thaliana）中,筛选到稳定遗传的耐高温α-淀粉酶基因的拟南芥纯合子。研究结果为后期开展表达耐高温α-淀粉酶的转基因植物的相关研究奠定了实验基础。
李潇[8]（2015）在《地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆及在拟南芥中表达的初步研究》文中研究指明淀粉液化是淀粉加工业中的一个重要工艺,目前常用的液化方法是在淀粉中加入外源耐高温α-淀粉酶和淀粉混合后,进行液化处理,这种通过添加外源耐高温α-淀粉酶的方法不仅需要专门的设备和工艺生产耐高温α-淀粉酶,而且工艺复杂,增加了液化的成本。通过基因工程技术将耐高温α-淀粉酶基因转入生产淀粉的植物中,直接获得含有耐高温α-淀粉酶的淀粉类原料,在液化时就可以省去额外添加耐高温α-淀粉酶的步骤,从而简化生产工艺,降低生产成本。因此,本实验通过扩增来源于地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因,将其转入拟南芥及马铃薯中进行表达,希望通过研究耐高温α-淀粉酶在植物中表达的可能性,探索能否在未来实现将耐高温α-淀粉酶在高淀粉含量的植物中表达,从而实现耐高温α-淀粉酶与淀粉原料的同步投放。具体研究结果如下：1.从地衣芽孢杆菌中克隆得到耐高温α-淀粉酶基因全长,构建原核表达载体及酵母真核表达载体,分别转入大肠杆菌和毕赤酵母表达菌株并在含淀粉LB培养基及YPDA培养基上划线,使用I2-KI溶液染色后可明显观察到淀粉被水解后形成的透明圈。将大肠杆菌表达菌株使用IPTG于28℃诱导6小时,SDS-PAGE分析检测到目的蛋白,分子量约为55KDa,证明耐高温α-淀粉酶可以在异种原核微生物和真核微生物中进行表达,且分泌的蛋白具有活性。2.将扩增得到的耐高温α-淀粉酶基因连入植物GFP融合表达载体后转入农杆菌LBA4404,通过农杆菌介导瞬时转化烟草下表皮细胞,荧光显微镜观察发现,在烟草下表皮细胞的细胞质、液泡中均有绿色荧光。使用I2-KI溶液对酒精脱色后的烟草叶片进行染色,发现对照中叶片因无耐高温α-淀粉酶合成,所以淀粉被染成蓝色,而由LBA4404/G1300-α侵染的叶片区域明显无染色效果,说明耐高温α-淀粉酶基因可以被真核植物识别并表达有活性的蛋白。3.利用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥中,筛选得到稳定遗传耐高温α-淀粉酶基因的拟南芥纯合子。使用两种方法检测拟南芥叶片中表达的耐高温α-淀粉酶活性,第一种是从理化角度使用I2-KI溶液对酒精脱色后的拟南芥叶片进行染色,对比野生型拟南芥的叶片,转基因拟南芥叶片中淀粉因被耐高温α-淀粉酶降解,故被染成红褐色,而野生型拟南芥叶片被染成深蓝色。第二种是通过HPLC分析拟南芥叶片研磨液水解淀粉液中葡萄糖、麦芽糖含量的变化,对比标准品峰图及拟南芥研磨液的峰图,可以明显观察到通过液化作用,淀粉水解液中产生了拟南芥研磨液中没有的麦芽糖,从代谢产物的角度可以进一步确定耐高温α-淀粉酶酶活。两种实验方法结果都显示拟南芥叶片中所表达的耐高温α-淀粉酶具有酶活性,可直接用于淀粉的水解。为了研究耐高温α-淀粉酶对植物生长的影响。使用普通MS培养基对拟南芥的表型进行分析,结果显示转基因拟南芥与野生型拟南芥表型方面并没有明显区别,因此证明耐高温Q淀粉酶的表达,不会对植物生长本身造成影响。4.利用农杆菌介导将耐高温a一淀粉酶基因转入马铃薯中表达,对比CK植株,转基因马铃薯植株无明显区别。转基因马铃薯植株的获得,为将来进一步研究在高淀粉含量植物中表达耐高温α-淀粉酶,对植物本身淀粉储藏的影响奠定基础。
石方方,焦国宝,丁长河,屈建航,屈凌波,刘仲敏[9]（2014）在《耐酸耐高温α-淀粉酶的研究进展》文中指出介绍了耐酸耐高温α-淀粉酶在工业生产中具有经济、节能、方便操作等优势;并且概述了耐酸耐高温α-淀粉酶的菌种来源,其中耐酸性α-淀粉酶的菌种主要来源于芽孢杆菌、曲霉以及嗜热真菌;耐高温α-淀粉酶的菌种主要来源于凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜热网络球杆菌等;本文还对耐酸耐高温α-淀粉酶的菌种选育技术方法包括物理方法、化学方法以及基因操作技术等进行了阐述。研究发现对耐酸耐高温α-淀粉酶的发酵工艺进行优化后,最高可以使酶活提高2.1倍;同时在对该淀粉酶的钙离子依赖性进行研究中,得出某些耐酸耐高温α-淀粉酶具有不依赖Ca2+的特性;最后预测人们将会运用基因工程等技术手段,不断地开发出各种特性的耐酸耐高温性α-淀粉酶。
封棣,孟青青,王玉海,杨慧敏,杨建国,王风寰[10]（2014）在《α-淀粉酶的基因改造与菌种选育研究进展》文中指出α-淀粉酶是重要的工业用酶制剂之一,能在高温、低pH范围内稳定发挥作用的α-淀粉酶则具有更加广阔的应用前景。本文主要从基因改造与菌种选育两方面阐述了高温α-淀粉酶、酸性α-淀粉酶以及高温酸性α-淀粉酶的研究与开发进展。
