导读:本文包含了原代角质形成细胞原代论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:角质形成细胞,中波紫外线,细胞增殖,细胞自噬
原代角质形成细胞原代论文文献综述
宋健文,黄惠梅,张英,王博[1]（2018）在《不同剂量中波紫外线对原代角质形成细胞增殖和自噬的影响》一文中研究指出目的初步探讨原代角质形成细胞接受不同剂量中波紫外线(UVB)照射后细胞增殖和自噬的变化情况。方法分离人皮肤角质形成细胞,用0,10,20,40 m J/cm~2剂量UVB照射细胞,照射后12 h,MTT法检测细胞增殖活力,MDC染色检测细胞自噬表达阳性率,Western blot法检测不同剂量UVB照射以及照射后0,2,4,8 h自噬相关蛋白LC3的表达水平。分别使用自噬抑制剂氯喹和促进剂雷帕霉素预处理原代角质形成细胞,通过UVB照射后检测细胞的存活率。结果 UVB照射后,原代角质形成细胞的增殖活力显着降低,10,20,40 m J/cm~2照射组的A490值分别为1.067±0.028,0.968±0.056,0.889±0.018,显着低于对照组(0 m J/cm2)的1.135±0.040(F=51.079,P<0.001)。UVB照射使原代角质形成细胞的自噬表达阳性率显着增加,10,20和40 m J/cm2照射组的细胞自噬表达阳性率分别为(16.81±0.23)%,(30.66±0.59)%和(24.93±0.29)%,显着高于对照组[(9.60±0.55)%,F=2 148.2,P<0.001]。随UVB照射剂量增加,原代角质形成细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达水平逐渐升高,且20 m J/cm~2UVB照射角质形成细胞后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达水平在照射后2 h最高,照射后4-8 h逐渐降低。雷帕霉素预处理有提高UVB照射后角质形成细胞存活率的趋势,而氯喹预处理可显着降低UVB照射后角质形成细胞的存活率,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论 10,20,40 m J/cm2的UVB照射对原代角质形成细胞增殖具有抑制作用,对细胞自噬的发生具有促进作用,氯喹抑制自噬可显着降低UVB照射后角质形成细胞的存活率。(本文来源于《山西医科大学学报》期刊2018年08期）
许翠[2]（2018）在《HPV16 E6/E7通过DNA甲基化修饰导致原代角质形成细胞恶性转变的机制研究》一文中研究指出高危型人乳头瘤病毒(High-risk Humanpapillomavirus,HR-HPVs)的感染(如HPV16)是细胞发生恶性转变的必要条件,E6和E7是其主要的致癌基因。HPV16可通过表观遗传学路径导致肿瘤的发生,其中研究最多的是DNA甲基化。我们设想HPV16E6/E7可以通过DNA甲基化修饰导致细胞的恶性转化。本研究将HPV16 E6/E7通过慢病毒感染的方式转入原代人包皮角质形成细胞(Human Foreskin Keratinocytes,HFKs)构建永生化细胞系并进行鉴定;观察将HPV16E6/E7转入原代细胞及分别沉默肿瘤细胞中HPV16E6或E7后,DNMTs的表达情况,目的基因的甲基化水平及表达情况;最后,将永生化细胞及宫颈癌细胞(SiHa、CaSki)进行全基因组DNA序列、全基因组RNA及DNA甲基化测序,通过数据分析,筛选并发现在细胞永生化及肿瘤细胞形成过程中发挥不同功能的目的基因,为进一步研究基因的功能奠定基础。第一部分永生化角质形成细胞的构建与鉴定目的:将HPV16E6/E7转入原代HFKs,构建永生化细胞,并对永生化HFKs进行鉴定。方法:(1)使用两步消化法及体外无血清培养基培养法分离及培养原代HFKs,观察原代HFKs的生长特性;(2)构建慢病毒质粒LV5-HPV16E6/E7,并经测序验证序列正确后,将质粒包装成高滴度慢病毒;(3)慢病毒感染传代2次的原代HFKs,嘌呤霉素筛选2周,持续培养;(4)通过实时荧光定量核酸扩增(QuantitativePCR,qPCR)及Western Blot检测永生化细胞中HPV16 E6和E7的mRNA及蛋白表达情况,CCK-8检测细胞永生化过程中细胞增殖水平的改变,Transwell实验检测永生化细胞的侵袭能力,裸鼠致瘤实验观察永生化细胞能否导致肿瘤发生。