一、Ⅱ型肺上皮细胞钠通道的研究进展（论文文献综述）
李君[1]（2021）在《肺泡上皮细胞多糖包被及紧密连接在ARDS中变化及机制》文中指出研究背景急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratory distress syndrome,ARDS）是由各种肺内因素和（或）肺外因素引起的急性弥漫性肺损伤,肺血管内皮及肺泡上皮细胞受损,肺血管通透性及肺泡通透性增加,进而导致肺水肿形成,是ARDS基本病理特点。ARDS是临床常见的急危重症,病死率高达46%,目前治疗以机械通气为主,尚缺乏有效药物治疗。大量水肿液从气道溢出和胸部影像学表现为“白肺”的特征是重度ARDS患者严重肺水肿的典型临床表现。ARDS根据始发因素不同通常分为:肺内源性ARDS与肺外源性ARDS。肺外源性ARDS的诱发因素主要包括腹腔、皮肤软组织等非肺源性的重症感染、急性胰腺炎、重大胸部创伤、车祸等,其首先受损的细胞是肺血管内皮细胞;而在肺内源性ARDS（如SARS、H1N1流感、COVID-19感染,误吸,溺水,肺挫伤等）中,肺泡上皮细胞成为首要受损的靶细胞,上皮屏障的破坏成为ARDS发生发展的关键因素。研究表明单纯损伤内皮细胞不足以充分诱发肺水肿,近年来肺泡上皮细胞的破坏在ARDS肺水肿形成中的作用越来越受到重视。尤其在肺内因素所致ARDS中,肺泡上皮屏障的结构和功能的损伤是ARDS发生的关键因素。因此研究肺泡上皮屏障损伤及机制,将可能成为未来ARDS治疗的突破口。肺泡上皮屏障主要由Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞、细胞间连接、细胞表面的活性物质及肺泡上皮细胞多糖包被等构成。肺泡上皮细胞多糖包被是覆盖在肺泡上皮细胞表面一层带负电荷的多糖-蛋白质复合物,主要由核心蛋白和侧链构成,其侧链结构主要包括硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）、透明质酸及硫酸软骨素等,其中HS含量最多,占侧链结构的50%以上,对多糖包被的完整性和功能起着至关重要的作用,是肺泡上皮屏障的重要组成部分。乙酰肝素酶（heparanase,HPA）是哺乳动物体内唯一一种特定将多糖包被侧链HS裂解为小片段而调控HS的葡萄糖醛酸酶内切酶。肝素酶Ⅲ（heparinase Ⅲ）,一种HS特异性的细菌葡萄糖醛酸酶内切酶,亦可以降解多糖包被侧链HS。非抗凝的肝素（N-desulfated/re-N-acetylated heparin,NAH）是HPA的竞争性拮抗剂。当前,国内外大多数研究集中于内皮细胞多糖包被,而肺泡上皮细胞多糖包被一直被忽略。近年来在肺内源性ARDS动物模型中发现肺泡上皮细胞多糖包被在维持肺实质结构、促进细胞信号转导等方面发挥重要作用,是防止宿主感染的重要屏障。肺泡上皮多糖包被和上皮细胞紧密连接（tightjunction）是肺泡屏障的重要组成部分,其破坏所致肺泡通透性的增加是ARDS肺水肿形成的重要因素。推测肺泡上皮细胞多糖包被和紧密连接的损伤是ARDS尤其是肺内源性ARDS发生发展的重要靶位。因此,研究ARDS发生发展中肺泡上皮细胞多糖包被及紧密连接的损伤及机制,可能为临床药物治疗ARDS提供新的靶点。本研究以肺泡上皮细胞多糖包被及紧密连接为研究切入点,拟包括以下四部分内容。第一部分LPS对肺泡上皮细胞多糖包被侧链-HS的影响目的:肺泡屏障破坏所致通透性增加是ARDS肺水肿形成的重要因素,近年来发现上皮细胞多糖包被是肺泡屏障的重要组成部分,其损伤可能参与ARDS肺水肿的形成。本研究旨在观察脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）致ARDS中肺泡上皮多糖包被侧链HS的变化。方法:①体内实验以C57BL/6小鼠为研究对象,应用气管内滴注LPS建立小鼠ARDS模型,小鼠随机分为正常对照组、LPS组。②体外实验利用人肺泡上皮细胞（A549）为研究对象,分为正常对照组和LPS组。通过观察肺组织病理学改变评估肺损伤程度,测量肺组织湿/干比（W/D）来评估肺泡通透性的变化。通过免疫荧光技术分析小鼠肺泡上皮细胞及A549细胞多糖包被HS的变化,评估ARDS发生中肺泡上皮细胞HS的损伤及程度。结果:LPS组小鼠与正常对照组相比,肺组织病理显示炎症细胞浸润增多、肺泡间隔增厚,同时W/D增高,肺泡腔渗出增多,肺水肿形成。免疫荧光结果显示LPS组小鼠肺泡上皮细胞及A549细胞HS表达较正常对照组降低（P<0.05）。结论:LPS致ARDS肺泡上皮细胞多糖包被侧链HS表达减少。第二部分LPS致ARDS中HPA对肺泡上皮细胞多糖包被的结构及功能的影响目的:HPA是HS特异性调控酶,非抗凝的肝素（N-desulfated/re-N-acetylated heparin,NAH）是HPA的竞争性拮抗剂。本研究的主要目的是探明LPS致ARDS中肺泡上皮细胞HS表达减少的机制。方法:以C57BL/6小鼠及人肺泡上皮细胞（A549）为研究对象,应用气管内滴注LPS建立小鼠ARDS模型及LPS刺激A549细胞构建细胞损伤模型。将体内外实验分为正常对照组、LPS组、肝素酶Ⅲ（外源性添加HPA）组、LPS+NAH（HPA的竞争性拮抗剂）组、灭活的肝素酶Ⅲ组及NAH组。通过观察肺组织病理学改变评估肺损伤程度,测量肺组织湿/干比（W/D）来评估肺泡通透性的变化。利用 ELISA 检测肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF）、血液、BALF/血液及细胞上清液中HS含量评估肺泡上皮细胞多糖包被的降解程度。通过免疫荧光分析上皮细胞残留的多糖包被HS的变化。通过透射电镜观察小鼠肺泡上皮细胞多糖包被超微结构的变化。结果:LPS组及肝素酶Ⅲ组小鼠肺组织炎症细胞浸润增多、肺泡渗出增多、肺泡间隔增厚,同时W/D增高,肺泡通透性增加,NAH预处理组病理学改变有所减轻,W/D降低。ELISA结果显示LPS组细胞上清液中HPA产生显着增加。同时LPS及肝素酶Ⅲ组细胞上清液、BALF、BALF/血清中脱落的HS含量较正常对照组升高,NAH预处理组HS则较LPS组明显减少（P<0.05）。免疫荧光结果显示LPS组及肝素酶Ⅲ组小鼠肺泡上皮细胞及A549细胞残留的HS较正常对照组低,NAH预处理组较LPS组有所改善（P<0.05）。透射电镜显示正常对照组小鼠肺泡上皮细胞多糖包被是连续的,而LPS刺激后多糖包被部分或完全脱落,NAH预处理组肺泡上皮细胞多糖包被脱落有所减轻。结论:LPS致ARDS模型中肺泡上皮细胞多糖包被侧链HS的降解与特异性调控酶HPA增加有关,NAH通过抑制HPA对HS的降解,减少LPS对HS的破坏,保护肺泡上皮细胞多糖包被的完整性,改善肺水肿。第三部分LPS致ARDS中肺泡上皮细胞紧密连接的变化目的:肺泡上皮细胞多糖包被和紧密连接是肺泡屏障重要组成部分,上皮多糖包被与紧密连接破坏是ARDS肺水肿形成的重要病理生理机制。本研究第一与第二部分的研究结果表明LPS可导致ARDS肺泡上皮细胞多糖包被HS的破坏,与肺水肿形成有关。然而,上皮细胞紧密连接的破坏也与肺水肿形成有密切关系。本研究旨在观察LPS致ARDS中肺泡上皮细胞紧密连接的变化,进一步探讨LPS致肺损伤的机理。方法:以C57BL/6小鼠及人肺上皮细胞（A549）为研究对象,应用气管内滴注LPS建立小鼠ARDS模型及LPS刺激A549细胞构建细胞损伤模型。将体内外实验分为正常对照组、LPS组、肝素酶Ⅲ组、LPS+NAH组、灭活的肝素酶Ⅲ组及NAH组。通过免疫荧光和western blot分析上皮细胞紧密连接蛋白（occludin、ZO-1和claudin4）的变化。通过透射电镜观察小鼠肺泡上皮细胞紧密连接超微结构的变化。