二、地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达（论文提纲范文）
（1）Pyrococcus furiosus超高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 超高温α-淀粉酶的概述 |
| 1.1.1 超高温α-淀粉酶的来源 |
| 1.1.2 超高温α-淀粉酶的功能与应用 |
| 1.1.3 超高温α-淀粉酶的特性 |
| 1.1.4 超高温α-淀粉酶PFA的研究进展 |
| 1.2 枯草芽孢杆菌表达系统 |
| 1.2.1 枯草芽孢杆菌概述 |
| 1.2.2 信号肽对重组蛋白表达的影响 |
| 1.2.3 伴侣蛋白对重组蛋白表达的影响 |
| 1.3 本课题的研究目的和意义 |
| 1.4 本论文的研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 分子生物学操作方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 pHY300PLK-pfa表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.3 信号筛选流程及信号肽重组表达质粒的构建 |
| 2.2.4 伴侣蛋白PrsA共表达质粒的构建 |
| 2.2.5 伴侣蛋白Pfefoldinγ和PPlase基因编辑质粒的构建 |
| 2.2.6 B.substilis WS9 基因组中分别插入Pfefoldinγ和 PPlase |
| 2.2.7 E.coli感受态细胞的热激转化 |
| 2.2.8 B.subtilis感受态细胞的制备及化学转化 |
| 2.3 发酵方法 |
| 2.3.1 重组B.subtilis摇瓶发酵培养 |
| 2.3.2 重组B.subtilis96 孔板发酵培养 |
| 2.3.3 重组B.subtilis3-L罐发酵培养 |
| 2.4 热处理方法 |
| 2.4.1 完整菌体热处理 |
| 2.4.2 破碎菌成分热处理 |
| 2.5 分析方法 |
| 2.5.1 菌体浓度的测定 |
| 2.5.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.5.3 SDS-PAGE分析 |
| 2.5.4 超高温α-淀粉酶酶活测定 |
| 2.5.5 96孔板超高温α-淀粉酶活力测定 |
| 2.5.6 重组超高温α-淀粉酶的酶学性质分析 |
| 第三章 结果和讨论 |
| 3.1 超高温α-淀粉酶在B.subtilis WS9 中重组表达及重组酶学性质研究 |
| 3.1.1 重组表达质粒pHY300PLK-pfa的构建以及在B.subtilis WS9 中的表达 |
| 3.1.2 重组超高温α-淀粉酶酶学性质 |
| 3.2 信号肽对超高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中重组表达的影响 |
| 3.2.1 信号肽的筛选 |
| 3.2.2 信号肽对超高温α-淀粉酶重组表达的影响 |
| 3.3 伴侣蛋白对超高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中可溶性表达的影响 |
| 3.3.1 枯草芽孢杆菌胞外伴侣蛋白prsA共表达 |
| 3.3.2 prsA共表达重组菌的重组表达 |
| 3.3.3 用CRISPR/Cas9系统分别在 B. subtilis 基因组中插入胞内伴侣蛋白 Pfefoldin γ和PPlase |
| 3.3.4 胞内胞外伴侣蛋白共表达对重组表达的影响 |
| 3.4 热处理对重组菌可溶性表达的影响与重组菌发酵优化 |
| 3.4.1 热处理的温度和时间对重组菌胞外酶活的影响 |
| 3.4.2 热处理的成分对酶活的影响 |
| 3.4.3 热处理重组酶的储存稳定性 |
| 3.4.4 重组菌摇瓶发酵条件优化 |
| 3.4.5 热处理对优化培养基中重组菌产酶的影响 |
| 3.4.6 重组菌3-L罐发酵 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）耐高温α-淀粉酶分子结构与异源表达研究进展（论文提纲范文）
| 1 产耐高温α-淀粉酶的微生物 |
| 2 耐高温α-淀粉酶的结构与功能 |
| 2.1 耐高温α-淀粉酶的结构 |
| 2.2 耐高温α-淀粉酶的结构与热稳定性的关系 |
| 3 耐高温α-淀粉酶的基因工程及外源表达 |
| 4 耐高温α-淀粉酶开发前景展望 |
（3）α-淀粉酶共表达系统的研究及在枯草芽孢杆菌中最优信号肽的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 淀粉的概况 |
| 1.1.1 淀粉来源与种类 |
| 1.1.2 淀粉的分子及结构特点 |
| 1.2 淀粉酶的概况 |