结果:(1)成功分离原代HFKs,并可在体外连续传代。连续传代10次左右原代HFKs出现衰老表现,逐渐死亡。(2)成功构建LV5-HPV16E6/E7重组质粒,并将其包装成滴度为1×109TU/mL的慢病毒。(3)将HPV16E6/E7转入原代HFKs后,可连续传代30次以上,符合永生化细胞的定义。(4)永生化细胞中HPV16 E6和E7的mRNA、蛋白表达水平明显升高;随着传代次数的增加,细胞增殖水平逐渐升高;Transwell实验表明永生化细胞不能通过Matrigel基底膜,不具有侵袭能力;将永生化细胞注射至裸鼠皮下不会形成肿瘤,永生化细胞不具有致瘤能力。结论:LV5-HPV16E6/E7慢病毒感染原代HFKs后,HPV16E6和E7可在细胞中稳定表达,并使得细胞发生永生化。永生化细胞可连续传代30次以上,但不具有肿瘤细胞的侵袭能力及致瘤能力。第二部分HPV16 E6/E7对DNA甲基化的影响目的:观察HPV16E6和E7对DNMTs表达水平及目的基因甲基化、表达水平的影响,证明HPV16 E6和E7可通过甲基化途径影响目的基因的表达。方法:(1)qPCR及Western Blot法检测慢病毒感染前HFKs(Blank)、不同代数 HPV16E6/E7HFKs(A1、A10、A20、A30)及 SiHa(阳性对照)中 4 种 DNMTs的mRNA、蛋白表达水平;(2)亚硫酸氢钠处理后测序技术检测不同组细胞中6种目的基因启动子区的甲基化水平,qPCR及Western Blot法检测不同组细胞中6种目的基因的mRNA、蛋白表达水平;(3)qPCR检测分别沉默HPV16E6或E7后不同时间点(0、24h、48h、72h、96h)4 种 DNMTs 的 mRNA 表达水平;(4)MS-HRM检测分别沉默HPV16 E6或E7后的不同时间点6种目的基因启动子区的甲基化水平,qPCR检测分别沉默HPV16 E6或E7后的不同时间点6种目的基因的mRNA表达水平。结果:(1)将HPV16E6/E7转入HFKs后,4种DNMTs的mRNA及蛋白表达水平均发生不同程度升高;而分别沉默肿瘤细胞中的HPV16 E6或E7后,4种DNMTs的mRNA表达均发生不同程度下降。(2)将HPV16E6/E7转入HFKs后,MT1G、RRAD、TFPI2启动子区甲基化水平明显升高,mRNA及蛋白表达水平下降,SPARC、SFRP1、NMES1启动子区的甲基化水平及mRNA、蛋白表达水平变化不明显;而分别沉默肿瘤细胞中的HPV16E6或E7后,6种目的基因启动子区的甲基化水平均明显下降,mRNA表达水平均显着升高。结论:HPV16E6/E7可通过影响DNMTs的表达,调控目的基因启动子区的甲基化,进而影响其表达,参与细胞的恶性转化。第叁部分永生化及肿瘤细胞的全基因组DNA、RNA及甲基化测序目的:全面观察永生化过程中全基因组DNA序列、全基因组RNA及DNA甲基化变化情况,及永生化细胞与肿瘤细胞在以上方面的差异,筛选并发现在细胞永生化及最终肿瘤细胞形成过程中发挥不同功能的通路及目的基因,为进一步研究基因的功能奠定基础。方法:对Blank,A1、A15、A30,SiHa、CaSki进行全基因组DNA测序、甲基化测序、转录组测序。结果:(1)在细胞永生化过程中,非同义突变较少,DNA变异程度低;HPV16 E6/E7 HFKs与肿瘤细胞间有300多个非同义突变,DNA变异程度高。(2)在细胞发生永生化的过程中,随着传代次数的增加,其与肿瘤细胞之间甲基化差异呈缩小趋势。但传至30代时,永生化细胞与肿瘤细胞之间依旧存在较大差异。(3)筛选出细胞永生化过程中甲基化差异明显的基因及富集通路。(4)筛选出永生化细胞与肿瘤细胞间甲基化差异明显的基因及富集通路。结论:随着传代次数的增加,HPV16E6/E7HFKs与肿瘤细胞之间的甲基化差异呈缩小趋势,传至30代时,两者之间依旧存在较大差异。在细胞永生化过程中,DNA甲基化可能是一个连续且逐步发展的过程。筛选在细胞永生化及恶性转变过程中通过DNA甲基化修饰发挥关键作用的基因及通路。在细胞永生化过程中,未发现有意义的DNA突变,HPV16 E6/E7引起的DNA甲基化可能发挥了关键作用。在细胞癌变的过程中,DNA突变及甲基化可能都发挥了不可或缺的作用。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2018-04-01）