结果:小鼠组织免疫荧光显示LPS组及肝素酶Ⅲ组紧密连接蛋白（occludin、ZO-1、claudin4）表达水平较正常对照组均降低。同时LPS及肝素酶Ⅲ刺激A549细胞后,细胞免疫荧光及western blot显示occludin、ZO-1、claudin 4表达水平也较正常对照组降低。NAH预处理后上述紧密连接蛋白破坏减少,灭活的肝素酶Ⅲ组及NAH组较正常对照组无明显差异。透射电镜显示正常对照组小鼠肺泡上皮细胞紧密连接是完整的,而LPS刺激后细胞间裂隙增宽、紧密连接蛋白结构破坏,而NAH预处理组肺泡上皮细胞紧密连接的破坏有改善。结论:①LPS可引起肺泡上皮细胞紧密连接蛋白（occludin、ZO-1和claudin 4）的破坏。②肝素酶Ⅲ破坏肺泡上皮细胞多糖包被HS后,紧密连接蛋白（occludin、ZO-1和claudin 4）亦破坏,而HPA的竞争性拮抗剂NAH保护多糖包被HS后上皮细胞紧密连接蛋白（occludin、ZO-1和claudin4）损伤也得以改善。推测HPA-HS与紧密连接可能存在潜在关系。第四部分探讨HPA-HS与紧密连接损伤的相关性目的:前期研究发现外源性添加HPA可破坏肺泡上皮细胞多糖包被HS,引起上皮细胞紧密连接蛋白（occludin、ZO-1和claudin4）的破坏增加,导致肺泡通透性增加,而HPA的竞争性拮抗剂NAH可在减轻肺泡上皮细胞多糖包被HS的降解同时减轻上皮细胞间紧密连接蛋白的损伤,改善肺泡屏障。HPA是HS特异性调控酶。HPA不直接作用于紧密连接,HPA降解多糖包被侧链HS后紧密连接破坏增加,说明紧密连接与多糖包被侧链HS具有潜在的相关性。本研究旨在进一步探讨HPA-HS致紧密连接破坏的潜在机制。方法:①为探讨HPA-HS与ZO-1破坏的关系,利用内源性重组HPA（2 U/ml）刺激人肺泡上皮细胞（A549）12h建立细胞损伤模型,将细胞分为正常对照组、重组HPA组。采用细胞免疫荧光技术观察细胞HS表达的变化,分析多糖包被侧链HS的变化。运用细胞免疫荧光及western blot观察紧密连接蛋白ZO-1的表达。应用实时定量PCR技术研究紧密连接蛋白（ZO-1 mRNA）表达。②为探讨HPA-HS与ZO-1破坏是否与STAT3信号通路有关,将A549细胞分为正常对照组,重组HPA组,重组HPA+STAT3-IN-1（STAT3抑制剂）组以及STAT3-IN-1组,利用western blot检测各组p-STAT3的表达变化。结果:①细胞免疫荧光分析显示,重组HPA可使细胞多糖包被HS的表达降低（P<0.05）。同时细胞免疫荧光及western blot结果显示,与正常对照组相比,重组HPA组ZO-1的表达减少（P<0.05）。此外,重组HPA刺激A549细胞后ZO-1 mRNA也显着降低（P<0.001）。②Western blot结果显示正常对照组,HPA组,HPA+STAT3-IN-1组以及STAT3-IN-1组p-STAT3的表达差异无统计学意义。结论:①重组HPA在降解肺泡上皮细胞多糖包被HS的同时,破坏上皮细胞紧密连接ZO-1,HPA-HS干预ZO-1 mRNA的合成,进而减少ZO-1蛋白的表达。②STAT3信号通路不参与重组HPA-HS对上皮细胞紧密连接蛋白的影响。总之:上述结果表明LPS致ARDS肺上皮细胞HPA增加,破坏多糖包被HS使多糖包被的结构和功能受损而参与ARDS肺水肿的形成;LPS致ARDS肺泡上皮细胞紧密连接结构和功能蛋白也受损伤,与多糖包被损伤共同参与ARDS的肺水肿形成,为ARDS药物治疗及开发应用提供新的途径。LPS-HPA-HS与紧密连接损伤的关系尚待进一步研究。
陈家磊[2]（2021）在《上皮细胞钠通道A663T多态性与突发性耳聋的相关性分析》文中进行了进一步梳理目的:探讨上皮细胞钠通道（ENaC）A663T多态性与突发性耳聋的潜在联系。方法:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析了112例突发性耳聋患者（低频型20例,高频型19例,平坦型31例,全聋型42例）和115名正常对照者上皮细胞钠通道A663T多态性基因型频率和等位基因频率的分布。结果:携带T等位基因是低频型突发性聋发生的危险因素（P=0.046,OR=2.16,95%CI=1.01-4.62）。携带TT基因型和T等位基因是全聋型突发性聋发生的保护因素（AA vs.TT:P=0.012,OR=0.25,95%CI=0.08-0.74;A vs.T:P=0.001,OR=0.36,95%CI=0.21-0.61）。但另外两组（高频型突发性耳聋和平坦型突发性耳聋）的基因型频率和等位基因频率与对照组相比无显着性差异。结论:上皮细胞钠通道A663T多态性在不同类型的突发性耳聋中起着不同的作用。
张颖[3]（2021）在《LncRNA AL137782.1在肺上皮细胞中的功能分析及对肺上皮细胞迁移的调控作用研究》文中提出背景:长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）是一类长度大于200 nt的RNA分子。大量研究表明,LncRNA可以在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控各类基因的表达,从而参与多种生物学过程。肺上皮细胞是肺部屏障构成和肺内气体交换的主要细胞,其功能的正常运转对肺部微环境的稳态具有至关重要的作用。近年来,随着基因芯片及第二代高通量测序技术的广泛应用,新的LncRNA不断被发现。许多新的LncRNA在肺部相关疾病中的调控成为目前研究的热点之一,本课题组前期发现肺上皮细胞损伤中存在差异表达的LncRNAAL137782.1,且细胞迁移相关基因LIM域7（LIM domain only7,LMO7）的表达与其高度相关,但LncRNA AL137782.1在肺上皮细胞中的功能及调控细胞迁移的机制尚未见明确报道。目的:本课题通过探究LncRNA AL137782.1在肺上皮细胞中的表达、定位及功能,初步探讨其通过调控LMO7的表达影响肺上皮细胞迁移的机制,以期为LncRNA对肺上皮细胞功能调控的研究提供新的参考。方法:本研究以人肺上皮细胞（A549和BEAS-2B细胞系）为研究对象,利用RT-qPCR、RACE和FISH等技术研究LncRNAAL137782.1在肺上皮细胞中的表达和亚细胞定位等生物学特性;利用全转录组测序和基因共表达网络,分析LncRNA AL137782.1在肺上皮细胞中的功能及细胞迁移相关基因;利用腺病毒载体或siRNA分别对LncRNA AL137782.1和细胞迁移相关基因进行过表达或敲减,通过RT-qPCR和Western blot等检测细胞迁移相关基因的表达,通过细胞划痕实验检测肺上皮细胞的迁移,从而探究LncRNA AL137782.1影响肺上皮细胞迁移的分子机制。结果:（1）生物信息学软件预测结果显示LncRNA AL137782.1不具有编码蛋白质的潜力;cDNA末端快速扩增结果显示LncRNA AL137782.1的5’末端长度为273 nt。（2）LncRNA AL137782.1在肺上皮细胞的细胞核和细胞质中均有分布,且过表达LncRNA AL137782.1后,肺上皮细胞的细胞核和细胞质中LncRNA AL137782.1的表达均上调。（3）LncRNA AL137782.1对肺上皮细胞的增殖能力和细胞活力无显着影响,但转录组学数据显示过表达LncRNA AL137782.1后,肺上皮细胞的黏附连接、细胞迁移和免疫反应等生物学过程的关键分子发生显着上调或下调。（4）肺上皮细胞中过表达LncRNA AL137782.1后LMO7的mRNA和蛋白表达均显着上调;相反,敲减LncRNA AL137782.1后LMO7的mRNA和蛋白表达均显着下调。（5）过表达LncRNA AL137782.1后肺上皮细胞的迁移速度显着加快;相反,敲减LncRNA AL137782.1后肺上皮细胞的迁移速度显着减慢,但过表达LncRNA AL137782.1后敲减LMO7,肺上皮细胞的迁移速度显着减慢。结论:LncRNA AL137782.1在肺上皮细胞的细胞核和细胞质中均有表达,表明其肺上皮细胞的转录调控和转录后调控具有重要作用;LncRNA AL137782.1不参与肺上皮细胞增殖功能的调控,但参与肺上皮细胞的黏附连接、细胞迁移和免疫反应等生物学过程;LncRNA AL137782.1能够通过正向调控LMO7的表达促进肺上皮细胞的迁移。