| 1.2.1 淀粉酶的定义及分类 |
| 1.2.2 淀粉酶的结构特点及作用机制 |
| 1.2.3 淀粉及淀粉酶的应用 |
| 1.2.4 淀粉酶的研究进展 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 木聚糖酶与α-淀粉酶融合蛋白基因与不同表达载体的构建与表达 |
| 2.1 融合连接肽Linker的选择 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 常用溶液 |
| 2.2.5 常用培养基 |
| 2.2.6 PCR引物合成与DNA测序 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌重组α-淀粉酶基因Amy-pEasy-E2 与木聚糖酶基因Xyn-pEasy-E2 融合模板的构建 |
| 2.3.2 大肠杆菌表达系统中Linker连接的重组木-淀融合蛋白基因Xyn-Amy-E2、Xyn-L1-Amy-E2、Xyn-L2-Amy-E2、Xyn-L3-Amy-E2 的构建 |
| 2.3.3 重组木-淀融合蛋白基因在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.3.4 融合重组酶Xyn-Amy-E2、Xyn-L1-Amy-E2、Xyn-L2-Amy-E2、Xyn-L3-Amy-E的纯化 |
| 2.3.5 重组酶Xyn-Amy-E2、Xyn-L1-Amy-E2、Xyn-L2-Amy-E2、Xyn-L3-Amy-E2中α-淀粉酶酶学性质的研究 |
| 2.3.6 毕赤酵母菌重组α-淀粉酶基因Amy-pGAP与木聚糖酶基因Xyn-pGAP融合模板的构建 |
| 2.3.7 毕赤酵母菌表达系统中Linker连接的重组木聚糖酶-α-淀粉酶融合蛋白基因Xyn-Amy-pGAP、Xyn-L1-Amy-pGAP、Xyn-L2-Amy-pGAP、Xyn-L3-Amy-pGAP的构建 |
| 2.3.8 重组木-淀融合蛋白基因质粒在毕赤酵母菌中的诱导表达 |
| 2.3.9 重组酶Xyn-Amy-pGAP、Xyn-L1-Amy-pGAP、Xyn-L2-Amy-pGAP、Xyn-L3-Amy-pGAP中 α-淀粉酶酶学性质的研究 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 融合连接肽Linker的选择及序列分析 |
| 2.4.2 大肠杆菌重组α-淀粉酶基因Amy与木聚糖酶基因Xyn融合模板的构建 |
| 2.4.3 大肠杆菌表达系统中Linker连接的重组木-淀融合蛋白基因Xyn-Amy-E2、Xyn-L1-Amy-E2、Xyn-L2-Amy-E2、Xyn-L3-Amy-E2 的构建 |
| 2.4.4 重组木-淀融合蛋白质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.4.5 重组酶Xyn-Amy-E2、Xyn-L1-Amy-E2、Xyn-L2-Amy-E2、Xyn-L3-Amy-E2中α-淀粉酶酶学性质的研究 |
| 2.4.6 毕赤酵母菌重组α-淀粉酶基因Amy与木聚糖酶基因Xyn融合模板的构建 |
| 2.4.7 毕赤酵母菌表达系统中Linker连接的重组木-淀融合蛋白基因Xyn-Amy-pGAP、Xyn-L1-Amy-pGAP、Xyn-L2-Amy-pGAP、Xyn-L3-Amy-pGAP的构建 |
| 2.4.8 重组木-淀融合蛋白基因质粒在毕赤酵母菌中的诱导表达 |
| 2.4.9 重组酶Xyn-Amy-pGAP、Xyn-L1-Amy-pGAP、Xyn-L2-Amy-pGAP、Xyn-L3-Amy-pGAP中 α-淀粉酶酶学性质的研究 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 α-淀粉酶DL-3-4-1 在枯草芽孢杆菌中的高效表达以及最优信号肽的筛选 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 常用溶液 |
| 3.1.5 常用培养基 |
| 3.1.6 DNA测序与引物合成 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 枯草芽孢杆菌pBE-S-DL-3-4-1 信号肽筛选模板质粒的构建 |
| 3.2.2 枯草芽孢杆菌分泌混合信号肽DNA文库pBE-S-SP-DL-3-4-1 质粒的构建 |
| 3.2.3 pBE-S-SP-DL-3-4-1 混合信号肽质粒文库在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达 |
| 3.2.4 最优信号肽引导分泌α-淀粉酶酶学性质的研究 |
| 3.2.5 α-淀粉酶水解产物的分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 枯草芽孢杆菌pBE-S-DL-3-4-1 信号肽筛选模板质粒的构建 |