陶丛珊,薛潇春,兰芬,唐炜雅,李超[3]（2017）在《人原代角质形成细胞在两种培养基中增殖能力的比较》一文中研究指出目的:比较第一代和第二代人原代角质形成细胞(human primary keratinocytes,HPK)在两种培养基[(EpiLife培养基+HKGS)和DK-SFM培养基]中增殖能力的差异。方法:通过两步法从人的皮肤组织获得第一代HPK,进行传代后获得第二代HPK,采用细胞计数仪计数,绘制生长曲线。用免疫荧光技术鉴定第二代HPK,并用流式细胞术检测其细胞周期。结果:从HPK生长曲线可见,在DK-SFM培养基中,第一代HPK的增殖速率高于(EpiLife培养基+HKGS)中,第二代HPK的增殖速率低于(EpiLife培养基+HKGS)培养中。细胞周期结果同上,第二代HPK在DK-SFM中其G2期细胞和S期细胞含量分别为8.5%和11.2%,低于在(EpiLife培养基+HKGS)中的13.9%和18.3%。结论:两种培养基培养HPK各有利弊,若想在短期获得纯度较高的HPK,选择DK-SFM培养基较好;若想相对长期培养HPK,选择(EpiLife培养基+HKGS)更有优势。(本文来源于《药学服务与研究》期刊2017年02期）
郝阳阳[4]（2017）在《喜树碱对HaCaT细胞、人原代角质形成细胞自噬及凋亡的影响》一文中研究指出目的观察喜树碱对Ha Ca T细胞、人原代角质形成细胞(KCs)自噬和凋亡的影响,从而探讨喜树碱治疗银屑病的机制。方法(1)将Ha Ca T细胞分为对照组和实验组,对照组为0.1%二甲基亚砜(DMSO),实验组分别为5、10、25、50、100、200 nmol/L浓度的喜树碱。药物处理细胞24、48 h,用CCK8法检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测药物作用24 h的细胞凋亡情况,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62的变化,选取10 nmol/L喜树碱作用于Ha Ca T细胞24 h,间接免疫荧光法观察细胞自噬蛋白LC3的变化,透射电镜观察自噬体超微结构,确认喜树碱对Ha Ca T细胞自噬的诱导效应。(2)取行包皮环切术青少年的包皮组织,分离提取人原代角质形成细胞,取第叁代细胞用于各项实验,实验组喜树碱浓度为200nmol/L、2μmol/L、6μmol/L,对照组为0.1%DMSO,药物处理细胞24h、48h后,采用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测药物作用24 h的细胞凋亡情况,Western blot检测自噬相关蛋白LC3、p62的变化,选取2μmol/L浓度喜树碱作用于细胞24 h,间接免疫荧光法检测细胞自噬蛋白LC3的变化,透射电镜观察自噬体超微结构,进一步确认喜树碱对其自噬的诱导效应,免疫组化观察银屑病皮损部位和正常表皮LC3表达水平。(3)统计学分析:统计分析采用SPSS 17.0软件,计量资料以?x±s表示。各均数经Levene检验方差齐性。细胞的增殖抑制率以及凋亡率统计分析采用单因素方差分析,各组间的多重比较采用Dunnett t检验,间接免疫荧光检测自噬体阳性细胞率采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)5、10、25 nmol/L喜树碱对Ha Ca T细胞的增殖、凋亡无显着影响,50、100、200nmol/L喜树碱作用Ha Ca T细胞24 h的增殖抑制率分别为(31.23±1.00)%,(54.21±8.10)%,(66.75±10.70)%;25、50、100、200nmol/L喜树碱作用Ha Ca T细胞48h的增殖抑制率分别为(25.81±5.99)%、(44.35±5.32)%、(65.81±8.28)%、(73.23±9.59)%,与相同时段的对照组相比,差异有统计学意义(p均<0.001)。