刘颖[4]（2020）在《脂氧素A4缓解脂多糖诱导急性肺损伤的机制研究》文中研究指明目的:目前已知脂氧素A4（LXA4）可缓解脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）,但是,LXA4究竟是通过介导哪个候选基因促进肺上皮细胞钠离子通道（ENaC）开放而发挥其作用的详细机制尚不够明确。本研究主要探索LXA4究竟是通过介导哪个候选基因来调控ENaC的亚基表达?以及LXA4究竟是通过何种信号通路实现其对ENaC进行调控的?方法:1.建立ALI肺上皮细胞模型。将LPS应用于A549细胞（腺癌人类肺泡基底上皮细胞）培养液中建立ALI肺上皮细胞模型,并通过q RT-PCR（实时荧光定量PCR）测定并记录A549细胞ENaC亚基转录水平的变化。2.观察LXA4对A549细胞ENaC亚基转录水平的影响。将LXA4应用于A549细胞培养液中,通过q RT-PCR测定并观察ENaC亚基转录水平的变化。3.观察LXA4对已建立的ALI肺上皮细胞模型的ENaC亚基转录水平的影响。将LXA4添加到已含有LPS的A549细胞培养液中,通过q RT-PCR测定并观察A549细胞ENaC亚基转录水平的变化。4.对处理后的A549细胞进行转录组测序分析。通过对A549细胞组之间m RNA表达谱的比较,探寻LXA4发挥其治疗ALI作用所介导的潜在候选基因。5.通过q RT-PCR测定并观察其潜在候选基因m RNA的动态变化,以此寻找出可能的候选基因。6.采用q RT-PCR测定并观察经过LPS、LXA4、LXA4+LPS处理后的A549细胞组候选基因转录水平的变化情况。7.将不同浓度的LXA4应用于经LPS处理过的A549细胞培养液中,通过q RT-PCR测定并观察候选基因m RNA水平与LXA4浓度之间的关系,并通过western blot（蛋白质印迹法）测定并分析候选基因蛋白水平和LXA4浓度之间的关系。8.通过western blot测定和观察LXA4在不同时间间隔（0、1、2、4、6、8h）所处理的A549细胞候选基因蛋白水平与LXA4不同时间间隔处理之间的变化趋势。9.将LXA4受体（ALX）抑制剂（BOC-2）添加到LPS+LXA4处理过的A549细胞培养液中,通过western blot测定和分析候选基因和ENaC蛋白水平与BOC-2之间的关系。10.应用候选基因的si RNA对A549细胞进行处理,然后通过CCK-8（细胞计数试剂盒-8）测定并观察候选基因对A549细胞存活率的影响,并通过western blot测定并分析其对ENaC亚基表达水平的影响。11.通过利用PI3K（磷酸酰肌醇-3-激酶）抑制剂（LY294002）来明确PI3K信号通路是否参与了调控LXA4诱导候选基因的表达。结果:我们的实验结果显示:1.LPS抑制A549细胞ENaC亚基m RNA的表达,而LXA4则可增强A549细胞ENaC亚基m RNA表达,并且LXA4还可拮抗LPS对A549细胞ENaC亚基m RNA表达的抑制作用,此表明LXA4可有效缓解LPS所致的ALI。2.通过对处理后的A549细胞进行转录组测序分析后发现,潜在候选基因为PLIN2、ANGPTL4、LRP1及NDRG1等,而可能性较大的候选基因则为NDRG1。3.LPS可抑制NDRG1 m RNA的表达,而LXA4则可拮抗LPS的这种抑制作用,并可增强NDRG1 m RNA的表达。4.NDRG1m RNA表达水平随LXA4浓度的增加而升高,且NDRG1的蛋白表达水平与LXA4的浓度呈正相关;此外,LXA4还可以时间依赖性方式诱导NDRG1的蛋白表达。5.BOC-2可抑制LXA4诱导的NDRG1和ENaC的蛋白表达。6.NDRG1 si RNA不仅可抑制ENaC亚基的表达,而且还可降低A549细胞的存活率。7.LY294002不仅抑制NDRG1和ENaC亚基的表达,而且还抑制了SGK1磷酸化水平,从而揭示了LXA4介导候选基因NDRG1表达的信号通路为PI3K信号通路。结论:LXA4经由PI3K信号通路介导NDRG1的表达,增强A549细胞ENaC的表达水平,促进肺上皮细胞钠离子通道（ENaC）的开放,进而促进肺上皮细胞内的水分子排除,减轻肺水肿。本研究结果将为临床上治疗ALI/ARDS等呼吸急重症患者提供帮助,并为研究及开发治疗此类疾病的新药提供一定的理论支持。
朱磊[5]（2020）在《阿米洛利介导PI3K/AKT信号通路对ARDS大鼠肺损伤的影响》文中认为目的通过油酸诱导的ARDS大鼠模型,探讨阿米洛利对急性肺损伤的影响以及这种影响是否是通过PI3K/Akt信号通路实现的。方法将96只Wistar雄性大鼠随机分为空白对照组、DMSO组、ARDS模型组、阿米洛利干预组。建立油酸型ARDS大鼠模型,分别于注射油酸4 h、8 h和12 h时收集大鼠血清和肺泡灌洗液,称取大鼠肺组织湿重（LW）和干重（DW）,计算LW/DW比值和大鼠肺水清除率（AFC）;采用Elisa法检测大鼠血清和肺泡灌洗液中uPAR、TNF-α、IL-6和IL-10水平;采用HE染色方法观察大鼠肺组织病理学变化;采用免疫组化方法检测大鼠肺组织中VEGF、VCAM-1和ET-1阳性表达水平;采用RT-PCR法检测大鼠肺组织中uPAR、PI3K、Akt和GSK 3βmRNA表达水平;采用Western blot检测大鼠肺组织中uPAR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt和GSK 3β蛋白表达水平。结果（1）在注射油酸4 h、8 h、12 h后,与对照组比较,ARDS大鼠LW/DW明显增大,AFC值明显减小;阿米洛利干预可使LW/DW明显减小,AFC值明显增加;（2）ARDS大鼠血清和肺泡灌洗液中uPAR、TNF-α和IL-6含量明显增加,IL-10含量明显减少;阿米洛利干预后大鼠血清和肺泡灌洗液中uPAR、TNF-α和IL-6含量均明显减少,IL-10含量明显增加;（3）ARDS组大鼠肺组织肺泡壁增厚,肺泡结构被破坏,炎性细胞浸润;阿米洛利干预可改善这种病理学变化;（4）ARDS组大鼠肺组织中VEGF阳性表达明显减少,VCAM-1和ET-1阳性表达均明显增加,阿米洛利干预后VEGF表达明显增加,VCAM-1和ET-1阳性表达均明显减少;（5）ARDS大鼠肺组织中PI3K、Akt蛋白表达无明显变化,uPAR、p-PI3K和p-Akt和GSK 3β表达均明显增加,阿米洛利干预后,uPAR、p-PI3K、p-Akt和GSK 3β表达均明显减少。结论（1）阿米洛利对ARDS大鼠肺损伤具有保护作用;（2）PI3K/Akt信号通路参与ARDS大鼠肺损伤,阿米洛利通过抑制该通路改善ARDS大鼠肺损伤。