| 3.3.2 pBE-S-SP-DL-3-4-1 混合信号肽质粒文库在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达 |
| 3.3.3 α-淀粉酶DL-3-4-1 酶学特性的研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.1.1 木-淀融合蛋白基因与不同表达载体的构建与表达 |
| 4.1.2 α-淀粉酶DL-3-4-1 在枯草芽孢杆菌中的高效表达以及最优信号肽的筛选 |
| 4.2 创新 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 实验中所使用的缓冲液的配制 |
| 附录B 本文所涉及到的氨基酸序列 |
| 附录C 本文所涉及到的核苷酸序列 |
| 附录D 氨基酸中英文对照及缩写表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 |
（4）出芽短梗霉中α-淀粉酶基因的克隆表达及生物信息学分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.1.1 出芽短梗霉NG |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 出芽短梗霉总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.3 出芽短梗霉α-淀粉酶基因cDNA序列的获得 |
| 1.4 出芽短梗霉α-淀粉酶基因的生物信息学分析 |
| 1.5 普鲁兰多糖粘度的测定 |
| 1.6 普鲁兰多糖产量的测定[34] |
| 1.7 出芽短梗霉中α-淀粉酶基因表达的分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 出芽短梗霉总RNA的提取 |
| 2.2 出芽短梗霉α-淀粉酶基因全长cDNA的克隆 |
| 2.3 出芽短梗霉中α-淀粉酶基因的生物信息 |
| 2.3.1 系统发育树 |
| 2.3.2 α-淀粉酶蛋白潜在的信号肽切割位点 |
| 2.3.3 α-淀粉酶理化性质 |
| 2.3.4 α-淀粉酶亲疏水性 |
| 2.3.5 α-淀粉酶跨膜螺旋结构 |
| 2.3.6 α-淀粉酶的保守结构域 |
| 2.3.7 α-淀粉酶蛋白的二级结构 |
| 2.3.8 α-淀粉酶结构域的三级结构 |
| 2.4 α-淀粉酶基因的氨基酸序列 |
| 2.5普鲁兰多糖的粘度 |
| 2.6 普鲁兰多糖的产量 |
| 2.7 α-淀粉酶基因的实时定量分析 |
| 3 结论与讨论 |
（5）耐高温α-淀粉酶定点突变及在枯草芽孢杆菌中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 淀粉概述 |
| 1.2 淀粉酶 |
| 1.2.1 淀粉酶简介 |
| 1.2.2 淀粉酶分类 |
| 1.2.3 α-淀粉酶 |
| 1.3 耐高温α-淀粉酶 |
| 1.3.1 耐高温α-淀粉酶具有重要工业价值 |
| 1.3.2 耐高温α-淀粉酶的研究进展 |
| 1.3.3 地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的分子改造 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌表达体系 |
| 1.4.1 枯草芽孢杆菌是主要的工业酶生产菌种 |
| 1.4.2 枯草芽孢杆菌研究进展 |
| 1.4.3 质粒表达系统 |
| 1.4.4 启动子的选择 |
| 1.4.5 信号肽 |
| 1.4.6 表达宿主 |
| 1.5 本课题研究思路 |
| 第二章 突变型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的初步表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与载体 |
| 2.1.2 主要化学品与化学试剂 |
| 2.1.3 工具酶与试剂盒 |
| 2.1.4 主要溶液及培养基 |
| 2.1.5 实验主要涉及仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 突变型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因（amyLM）的获得 |
| 2.2.2 目的片段amyLM的克隆 |
| 2.2.3 pHP13-P43质粒提取 |
| 2.2.4 pHP13-P43酶切线性化 |
| 2.2.5 PCR及质粒酶切产物的纯化 |
| 2.2.6 pHP13-P43-amyLM的构建 |