50、100、200nmol/L喜树碱作用Ha Ca T细胞24 h的凋亡率分别为(14.46±2.38)%、(19.15±1.59)%、(29.88±1.37)%,与对照组(3.80±0.13)%比较,差异有统计学意义(P均<0.001)。5、10 nmol/L喜树碱处理Ha Ca T细胞24 h后,LC3Ⅱ表达上调,p62蛋白表达下调。间接免疫荧光观察到10nmol/L喜树碱作用细胞24h后的绿色荧光聚集点明显增多,实验组与对照组的自噬体阳性细胞百分率分别为(36.67±4.55)%、6.23±0.92)%,两组差异有统计学意义(t=6.546,p=0.0028)。透射电镜观察到10nmol/L喜树碱作用细胞24h自噬体和自噬溶酶体的形成。(2)2μmol/L、6μmol/L喜树碱作用原代角质形成细胞24 h的增殖抑制率分别为(33.90±3.65)%、(51.72±5.06)%,与对照组(1.60±0.78)%相比差异有统计学意义,200nmol/L喜树碱作用原代角质形成细胞24 h的增殖抑制率为(7.59±1.82)%,与对照组比较差异无统计学意义。200nmol/L、2μmol/L、6μmol/L喜树碱作用原代角质形成细胞48 h的增殖抑制率分别为(19.21±5.74)%、(52.09±3.01)%、(63.37±5.45)%,与对照组(4.18±1.56)%相比,差异有统计学意义。200nmol/L、2μmol/L、6μmol/L喜树碱作用原代角质形成细胞24 h的凋亡率分别为(15.90±2.14)%、(29.33±3.51)%、(35.28±3.05)%,与对照组(2.30±1.68)%比较,差异有统计意义。2μmol/L、6μmol/L喜树碱处理原代角质形成细胞24 h后,LC3Ⅱ显着上调,p62蛋白表达下调。间接免疫荧光观察到2μmol/L喜树碱作用原代角质形成细胞24h后的绿色荧光聚集点,实验组与对照组的自噬体阳性细胞百分率分别为(60.16±8.78)%、(38.96±13.12)%,统计方法采用独立样本t检验,差异具有统计学意义(t=3.003,p=0.017)。透射电镜观察到2μmol/L喜树碱作用原代角质形成细胞24h自噬体和自噬溶酶体的形成;皮肤组织LC3免疫组化观察到银屑病皮损部位表皮LC3表达量较正常皮肤明显降低。结论低浓度喜树碱(5、10、25 nmol/L)可诱导Ha Ca T细胞产生自噬,对细胞增殖、凋亡无显着影响,高浓度喜树碱(50、100、200 nmol/L)抑制Ha Ca T细胞增殖,促使细胞发生凋亡,自噬水平降低。2μmol/L、6μmol/L喜树碱可诱导原代角质形成细胞自噬水平升高,同时诱导细胞凋亡。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2017-02-28）
金锐[5]（2016）在《甲羟戊酸代谢途径紊乱对原代角质形成细胞增殖、分化及凋亡的影响》一文中研究指出目的探讨甲羟戊酸代谢途径紊乱对原代角质形成细胞(KCs)增殖、分化及凋亡的影响,以及参与调控的可能的分子机制,为更清楚的了解播散型浅表性光化性汗孔角化症(DSAP)的病理及分子机制提供依据。方法(1)培养人原代皮肤角质形成细胞(KCs),利用催化甲羟戊酸途径顺利进行的关键酶的特异性抑制剂(羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂(Pravastatin(PRA),法尼基合成酶抑制剂(Alendonate(ALD),法尼基转移酶抑制剂(FTI-277)和香叶基转移酶抑制(GGTI-298)单独或联合甲羟戊酸途径代谢产物(甲羟戊酸(MVA),法尼焦磷酸(FPP),香叶基香叶焦磷酸(GGPP),胆固醇(CH))来处理角质形成细胞2d后,MTS及流式细胞术分析其对细胞活力及细胞周期的影响。提取细胞总蛋白,Western-blot检测细胞周期相关蛋白cyclinB1, cyclinE,p21的表达量,同时分析对丝裂原激活的蛋白激酶-胞外信号调节激酶(MAPKs-ERK1/2)信号通路以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B信号通路的影响。