王琳[6]（2020）在《骨髓间充质干细胞条件培养基及阿魏酸通过增加肺泡Ⅱ型上皮细胞的钠通道表达参与肺纤维化机制研究》文中认为目的:肺纤维化（pulmonary fibrosis,PF）是一种肺部疾病,以上皮细胞向肺间质细胞转化及实质炎症为特征。其发病机制包含多方面复杂因素,其中肺上皮细胞尤其是肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡepithelial cells,ATⅡ）损伤是PF发生与发展的必要条件。在肺组织受损时,肺泡周围和之间的组织增厚并形成疤痕,造成肺通气及肺换气障碍并且随着PF的恶化,肺组织逐渐丧失正常功能。在肺组织中,上皮钠通道（epithelial sodium channels,ENa C）主要在ATⅡ表达,其是肺泡液体清除过程中的限速环节。我们推测ENa C可能与PF的形成有关联,并且PF组织中ENa C表达较正常肺组织,可能具有差异。同时有研究表明,小鼠骨髓间充质干细胞条件培养基（Bone marrow mesenchymal stem cell conditioned media,BMSC-CM）对治疗肺纤维化可能具有较好疗效,并且阿魏酸（ferulic acid,FA）在治疗肝及肾纤维化中也表现出良好的优势。本实验旨在探讨与ATⅡ数量有关的ENa C与PF的关系,明确其在PF模型中的表达并探讨其可能的相关机制。同时探究BMSC-CM和FA可否通过对ENa C的调控作用,进而参与PF治疗的可能性。研究方法:1、利用博莱霉素对小鼠进行PF造模。2、检测造模时间内小鼠体重的变化及生存率。3、通过Masson染色观测小鼠正常肺组织与PF组织的分布。4、利用Western blot实验在蛋白水平上测定PF对模型肺组织α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、α-和γ-ENa C表达变化的影响。5、利用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）实验在m RNA水平上测定PF对肺组织中转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）、α-SMA及α-、β-和γ-ENa C表达变化的影响。6、通过CCK-8细胞生存率实验检测小鼠骨髓间充质干细胞条件培养基（bone marrow mesenchymal stem cell conditioned media,BMSC-CM）及FA对TGF-β所致的PF细胞模型中ATⅡ生存能力的影响。7、利用Western blot实验在蛋白水平上测定BMSC-CM和FA对TGF-β1所致PF对ATⅡ的α-和γ-ENa C、α-SMA、纤粘蛋白（fibronectin,FN）以及上皮-钙粘蛋白（Epithelial-cadherin,E-cadherin）的影响。8、利用q RT-PCR实验在m RNA水平上测定FA对TGF-β1所致PF细胞模型中上述指标表达的影响。结果:1、Masson染色显示,博莱霉素造模后小鼠肺组织病理形态显着变化,肺脏纤维化特征明显。2、经博莱霉素处理过的小鼠体重经历了先下降后上升的趋势。3、随着造模时间的增长,小鼠生存率呈下降趋势。4、造模后PF小鼠肺组织中α-SMA和TGF-β在蛋白和转录水平上表达增高,而α-和γ-ENa C则呈相反的趋势。5、BMSC-CM使TGF-β所致PF细胞模型中ENa C和PF相关标志物E-cadherin蛋白表达增加,同时降低α-SMA和FN蛋白表达。6、经FA处理后,与ATⅡ数量有关的ENa C蛋白及m RNA表达水平均升高,而α-SMA和FN蛋白及m RNA表达水平降低。结论:在PF状态下,ENa C在小鼠肺组织和原代培养的ATⅡ中表达均降低。BMSC-CM和FA可能通过增强ENa C的表达参与肺纤维化上皮细胞向肺间质的转化过程。
刘宏飞[7]（2020）在《木犀草素通过上调上皮钠通道改善小鼠急性肺损伤》文中研究指明目的:急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是临床常见的呼吸系统疾病,目前仍无有效的治疗方法。肺水肿是ALI的特征之一,肺泡液体清除与肺水肿密切相关,增强肺泡液体清除有助于肺水肿病情的减轻。位于肺上皮细胞的上皮钠离子通道（epithelial sodium channels,ENaC）负责Na+的跨膜转运,对于维持肺脏的水盐转运平衡尤为重要。增加ENaC在肺上皮细胞膜上的表达可以作为治疗ALI的切入点。木犀草素（luteolin,Lut）是具有多种药理活性的类黄酮化合物,有治疗ALI等呼吸系统疾病的潜力,我们推测Lut可能通过上调ENaC活性来调节肺上皮离子转运,从而缓解ALI。本课题旨在探讨Lut对ENaC的影响及作用机制。研究方法:1、用小鼠肺湿干重比和小鼠肺泡液体清除率实验来探究Lut对小鼠肺脏液体清除的影响。2、通过HE染色实验来证明Lut对ALI模型小鼠肺组织形态学的影响。3、联合Western Blot和qRT-PCR以及膜蛋白提取技术检测Lut对小鼠肺组织及人肺上皮细胞系H441的ENaC总蛋白、mRNA以及膜蛋白表达的影响。4、采用尤斯灌流技术分析Lut对H441单层细胞短路电流的影响。5、使用ELISA法研究Lut对小鼠血清和肺组织cGMP表达水平的影响。6、应用cGMP和PI3K抑制剂验证Lut是否通过cGMP/PI3K通路影响H441细胞ENaC膜蛋白表达。结果:1、Lut能降低ALI模型小鼠的肺湿干重比,改善肺病理学变化,增加小鼠肺泡液体清除率。2、LPS诱导的H441单层细胞阿米洛利敏感性电流的下降可以被Lut逆转。3、Lut能够上调ALI小鼠肺组织ENaC的总蛋白、mRNA和膜蛋白表达以及H441细胞ENaC的总蛋白和膜蛋白表达。4、Lut可以增加ALI模型小鼠血清和肺组织cGMP表达水平。5、加入cGMP或PI3K抑制剂后,Lut上调ENaC膜蛋白表达水平的作用消失。结论:Lut能通过cGMP/PI3K通路上调ENaC表达,进而缓解小鼠ALI。
尹硕淼[8]（2019）在《青天葵总黄酮干预急性肺损伤的机制研究》文中研究表明第一部分 青天葵总黄酮的提取及成份比对目的:提取青天葵中总黄酮成份,并且对该总黄酮提取物进行成份比对。方法:采用“渗漉法”提取青天葵成份,采用AB-8大孔树脂联合聚酰胺方法提取到青天葵总黄酮。采用“高效液相色谱法”及“液相质谱连用法”对该青天葵总黄酮提取物进行成份鉴定。结果:通过对青天葵总黄酮提取物进行成份比对,发现该总黄酮提取物主要含有Complanatuoside（沙苑子苷）与 nervilifordizin A（鼠李秦素-3-O-β-D-木糖-（1→4）-β-D-葡萄糖苷）。结论:青天葵总黄酮的主要成份为Complanatuoside（沙苑子苷）与nervilifordizin A（鼠李秦素-3-0-β-D-木糖-（1→4）-β-D-葡萄糖苷）。第二部分 不同LPS剂量及不同LPS干预时间对BALB/c小鼠ALI模型的影响目的:通过气管内滴注LIPS的造模方式,探讨LPS在三个不同干预时间点对BALB/c小鼠ALI模型状态、体重变化、肺干重湿重变化、肺组织主动转运蛋白和细胞因子、新鲜肺组织外观变化及支气管肺泡灌洗液的影响。方法:将66只BALB/c小鼠随机分为10组,分别是Blank组、6h Sham组、6h 100ug LPS组、6h 200ug LPS 组、24h Sham组、24h 100ugLLPS 组、24h 200ug LPS 组、72h Sham组、72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组。采用气管内滴注LIPS的方法进行建立急性肺损伤动物模型,Blank组不作任何处理,Sham组予以滴注生理盐水,并于滴注后24h取材。