| 2.2.7 pHP13-P43-amyLM转化大肠杆菌 |
| 2.2.8 pHP13-P43-amyLM菌落PCR验证 |
| 2.2.9 pHP13-P43-amyLM转化枯草芽孢杆菌 |
| 2.2.10 B.subtilis 168(pHP13-P43-amyLM)的初步发酵 |
| 2.2.11 B.subtilis 168(pHP13-P43-amyLM)生长曲线测定 |
| 2.2.12 耐高温α-淀粉酶酶活测定 |
| 2.2.13 B.subtilis 168(pHP13-P43-amyLM)发酵产物鉴定 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 pUC57-amyLM的酶切及测序鉴定 |
| 2.3.2 pHP13-P43-amyLM的构建 |
| 2.3.3 pHP13-P43-amyLM的酶切验证 |
| 2.3.4 pHP13-P43-amyLM菌落PCR验证 |
| 2.3.5 B.subtilis 168(pHP13-P43-amyLM)发酵产物鉴定 |
| 2.3.6 B.subtilis 168(pHP13-P43-amyLM)生长曲线以及酶活测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 P43启动子介导amyLM在枯草芽孢杆菌WB00n中的表达优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种与质粒 |
| 3.1.2 主要化学品与化学试剂 |
| 3.1.3 工具酶与试剂盒 |
| 3.1.4 主要溶液及培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组质粒pHP13-P4318amyLM的构建 |
| 3.2.2 重组质粒pHP13-P439amyLM的构建 |
| 3.2.3 三种重组质粒转化枯草芽孢杆菌WB800n |
| 3.2.4 重组工程菌WB800n的初步发酵 |
| 3.2.5 重组工程菌WB800n发酵产物验证 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 重组质粒pHP13-P4318amyLM的构建验证 |
| 3.3.2 pHP13-P4318amyLM转化WB800n菌落PCR验证 |
| 3.3.3 重组质粒pHP13-P439amyLM的构建验证 |
| 3.3.4 pHP13-P439amyLM转化WB800n菌落PCR验证 |
| 3.3.5 pHP13-P4335amyLM转化WB800n菌落PCR验证 |
| 3.3.6 WB800n(pHP13-P4318amyLM)发酵产物验证 |
| 3.3.7 WB800n(pHP13-P439amyLM)发酵产物验证 |
| 3.3.8 WB800n(pHP13-P4335amyLM)发酵产物验证 |
| 3.3.9 三种重组工程菌WB800n发酵酶活比较 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 麦芽糖诱导表达地衣芽孢杆菌野生型与突变型α-淀粉酶 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与载体 |
| 4.1.2 主要化学品与化学试剂 |
| 4.1.3 主要溶液与培养基配置 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 重组质粒pGJ148-amyL的构建 |
| 4.2.2 重组质粒pGJ148-amyLM的构建 |
| 4.2.3 pGJ148-amyL，pGJ148-amyLM菌落PCR验证 |
| 4.2.4 pGJ148-amyL，pGJ148-amyLM转化WB800n |
| 4.2.5 麦芽糖诱导浓度条件优化 |
| 4.2.6 WB800n(pGJ148-amyLM)，WB800n(pGJ148- amyL)发酵产物验证 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 重组质粒pGJ148-amyL的构建 |
| 4.3.2 重组质粒pGJ148-amyLM的构建 |
| 4.3.3 pGJ148-amyL，pGJ148-amyLM菌落PCR验证 |
| 4.3.4 pGJ148-amyL，pGJ148-amyLM转化WB800n |
| 4.3.5 麦芽糖诱导浓度条件优化 |
| 4.3.6 WB800n(pGJ148-amyLM)，WB800n(pGJ148- amyL)发酵产物验证 |
| 4.3.7 WB800n(pGJ148-amyLM)，WB800n(pGJ148- amyL)酶活测定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（6）芽孢杆菌遗传操作体系初建及工程菌株分子改良（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 工业微生物育种技术 |