(2)按照上述方式处理KC细胞2 d,加入Ca2+(1.2mM)刺激细胞1d后,提取细胞总蛋白,采用Western-blot法检测其对Ca2+诱导的原代角质形成细胞(KC)化maker (Involucrin, Keratin 1)的表达影响并分析对p53,Notch1及丝裂原激活的蛋白激酶-胞外信号调节激酶(MAPKs-ERK1/2)信号通路以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B信号通路的影响。(3)同样按照上述方式处理KC细胞,流式细胞术分析对细胞凋亡的影响。结果(1)增殖结果：MTS结果显示,PRA和ALD强烈抑制KC细胞增殖,FTI和GGTI也抑制细胞增殖,但程度相对较弱。只有CH能够部分补救PRA和ALD对细胞造成的增殖抑制效应。此外,MVA,FPP，GGPP产生部分增殖抑制效应。流式-周期结果显示,PRA和ALD将KC细胞阻滞在G1期,同时CH能够补救PRA及ALD产生的G1期阻滞效应。FPP,GGPP本身也有一定的G1阻滞作用。此外,FTI,GGTI对细胞周期无明显影响。Western-blot结果表明,PRA,ALD,FTI,GGTI单独或联合作用均很大程度地下调cyclinB1而上调cyclinE,p21的表达。同时也能促进PI3K-AKT信号通路,抑制MAPKs-ERK1/2信号通路的激活状态。(2)分化结果：Western-blot结果表明PRA,ALD,FTI,GGTI单独或联合使用均抑制Ca2+诱导的Involucrin的表达；所有的抑制剂单独或联合处理KC细胞均能下调p53,Notchl的表达；信号通路研究表明,Ca2+激活AKT,抑制ERK1/2的活化状态,ALD单独及四种抑制剂联合处理KC细胞能上调AKT的磷酸化水平,而PRA,FTI,GGTI均下调AKT,上调ERK1/2的磷酸化水平。(3)流式-凋亡结果显示,甲羟戊酸代谢途径紊乱对KC细胞凋亡不产生明显的影响。结论甲羟戊酸代谢途径紊乱能够抑制原代角质形成细胞(KCs)的增殖、分化,但不影响凋亡。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2016-03-01）
张璟璐,严励,任萌,杨川,罗恒聪[6]（2013）在《AGE-BSA干预人原代角质形成细胞后的表观遗传现象》一文中研究指出目的:早期血糖控制不佳的患者,即便经过治疗使血糖控制在理想水平,糖尿病慢性并发症仍会持续,这种现象被称为高血糖导致的"印记作用"或"代谢记忆效应",但其机制尚未明确。有研究提示"代谢记忆效应"可能归因于靶细胞的表观遗传修饰。临床发现糖尿病皮肤难愈溃(本文来源于《中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编》期刊2013-08-21）
卢泽艳,郑良凤,李瑶,邵义祥[7]（2013）在《B6-Co与B6小鼠眼睑角质形成细胞的原代无血清培养及比较研究》一文中研究指出为进一步研究B6-Co小鼠眼睑发育缺陷机制,首次培养了小鼠眼睑角质形成细胞,并对B6-Co和B6小鼠眼睑角质形成细胞的迁移能力进行划痕实验分析,FITC-phalloidin染色比较B6-Co和B6小鼠肌动蛋白细胞骨架。结果表明,B6-Co小鼠眼睑角质形成细胞迁移的数目和距离明显少于B6小鼠,细胞骨架异常,B6-Co小鼠眼睑闭合不全(EOB)是由小鼠眼睑角质形成细胞迁移缺陷造成的。(本文来源于《湖北农业科学》期刊2013年02期）
林向飞,闵玮,朱晓芳,骆丹[8]（2012）在《EGCG对中波紫外线辐射后原代人角质形成细胞中光产物产生和清除的影响》一文中研究指出目的:观察中波紫外线(UVB)辐射后人原代角质形成细胞中环丁烷嘧啶二聚体(cycl obut ane pyrimidine dimmer s,CPDs)的生成和清除情况,以及没食子儿茶素没食子酸酯(epigall ocatechingall ate,EGCG)干预对上述过程的影响。方法:以不同剂量UVB照射原代角质形成细胞后并加入EGCG干预处理,采用免疫组织化学法检测UVB照射后不同时段细胞中CPDs的产生和清除情况。结果:UVB照射后细胞中CPDs开始产生,1h左右达到高峰;CPDs在照光后4h内清除速率较快,4h后清除速率逐渐降低,至24hCPDs被基本清除。照光前后加入EGCG干预减少UVB引起的35.7%～42.9%CPDs产生(P<0.05)。结论:UVB可明显引起原代人角质形成细胞损伤,受损程度随辐射剂量增大而加重;EGCG可以减少UVB辐射所致的光产物的产生,加速光产物的清除。(本文来源于《中国美容医学》期刊2012年15期）