LPS组气道滴注相应剂量的LPS,并在不同时间点进行取材,在造模期间对小鼠的精神状态、活动度、饮食、皮毛情况及体重进行记录;取材时留取肺组织,称取左肺干湿重;取材期间对新鲜肺组织进行外观观察并记录,RT-PCR检测肺组织AQP-1、AQP-5、α ENaC、β ENaC、γENaC、TNF-α、IL-1 β、IL-6、CXCL-1、GM-CSF、CCL-2、CXCL-15、MMP-9、MMP-12的基因表达情况。另取同样处理的小鼠进行气道盥洗液细胞计数。结果:1.小鼠一般情况:Blank组小鼠精神状态佳,呼吸均匀,反应灵敏,毛色油亮光滑,饮食正常。Sham组小鼠术后6h Sham组小鼠状态尚可,呼吸尚均匀,反应尚可,饮食差,毛色较乱;术后24h Sham组小鼠精神状态良好,呼吸均匀,饮食可,毛色正常;术后72h Sham组小鼠精神状态佳,呼吸均匀,反应灵敏,毛色恢复正常颜色,油亮光滑,饮食正常。LPS组小鼠造模后6h,100ug LPS组与200ug LPS组小鼠状态差,呼吸急促,反应迟钝,饮食差,毛色凌乱;造模24h后,100ug LPS组与200ug LPS组小鼠状态差,呼吸急促,伴有喘息及咳嗽,反应迟钝,饮食减少,毛色凌乱发黄;造模72h后,100ug LPS组与200ug LPS组小鼠极差,反应十分迟钝,饮食进一步减少,不欲活动,毛色凌乱发黄无光泽。2.小鼠体重变化:造模后24h,Sham组、100ug LPS组及200ug LPS组体重均减轻,造模后48h,Sham组小鼠体重开始恢复,而100ug LPS组及200ug LPS组体重继续减轻,造模后72h,Sham组小鼠体重已经增加,但100ug LPS组及200ug LPS组体重仍在减轻。3.小鼠湿肺干肺重量比较:湿肺质量比较中,6h Sham组、6h 200ug LPS组较空白组无差异,6h 100ug LPS组较空白组有差异（p<0.05）,6h 100ug LPS组、6h 200ug LPS组较6h Sham组无差异;24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组较空白组有差异（P<0.01）,24h 200ug LPS 组较 24h Sham 组有差异（P<005）;72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS 组较空白组有差异（P<0.01）,72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS组较72h Sham组有差异（P<0.01）。干肺质量比较中,6h Sham组、6h 100ug LPS组、6h 200ug LPS 组较空白组无差异,6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组较 6h Sham组无差异;24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组较空白组有差异（P<0.01）,24h 100ug LPS组较24h Sham组有差异（P<0.05）,24h 200ug LPS组较24h Sham组有差异（P<001）;72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS 组较空白组有差异（P<0.01）,72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组较72h Sham组有差异（P<0.01）。肺湿干重比方面,6h LPS组与Blank组比较有差异（P<0.05）,24h 100ug LPS组与空白对照组比较有差异（P<0.05）,72h LPS组较72h Sham组比较有差异（P<0.05）。小鼠多余肺水量比较中,6h 100ug LPS组较空白组有差异（P<0.01）,6h 100ug LPS组较6h Sham组有差异（P<0.05）,6h 200ug LPS 组较 6h Sham组无差异;24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组较空白组有差异（P<0.01）,24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组较 24h Sham组有差异（P<0.05）;72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组较空白组有差异（P<0.01）,72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS 组较 72h Sham 组有差异（P<0.01）。4.肺组织 RT-PCR 检测:AQP-1:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank组、6h Sham组比较存在差异（P<0.01）,6h Sham组和Blank组比较存在差异（P<0.05）;24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组与 Blank 组、24h Sham 组比较存在差异（P<0.01）;72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异（P<0.01）,72h 200ug LPS 组与 72h Sham 组比较存在差异（P<0.01）。AQP-5:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异（P<0.01）,6h 200ug LPS组与6h Sham组比较存在差异（P<0.01）;24h 100ug LPS组与Blank组比较存在差异（P<0.01）,与24h Sham组比较存在差异（P<0.01）,24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异（P<0.05）,与24h Sham组比较存在差异（P<0.01）;72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异（P<0.01）。α ENaC:6h LPS组较空白对照组及6h Sham组比较无差异;24h Sham组、24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与空白对照组比较无差异,24h LPS组与24h Sham组比较无差异;72h LPS组与空白对照组、72h Sham组比较无差异。β ENaC:6h 100ug LPS组与Blank组比较无差异,与6h Sham组比较存在差异（P<0.05）,6h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异（P<0.05）,与6h Sham组比较存在差异（P<0.01）;24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异（P<0.01）,24h 100ug LPS组与24h Sham组比较存在差异（P<0.01）,24h 200ug LPS组与24h Sham组比较存在差异（P<0.05）;72h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异（P<0.01）,72h 200ug LPS组与72h Sham组比较存在差异（P<0.05）,72h 100ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较均无差异。