| 1.1.1 诱变育种 |
| 1.1.2 遗传育种 |
| 1.1.3 基因工程育种 |
| 1.2 芽孢杆菌表达系统概述 |
| 1.2.1 芽孢杆菌表达系统 |
| 1.2.2 芽孢杆菌表达系统特点 |
| 1.3 芽孢杆菌表达系统的遗传操作体系 |
| 1.3.1 芽孢杆菌表达系统宿主菌株 |
| 1.3.2 芽孢杆菌表达系统载体系统 |
| 1.3.3 芽孢杆菌表达系统转化方法 |
| 1.4 芽孢杆菌表达系统基因表达特点 |
| 1.4.1 启动子 |
| 1.4.2 信号肽和信号肽酶 |
| 1.4.3 终止子 |
| 1.4.4 外源蛋白的分泌表达 |
| 1.4.5 芽孢杆菌蛋白质分泌机制 |
| 1.4.6 影响蛋白分泌的因素 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌遗传操作体系的建立及其应用 |
| 第一节 枯草芽孢杆菌遗传操作体系的建立和完善 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株与载体 |
| 1.1.2 引物的合成与测序 |
| 1.1.3 试剂与仪器 |
| 1.1.4 培养基及溶液的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 DNA片段的纯化或切胶回收 |
| 1.2.3 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 1.2.4 大肠杆菌阳性重组子的鉴定 |
| 1.2.5 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 1.2.6 芽孢杆菌基因组DNA的提取 |
| 1.2.7 芽孢杆菌对抗生素敏感性检测 |
| 1.2.8 枯草芽孢杆菌分泌表达载体的构建 |
| 1.2.9 枯草芽孢杆菌克隆载体的改造 |
| 1.2.10 枯草芽孢杆菌整合载体的构建 |
| 1.2.11 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备与转化 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 芽孢杆菌对抗生素的敏感性检测试验 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌分泌表达载体的构建 |
| 1.3.3 枯草芽孢杆菌克隆载体的改造 |
| 1.3.4 枯草芽孢杆菌整合载体的构建 |
| 1.3.5 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备 |
| 第二节 氨肽酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与载体 |
| 2.1.2 引物的合成与测序 |
| 2.1.3 试剂与仪器 |
| 2.1.4 培养基及溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 B.subtilis基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 氨肽酶基因lap B的克隆与序列分析 |
| 2.2.3 氨肽酶基因表达载体p BSlac-lap B的构建 |
| 2.2.4 氨肽酶活性的测定 |
| 2.2.5 氨肽酶重组表达菌株的摇瓶发酵试验 |
| 2.2.6 表达产物SDS-PAGE蛋白电泳分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 氨肽酶基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 氨肽酶基因重组表达载体的构建 |
| 2.3.3 氨肽酶基因在枯草芽孢杆菌中的重组表达 |
| 2.3.4 重组氨肽酶表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 碱性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与载体 |
| 3.1.2 引物合成与DNA测序 |
| 3.1.3 试剂与仪器 |
| 3.1.4 培养基及溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PCR引物 |
| 3.2.2 芽孢杆菌菌株的分子生物学鉴定 |
| 3.2.3 Bam HI甲基化酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达 |