汤怡,周强,程浩[9]（2012）在《人尖锐湿疣组织来源的原代角质形成细胞培养》一文中研究指出目的HPV感染的体外细胞模型至今未能建立,限制了HPV感染的研究方法与手段。为建立有效的HPV感染体外细胞模型提供实验基础,本研究探索人尖锐湿疣组织来源的原代角质形成细胞的培养方法。方法尖锐湿疣组织经含两性霉素B及双抗的PBS震荡清洗后,用0.25%胰酶-EDTA消化15min,人角质形成细胞无血清培养基(GBICO的Defined Keratinocyte-SFM培养基)+20%胎牛血清(GIBCO)培养。培养7-10天后收集部分细胞,取人乳头瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒对角质形成细胞进行HPV型别鉴定。(本文来源于《2012年浙江省皮肤病性病学术会议论文集》期刊2012-09-07）
张丽,吴文娟,起珏,涂颖,顾华[10]（2012）在《UVA联合UVB照射对人表皮原代角质形成细胞增殖影响的研究》一文中研究指出目的探讨95%UVA联合5%UVB共同照射对人表皮原代角质形成细胞(HEK)增殖的影响,为构建日光对人工皮肤光损伤模型提供实验依据。方法用总剂量分别为0、2.5、5、10、20、30、40、60J/cm2的紫外线(含95%UVA和5%UVB),即UVA的剂量分别为0、2.375、4.75、9.5、19、28.5、38、57 J/cm2,UVB的剂量分别为0、0.125、0.25、0.5、1、1.5、2、3 J/cm2,分别照射体外培养的HEK,照射后继续培养24h后用四甲基偶氮(本文来源于《中华医学会第十八次全国皮肤性病学术年会论文汇编》期刊2012-06-12）
原代角质形成细胞原代论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
高危型人乳头瘤病毒(High-risk Humanpapillomavirus,HR-HPVs)的感染(如HPV16)是细胞发生恶性转变的必要条件,E6和E7是其主要的致癌基因。HPV16可通过表观遗传学路径导致肿瘤的发生,其中研究最多的是DNA甲基化。我们设想HPV16E6/E7可以通过DNA甲基化修饰导致细胞的恶性转化。本研究将HPV16 E6/E7通过慢病毒感染的方式转入原代人包皮角质形成细胞(Human Foreskin Keratinocytes,HFKs)构建永生化细胞系并进行鉴定;观察将HPV16E6/E7转入原代细胞及分别沉默肿瘤细胞中HPV16E6或E7后,DNMTs的表达情况,目的基因的甲基化水平及表达情况;最后,将永生化细胞及宫颈癌细胞(SiHa、CaSki)进行全基因组DNA序列、全基因组RNA及DNA甲基化测序,通过数据分析,筛选并发现在细胞永生化及肿瘤细胞形成过程中发挥不同功能的目的基因,为进一步研究基因的功能奠定基础。第一部分永生化角质形成细胞的构建与鉴定目的:将HPV16E6/E7转入原代HFKs,构建永生化细胞,并对永生化HFKs进行鉴定。方法:(1)使用两步消化法及体外无血清培养基培养法分离及培养原代HFKs,观察原代HFKs的生长特性;(2)构建慢病毒质粒LV5-HPV16E6/E7,并经测序验证序列正确后,将质粒包装成高滴度慢病毒;(3)慢病毒感染传代2次的原代HFKs,嘌呤霉素筛选2周,持续培养;(4)通过实时荧光定量核酸扩增(QuantitativePCR,qPCR)及Western Blot检测永生化细胞中HPV16 E6和E7的mRNA及蛋白表达情况,CCK-8检测细胞永生化过程中细胞增殖水平的改变,Transwell实验检测永生化细胞的侵袭能力,裸鼠致瘤实验观察永生化细胞能否导致肿瘤发生。结果:(1)成功分离原代HFKs,并可在体外连续传代。连续传代10次左右原代HFKs出现衰老表现,逐渐死亡。(2)成功构建LV5-HPV16E6/E7重组质粒,并将其包装成滴度为1×109TU/mL的慢病毒。