γ ENaC:6h Sham组较空白对照组比较存在差异（P<0.05）,6h 200ug LPS组较6h Sham组比较存在差异（P<0.05）;24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与空白对照组、24h Sham组比较无差异;72h 100ug LLPS组、72h 200ug LPS组与空白对照组、72h Sham组比较无差异。TNF-α:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与Blank 组比较存在差异（P<0.01）,与 6h Sham 组比较无差异;24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组与Blank 组、24h Sham组比较存在差异（P<0.01）,24h Sham组和Blank组比较存在差异（P<0.01）;72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异（P<0.01）,6h Sham组、24h Sham组与空白组比较有差异（P<0.01）。IL-1 β:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异（P<0.01）,6h 100ug LPS组与6h Sham组存在差异（P<0.05）,6h Sham组和Blank组比较存在差（P<0.05）;24h 100ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异（P<0.05）,24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与24h Sham组比较存在差异（P<0.01）,24h Sham组和Blank组比较存在差异（P<0.05）;在72h组中,72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异（P<0.01）。IL-6:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异（P<0.01）,6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 6h Sham 组无差异,6h Sham 组和 Blank 组比较差异（P<0.01）;24h 100ug LPS组与Blank组、24h Sham组比较存在差异（P<005）,24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异（P<0.05）,与24h Sham组比较存在差异（P<0.01）;72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS 组与 Blank 组、72h Sham组比较存在差异（P<0.01）。CXCL-1:6h 组与 Blank 组比较存在差异（P<0.01）,6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 6h Sham 组无差异;24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组与 Blank 组、24h Sham组比较存在差异（P<0.01）;72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异（P<0.01）。6h Sham组、24h Sham组与空白组比较存在差异（P<0.o1）。GM-CSF:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异（P<0.01）,6h 100ug LPS 组与 6h Sham 组比较有差异（P<0.01）,6h 200ug LPS 组与 6h Sham组有差异（P<0.05）,6h Sham组和Blank组比较有差异（P<0.05）;24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异（P<0.01）,24h 200ug LPS组与24h Sham组存在差异（P<0.01）,24h 100ug LPS组与24h Sham组存在差异（P<0.05）,24h Sham 组和 Blank 组比较存在差异（P<0.05）;72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异（P<0.05）。CCL-2:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异（P<0.01）,6h Sham 组和 Blank 组比较有差异（P<0.05）;24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异（P<0.01）,24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与24h Sham组存在差异（P<0.05）,24h Sham组和Blank组比较存在差异（P<0.05）;72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异（P<0.01）,72h 200ug LPS组与72h Sham组比较存在差异（P<0.05）,72h 100ug LPS组与72h Sham组比较存在差异（P<0.01）。CXCL-15:6h组与Blank组比较无差异,6h LPS组与6h Sham组比较无差异;24h Sham组、24h LPS组与Blank组比较无差异,24h 200ug LPS组较24h Sham组比较有差异（P<0.05）;72h组与Blank组比较无差异,72h LPS组与72h Sham组比较无差异。MMP-9:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异（P<0.01）,与6h Sham组比较无差异,6h Sham组和Blank组比较存在差异（P<0.01）;24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异（P<0.01）,24h 200ug LPS组与24h Sham组比较存在差异（P<0.05）,24h 100ug LPS组与24h Sham组比较无差异,24h Sham 组和 Blank 组比较存在差异（P<0.05）;72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异（P<0.01）。MMP-12:24h LPS组较24h Sham组比较存在差异（P<0.01）;72h 100ug LPS较Blank组比较存在差异（P<0.05）,余比较无差异。5.新鲜肺组织外观:6h组中,6h Sham组肺组织外观可以大片毛细血管出血点,伴有散在淤点,6h 100ug LPS组小鼠肺组织外观可见肺毛细血管出血点,伴有淤点,甚至融合成斑块,6h 200ug LPS组小鼠肺组织外观可见大片肺毛细血管出血点,伴有大片淤斑。24h组中,24h Sham组小鼠肺组织外观新鲜,可见极少量散在淤点,24h 100ug LPS组小鼠肺组织外观可见肺毛细血管充血水肿,伴有毛细血管破裂出血,可见淤点,甚至融合成斑块,24h 200ug LPS组小鼠肺组织外观可见大片肺毛细血管出血点,伴有大片淤斑。72h组中,72h Sham组小鼠肺组织外观正常,未见明显肺毛细血管充血水肿或出血,未见淤斑淤点,72h 100ug LPS组小鼠肺组织充血水肿明显,肉眼可见肺毛细血管破裂,融合形成淤斑淤点,72h 200ug LPS组小鼠肺组织充血水肿非常明显,肉眼可见破裂的肺组织血管,并融合形成大片的淤斑。