| 3.2.4 解淀粉芽孢杆菌BF.7658 感受态细胞的制备 |
| 3.2.5 碱性蛋白酶酶活力测定 |
| 3.2.6 碱性蛋白酶基因apr E的克隆及序列分析 |
| 3.2.7 碱性蛋白酶基因表达载体的构建 |
| 3.2.8 解淀粉芽孢杆菌BF.7658 的转化 |
| 3.2.9 碱性蛋白酶重组表达菌株的摇瓶发酵试验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 芽孢杆菌菌株的分子生物学鉴定 |
| 3.3.2 枯草芽孢杆菌B. subtilis WB600的遗传改良 |
| 3.3.3 碱性蛋白酶基因的克隆及序列分析 |
| 3.3.4 碱性蛋白酶基因表达载体的构建 |
| 3.3.5 碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的异源表达 |
| 3.3.6 碱性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的异源表达 |
| 3.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 中性蛋白酶生产菌株的遗传改造 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与载体 |
| 4.1.2 引物合成与DNA测序 |
| 4.1.3 试剂与仪器 |
| 4.1.4 培养基及溶液的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PCR引物 |
| 4.2.2 中性蛋白酶酶活力测定 |
| 4.2.3 产中性蛋白酶菌株的分子鉴定 |
| 4.2.4 中性蛋白酶基因的克隆及序列分析 |
| 4.2.5 B. amyloliquefaciens K11中性蛋白酶基因表达载体的构建 |
| 4.2.6 中性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 |
| 4.2.7 解淀粉芽孢杆菌感受态细胞的制备 |
| 4.2.8 中性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的表达 |
| 4.2.9 中性蛋白酶重组表达菌株的摇瓶发酵试验 |
| 4.2.10 重组质粒遗传稳定性分析 |
| 4.2.11 中性蛋白酶重组表达菌株摇瓶发酵条件优化 |
| 4.2.12 中性蛋白酶重组表达菌株发酵罐测试 |
| 4.2.13 中性蛋白酶部分酶学性质测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 产中性蛋白酶菌株的分子鉴定 |
| 4.3.2 中性蛋白酶基因的克隆 |
| 4.3.3 中性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的异源表达 |
| 4.3.4 中性蛋白酶基因在解淀粉芽孢杆菌中的过表达 |
| 4.3.5 重组质粒遗传稳定性分析 |
| 4.3.6 中性蛋白酶重组表达菌摇瓶发酵条件优化 |
| 4.3.7 中性蛋白酶重组表达菌 110N-6 发酵罐试验 |
| 4.3.8 中性蛋白酶酶学性质分析 |
| 4.4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆及在拟南芥中表达的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 淀粉 |
| 1.2 生物乙醇 |
| 1.2.1 生物乙醇的重要性 |
| 1.2.2 生物乙醇生产的发展 |
| 1.3 淀粉酶 |
| 1.3.1 淀粉酶分类 |
| 1.3.2 耐高温α-淀粉酶 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 本研究技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 质粒与菌种 |
| 2.1.2 试剂及仪器 |
| 2.2 方法与步骤 |
| 2.2.1 菌种活化及淀粉透明圈筛选 |
| 2.2.2 菌株芽孢染色 |
| 2.2.3 菌种16SrDNA相关鉴定 |
| 2.2.4 地衣芽孢杆菌发酵培养及耐高温α-淀粉酶酶活相关检测 |
| 2.2.5 地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶相关研究 |
| 2.2.6 原核表达载体、真核表达载体、植物GFP融合表达载体的构建 |
| 2.2.7 耐高温α-淀粉酶在原核微生物中的表达 |
| 2.2.8 耐高温α-淀粉酶在真核微生物中的表达 |
| 2.2.9 耐高温α-淀粉酶在烟草中瞬时表达 |
| 2.2.10 耐高温α-淀粉酶在拟南芥中的表达 |