(3)将HPV16E6/E7转入原代HFKs后,可连续传代30次以上,符合永生化细胞的定义。(4)永生化细胞中HPV16 E6和E7的mRNA、蛋白表达水平明显升高;随着传代次数的增加,细胞增殖水平逐渐升高;Transwell实验表明永生化细胞不能通过Matrigel基底膜,不具有侵袭能力;将永生化细胞注射至裸鼠皮下不会形成肿瘤,永生化细胞不具有致瘤能力。结论:LV5-HPV16E6/E7慢病毒感染原代HFKs后,HPV16E6和E7可在细胞中稳定表达,并使得细胞发生永生化。永生化细胞可连续传代30次以上,但不具有肿瘤细胞的侵袭能力及致瘤能力。第二部分HPV16 E6/E7对DNA甲基化的影响目的:观察HPV16E6和E7对DNMTs表达水平及目的基因甲基化、表达水平的影响,证明HPV16 E6和E7可通过甲基化途径影响目的基因的表达。方法:(1)qPCR及Western Blot法检测慢病毒感染前HFKs(Blank)、不同代数 HPV16E6/E7HFKs(A1、A10、A20、A30)及 SiHa(阳性对照)中 4 种 DNMTs的mRNA、蛋白表达水平;(2)亚硫酸氢钠处理后测序技术检测不同组细胞中6种目的基因启动子区的甲基化水平,qPCR及Western Blot法检测不同组细胞中6种目的基因的mRNA、蛋白表达水平;(3)qPCR检测分别沉默HPV16E6或E7后不同时间点(0、24h、48h、72h、96h)4 种 DNMTs 的 mRNA 表达水平;(4)MS-HRM检测分别沉默HPV16 E6或E7后的不同时间点6种目的基因启动子区的甲基化水平,qPCR检测分别沉默HPV16 E6或E7后的不同时间点6种目的基因的mRNA表达水平。结果:(1)将HPV16E6/E7转入HFKs后,4种DNMTs的mRNA及蛋白表达水平均发生不同程度升高;而分别沉默肿瘤细胞中的HPV16 E6或E7后,4种DNMTs的mRNA表达均发生不同程度下降。(2)将HPV16E6/E7转入HFKs后,MT1G、RRAD、TFPI2启动子区甲基化水平明显升高,mRNA及蛋白表达水平下降,SPARC、SFRP1、NMES1启动子区的甲基化水平及mRNA、蛋白表达水平变化不明显;而分别沉默肿瘤细胞中的HPV16E6或E7后,6种目的基因启动子区的甲基化水平均明显下降,mRNA表达水平均显着升高。结论:HPV16E6/E7可通过影响DNMTs的表达,调控目的基因启动子区的甲基化,进而影响其表达,参与细胞的恶性转化。第叁部分永生化及肿瘤细胞的全基因组DNA、RNA及甲基化测序目的:全面观察永生化过程中全基因组DNA序列、全基因组RNA及DNA甲基化变化情况,及永生化细胞与肿瘤细胞在以上方面的差异,筛选并发现在细胞永生化及最终肿瘤细胞形成过程中发挥不同功能的通路及目的基因,为进一步研究基因的功能奠定基础。方法:对Blank,A1、A15、A30,SiHa、CaSki进行全基因组DNA测序、甲基化测序、转录组测序。结果:(1)在细胞永生化过程中,非同义突变较少,DNA变异程度低;HPV16 E6/E7 HFKs与肿瘤细胞间有300多个非同义突变,DNA变异程度高。(2)在细胞发生永生化的过程中,随着传代次数的增加,其与肿瘤细胞之间甲基化差异呈缩小趋势。但传至30代时,永生化细胞与肿瘤细胞之间依旧存在较大差异。(3)筛选出细胞永生化过程中甲基化差异明显的基因及富集通路。(4)筛选出永生化细胞与肿瘤细胞间甲基化差异明显的基因及富集通路。结论:随着传代次数的增加,HPV16E6/E7HFKs与肿瘤细胞之间的甲基化差异呈缩小趋势,传至30代时,两者之间依旧存在较大差异。在细胞永生化过程中,DNA甲基化可能是一个连续且逐步发展的过程。筛选在细胞永生化及恶性转变过程中通过DNA甲基化修饰发挥关键作用的基因及通路。在细胞永生化过程中,未发现有意义的DNA突变,HPV16 E6/E7引起的DNA甲基化可能发挥了关键作用。在细胞癌变的过程中,DNA突变及甲基化可能都发挥了不可或缺的作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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