6.肺泡灌洗液细胞计数情况支气管肺泡灌洗液总细胞计数:6h 100ug LPS组与Blank组比较有差异（P<0.05）,6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组和 6h Sham 组比较无差异;24h sham 组与 Blank组比较有差异（P<0.05）,24h 100ug L.PS组、24h 200ug LPS组较Blank组、24sham组比较有差异（P<0.01）,24h Sham组较Blank组有差异（P<0.05）;72h Blank组、72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS 组较 Blank 组比较有差异（P<0.01）,72h100ug LPS组、72h 200ug LPS组与72sham组比较存在差异（P<0.01）。支气管肺泡灌洗中性粒细胞计数:6h Sham组、6h 200ug LPS组较Blank组存在差异（P<0.01）,6h模型组与6h Sham组比较无差异;24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS 组较 Blank 组、24sham组比较有差异（P<0.01）;72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS组较Blank组、72hsham组比较有差异（P<0.01）。支气管肺泡灌洗单核巳噬细胞计数:6h组与1Bl ank组比较无差异,6h模型组与6h Sham组比较无差异;24h组与Blank组比较无差异,24h模型组与24h Sham组比较无差异;72h Sham组、72h 100ug LPS组、72h 200ug组与Blank组比较有差异（P<0.01）,72h 200ug 组与 72h Sham 组比较有差异（P<0.05）。结论:1.LPS能够诱导小鼠肺湿重、肺干重、多余肺水量的变化,随着时间延长,肺水含量逐渐增多,至72h时间点肺水含量最多,这种变化在在 6h时间点体现不明显,但在24h时间点及72h时间点变化最明显,肺水含量增多即提示肺水肿越严重。对于肺湿干重比的影响,由于LPS对小鼠的肺湿重、肺干重均有影响,所以造成比值差异不大。2.LPS能够抑制AQP-1、AQP-5、β ENaC的基因水平表达,抑制程度与LPS的100ug或200ug的用药量未见明显正相关关系,但24h 100ug LPS及200ug LPS浓度对AQP-1、AQP-5、β ENaC基因表达的抑制最稳定,而LPS达到200ug时,三个时间点对AQP-1、AQP-5、β ENaC基因的表达都有很强的抑制作用。3.LPS能够促进 TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL-1、CCL-2、GM-CSF、MMP-9 等炎症因子、趋化因子及金属蛋白酶的基因表达,这种促进在6h最强,随着时间的推进,这些因子的基因表达逐渐减弱。新鲜肺组织外观比较上看,随着时间的推移,肺损伤淤血面积及水肿程度会逐渐加深,这种损伤会因为LPS的用量增加而表现出更重的趋势。4.不同浓度的LPS在不同时间的干预下,能引起BALB/c小鼠支气管肺泡灌洗液总细胞数目及细胞分类计数的改变。我们可以发现随着时间的推移,BALF细胞总数、中性粒细胞计数和巨噬细胞计数均有所增长,这也提示肺损伤的情况随时间改变呈逐渐加重趋势。5.对Sham组分析发现,气管内滴注手术创伤或者是生理盐水气管内刺激均能导致Sham组的一些指标基因表达异常,且新鲜肺组织外观发生改变,以6h时间点为甚,但在72h是有些指标和Blank组或与之相对应的Sham组比较又无差异,所以取材时间可选择在24h时间点。第三部分 青天葵总黄酮干预急性肺损伤BALB/c小鼠模型的研究（一）目的:在本部分实验中,我们将对青天葵总黄酮干预急性肺损伤BALB/c小鼠ALI模型的研究进行探讨,青天葵总黄酮被分为3个浓度阶梯,分别为40mg/kg、180mg/kg、320mg/kg三个用药组,采用经气管内滴注10mg/kg LPS干预24h建立ALI模型,从小鼠肺湿干重比、多余肺水量、炎症因子、趋化因子、金属蛋白酶的角度来探讨青天葵总黄酮干预急性肺损伤的作用,并通过对肺水转运蛋白和紧密连接蛋白的检测,明确青天葵总黄酮治疗小鼠急性肺损伤的作用机制。方法:将64只BALB/c小鼠随机分为7组,分别是Blank组、Sham组、LPS Model组、40mg/kg 给药（40mg/kg TCM）组、180mg/kg 给药（180mg/kg TCM）组、320mg/kg给药（320mg/kg TCM）组,地塞米松（5mg/kg DEX）组。每天灌胃1次,连续灌胃7天,最后1次给药为造模后30min。Sham组与LPS Model组分别灌胃相同剂量的溶剂,即0.2ml NS。地塞米松（5mg/kg DEX）组给予每只小鼠5mg/kg DEX腹腔注射,即每只小鼠腹腔注射0.1mg DEX/0.1ml NS,腹腔注射为造模后30min进行,空白组不做处理。采用气管内滴注10mg/kg LPS的方式建立模型,干预24h后对小鼠进行取材。左肺行湿重、干重比较,其余肺组织-80℃冷冻,RT-PCR检测AQP-1、AQP-5、α ENaC、β ENaC、γ ENaC、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-18、Occludin、Z0-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL-1、GM-CSF、MMP9 等指标。结果:1.肺干重湿重比较:在湿重比较中,LPS组与Sham组比较存在差异（P<0.01）;180mg/kg组较LPS组存在差异（P<0.01）,其余用药组与LPS组比较无差异。干重比较中,LPS组与Sham组比较存在差异（P<0.01）,用药组与LPS组无差异。W/D组中,LPS组与Sham组比较存在差异（P<0.01）;180mg/kg组较LPS组存在差异（P<0.01）,其余用药组与LPS组比较无差异。多余肺水量比较中,LPS组与Sham组比较存在差异（P<0.01）;180mg/kg组较LPS组存在差异（P<0.01）,其余用药组与LPS组比较无差异。2.肺组织RT-PCR 比较:Occludin:LPS组较Sham组存在差异（P<0.01）,180mg/kg TCM组较LPS组存在差异（P<0.05）,5mg/kg DEX组较LPS组存在差异（P<0.01）。TNF-α 及 IL-1 β:LPS 较 Sham 组存在差异（P<0.01）,与 180mg/kg TCM组比较有差异（P<0.05）。AQP-1、AQP-5、α ENaC、βENaC、γENaC、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-18、Z0-1、IL-6、CXCL-1、GM-CSF、MMP9 基因表达情况未见差异。结论:青天葵总黄酮能够降低肺湿干重比及多余肺水量,从而缓解LPS诱导的急性肺损伤BALL1B/c小鼠肺水肿情况,其机制可能是通过升高紧密连接蛋白Occludin的基因表达,降低TNF-α、IL-1β的基因表达来实现的。第四部分 青天葵总黄酮干预急性肺损伤BALB/c小鼠模型的研究（二）目的:探讨青天葵总黄酮对急性肺损伤BALB/c小鼠ALI模型肺组织病理学、支气管肺泡灌洗液计数、Occludin的蛋白表达的影响。