| 2.2.11 耐高温α-淀粉酶在马铃薯中的表达 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌株淀粉平板透明圈筛选 |
| 3.2 芽孢染色 |
| 3.3 16SrDNA的PCR扩增 |
| 3.4 菌株16SrDNA鉴定 |
| 3.5 地衣芽孢杆菌发酵产物淀粉液化工艺 |
| 3.6 耐高温α-淀粉酶酶活检测及耐高温稳定性鉴定 |
| 3.7 耐高温α-淀粉酶全长扩增 |
| 3.8 耐高温α-淀粉酶蛋白结构分析 |
| 3.9 原核表达载体pET-22b-α、真核表达载体pPIC9K-α及植物GFP表达载体G1300-α的鉴定 |
| 3.10 原核表达菌株在含淀粉培养基中透明圈鉴定 |
| 3.11 耐高温α-淀粉酶在重组大肠杆菌中的表达 |
| 3.12 真核表达菌株在含淀粉培养基中透明圈鉴定 |
| 3.13 烟草瞬时表达 |
| 3.14 I_2-KI溶液对瞬时表达烟草叶片染色 |
| 3.15 重组载体拟南芥转化 |
| 3.16 拟南芥转化植株的PCR鉴定 |
| 3.17 转基因拟南芥叶片中耐高温α-淀粉酶酶活染色检测 |
| 3.18 HPLC检测转基因拟南芥叶片中淀粉酶酶活 |
| 3.19 转基因拟南芥表型观察 |
| 3.20 马铃薯试管薯的诱导 |
| 3.21 马铃薯试管薯农杆菌侵染转化 |
| 3.22 转基因马铃薯植株PCR鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 耐高温α-淀粉酶在微生物中表达 |
| 4.2 耐高温α-淀粉酶在烟草中瞬时表达 |
| 4.3 耐高温α-淀粉酶转基因拟南芥 |
| 4.4 耐高温α-淀粉酶转基因马铃薯 |
| 4.5 耐高温α-淀粉酶转基因植物的意义 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）耐酸耐高温α-淀粉酶的研究进展（论文提纲范文）
| 1 耐酸耐高温α-淀粉酶的研究目的与意义 |
| 1.1 耐酸性α-淀粉酶 |
| 1.2 耐高温α-淀粉酶 |
| 1.3 耐酸耐高温α-淀粉酶 |
| 2 耐酸耐高温α-淀粉酶的研究现状 |
| 2.1 耐酸耐高温α-淀粉酶菌种来源 |
| 2.2 产耐酸耐高温α-淀粉酶的诱变育种 |
| 2.3 耐酸耐高温α-淀粉酶基因工程育种 |
| 2.4 产耐酸性耐高温α-淀粉酶基因菌株发酵的优化 |
| 2.5 耐酸性耐高温α-淀粉酶对钙离子的依赖性 |
| 3 展望 |
（10）α-淀粉酶的基因改造与菌种选育研究进展（论文提纲范文）
| 1 高温α-淀粉酶的研究进展 |
| 1.1 高温α-淀粉酶的基因改造 |
| 1.2 高温α-淀粉酶菌种选育 |
| 2 酸性α-淀粉酶的研究进展 |
| 2.1 酸性α-淀粉酶的基因改造 |
| 2.2 酸性α-淀粉酶菌种选育 |
| 3 高温酸性α-淀粉酶的研究进展 |
| 3.1 高温酸性α-淀粉酶的基因改造 |
| 3.2 高温酸性α-淀粉酶菌株选育 |
| 4 应用前景与展望 |
四、地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达（论文参考文献）
- [1]Pyrococcus furiosus超高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的表达研究[D]. 檀瑞婷. 江南大学, 2020(01)
- [2]耐高温α-淀粉酶分子结构与异源表达研究进展[J]. 顾燕,汤伟,王悦,戴宝,卢德鹏,许向阳,何增国. 微生物学通报, 2020(05)
- [3]α-淀粉酶共表达系统的研究及在枯草芽孢杆菌中最优信号肽的筛选[D]. 蒋蕊. 云南师范大学, 2019(01)
- [4]出芽短梗霉中α-淀粉酶基因的克隆表达及生物信息学分析[J]. 刘小胖,张宁,李炳学. 贵州农业科学, 2019(01)
- [5]耐高温α-淀粉酶定点突变及在枯草芽孢杆菌中的表达[D]. 李婷璐. 天津大学, 2016(03)
- [6]芽孢杆菌遗传操作体系初建及工程菌株分子改良[D]. 王慧. 中国农业科学院, 2016(01)
- [7]地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究[J]. 李潇,孙海彦,阮孟斌,王霈虹,彭明. 植物学报, 2015(03)
- [8]地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆及在拟南芥中表达的初步研究[D]. 李潇. 海南大学, 2015(07)
- [9]耐酸耐高温α-淀粉酶的研究进展[J]. 石方方,焦国宝,丁长河,屈建航,屈凌波,刘仲敏. 中国食品添加剂, 2014(04)
- [10]α-淀粉酶的基因改造与菌种选育研究进展[J]. 封棣,孟青青,王玉海,杨慧敏,杨建国,王风寰. 食品工业科技, 2014(15)