方法:将32只SPF级BALB/c小鼠随机分为4组,其中Sham组8只、Sham+180mg/kg TCM组 8 只,LPS Model 组 8 只,LPS+180mg/kg TCM 给药组 8 只。Sham+180mg/kg TCM 组及LPS+180mg/kg TCM给药组小鼠给予3.6mg青天葵总黄酮/0.2ml NS灌胃,Sham组和LPS Model组给予0.2ml NS灌胃,每日1次,连续7天,最后1次给药为造模后30min。采用气管内滴注1Omg/kg LPS的方式建立模型,干预24h后对小鼠进行取材。右肺中叶多聚甲醛固定,行HE切片,留取小鼠BALF,行总细胞计数及分类计数,剩余肺组织-80℃冻存,待检Occludin蛋白表达情况。结果:1.支气管肺泡灌洗液细胞计数比较:支气管肺泡灌洗液总细胞计数比较:LPS组较Sham组比较存在差异（P<0.01）,LPS+TCM组较LPS组比较存在差异（P<0.05）。支气管肺泡灌洗液中性粒细胞计数比较:LPS组较Sham组比较存在差异（P<0.01）,LPS+TCM组较LPS组比较存在差异（P<0.01）。气管肺泡灌洗液巨噬细胞计数比较:LPS组较Sham组比较无差异（P>0.05）,LPS+TCM组较LPS组比较无差异（P>0.05）。2.肺组织病理学及评分:Sham组及Sham+LPS组肺HE切片可见肺组织结构完整,未见肺水肿,可见巨噬细胞及少量中性粒细胞,LPS组肺HE切片可见肺组织结构遭到破坏,肺间质水肿明显,伴有大量中性粒浸润,肺泡出现塌陷,且存在肺不张,LPS+TCM组损伤程度低于LPS组。评分结果显示,LPS组评分较Sham组比较,存在差异（P<0.01）,LPS+TCM组较LPS组存在差异（P<0.01）。3.Western Blot检测Occludin的蛋白表达:LPS组Occludin蛋白表达量低于Sham组,较Sham组存在差异（P<0.01）,LPS+TCM组Occludin蛋白表达量高于LPS组,较LPS组存在差异（10<0.01）。结论:青天葵总黄酮能够通过降低支气管肺泡灌洗液中的总细胞数及中性粒细胞数,改善肺组织病理学,促进肺组织中紧密连接蛋白Occludin的蛋白表达,从而起到保护LPS所诱导的ALI的作用。
王巧兴[9]（2018）在《新型H7N9禽流感病毒感染后肺部保护屏障的改变》文中研究指明研究目的:利用分子生物学技术,检测人感染H7N9禽流感患者肺部粘蛋白、紧密连接蛋白及肺泡表面活性蛋白的改变,以初步探究人感染H7N9禽流感患者气道粘液纤毛清除功能、肺上皮细胞屏障功能、肺泡结构稳定性及肺部固有免疫反应的改变。研究方法:回顾性分析人感染H7N9禽流感患者的病例资料,分析总结其个人资料、临床表现、化验检查等,为疾病的诊治提供一定的依据;利用HE染色方法观察人感染H7N9禽流感患者肺部病理改变;同时,利用qRT-PCR法检测其肺部粘蛋白、紧密连接蛋白及肺表面活性蛋白的表达情况,初步了解H7N9禽流感病毒感染后气道粘液纤毛清除功能、肺上皮细胞屏障功能、肺泡结构稳定性及肺部固有免疫反应的改变。研究结果:（1）本课题收集的4例人感染H7N9禽流感患者均有禽类接触史,均为患有基础疾病的中老年人。主要临床表现有高热、咳嗽、气短、呼吸困难、胸闷、胸痛、咯血、腹痛等。4例患者均出现感染性休克及ARDS并发症,部分患者还出现急性肾损伤、脑病和横纹肌溶解等。胸部X线及胸部CT都表现为双侧肺实变及磨玻璃样改变,部分患者出现胸腔积液。实验室检测结果均表现为淋巴细胞及血小板减低。（2）H7N9禽流感病毒感染后,肺部可见肺出血及后期纤维组织增生。气道粘蛋白MUC2、MUC5B和MUC5AC mRNA相对表达量均增加。气道紧密连接蛋白CLDN1、CLDN5、CLDN7和CLDN18的mRNA相对表达量均降低,CLDN3mRNA相对表达量明显升高。肺泡表面活性蛋白SPA、SPC和SPD mRNA相对表达量明显降低,而SPB mRNA相对表达量明显升高。研究结论:（1）H7N9禽流感病毒感染多与直接接触家禽有关,好发于中老年人群,尤其是患有基础疾病的人群,这可能与这些人的免疫功能低下有关。人感染H7N9禽流感患者多表现为持续高热、咳嗽、呼吸困难等症状,并可迅速进展为感染性休克、ARDS、急性肾功能损伤等。人感染H7N9禽流感患者胸部影像学为单侧或双侧肺实变或磨玻璃样改变,实验室检查可呈现为淋巴细胞减少症和血小板减少症。（2）人感染H7N9禽流感患者肺部典型的病理表现为肺出血及后期弥漫性肺损伤后纤维增生。H7N9禽流感病毒感染后,肺部的防御保护屏障即气道粘液纤毛清除功能、肺上皮细胞屏障功能、肺泡结构的稳定性及肺部固有免疫反应可能发生改变。总之,人感染H7N9禽流感流行病学有一定特点,肺部病理改变明显,肺部的防御保护屏障即气道粘液纤毛清除功能、肺上皮细胞屏障功能、肺泡结构的稳定性及肺部固有免疫反应可能发生改变。
王国全[10]（2014）在《凉膈散对内毒素型急性肺损伤肺组织水液转运的影响及机制研究》文中提出目的与意义：急性肺损伤（Acute lung injury, ALI）是指由严重感染、创伤、休克等多种因素引起肺组织结构发生特征性的病理改变而出现的一种临床综合症,是急救医学中发病率和死亡率都很高的一种临床重症。诊断上以弥漫性肺泡毛细血管膜损伤导致肺水肿和肺不张为主要病理特征。临床表现为呼吸窘迫,伴有顽固性低氧血症、肺顺应性下降和扩散性炎症浸润等症状,其病死率高达45%-50%。感染性败血症是其发生的常见原因,革兰氏阴性菌是主要致病菌,起损伤作用的是内毒素（endotoxin）。迄今为止ALI确切的发病机理尚不清楚,因此深入研究ALI的发病机理对急症医学领域显得尤为重要。凉膈散出自《太平惠民和剂局方》,由大黄、芒硝、甘草、栀子、薄荷、黄芩、连翘、竹叶、蜂蜜组成,具有清上凉膈,泻火通便功效,主治上中二焦火热证,是中医治疗温热病的经典名方。课题组前期试验发现该方对内毒素导致的急性肺损伤大鼠有明显的保护作用,它可以明显对抗内毒素,控制炎症发展,但是凉膈散是否通过改善作用于钠通道及其相关水液通路的功能而发挥保护作用,这方面研究还未见报道。本实验就是通过LPS型ALI模型大鼠研究凉膈散对ALI的防治作用,如行动脉血气分析、测定肺组织湿／干质量比值（W/D）、肺脏水通透性（LPI）等指标检测,并且在明确其改善肺组织水液代谢障碍作用的基础上,继续观测该方对ALI模型大鼠肺组织α，β，γ-rENaC,Na+-K+-ATase，AQP-3及其mRNA表达水平的影响,探讨凉膈散改善ALI大鼠肺水肿的作用机制和作用靶点,从而为该方的临床应用提供理论和实验依据。实验方法：1.动物分组及模型取健康成年Wistar雄性大鼠300只,体重180-220g,分为正常对照组（ig生理盐水）、ALI模型组（ig生理盐水,气管滴注LPS2mg/kg），凉膈散高剂量+钠通道抑制剂Bemzamil组（ig30g生寥/kg,iv Bemzamil50mmol/L,气管滴注LPS2mg/kg），凉膈散高剂量组（ig30g生药/kg,气管滴注LPS2mg/kg）,凉膈散低剂量组（ig7.5g生药/kg,气管滴注LPS2mg/kg）,地塞米松组（ig DEX0.27mg/kg,气管滴注LPS2mg/kg）,每组10只。钠通道抑制剂Bemzamil组从预防给药开始每天尾静脉注射Bemzamil （50mmol/L）0.2ml,直至ALI造模当天。各组大鼠在给予生理盐水或LPS后1、2、4、8、16h不同时相处死、取材。2.大鼠LPS致急性肺损伤模型的筛选及建立3.凉膈散对LPS诱发ALI模型大鼠肺水转运障碍的治疗作用研究3.1大鼠的一般体征观察3.2肺水含量（W/D）的变化3.3呼吸功能测定（呼吸频率,呼吸周期）3.4血气分析（Pa02和PaCO2变化）3.5肺泡通透指数（LPI）测定3.6血管外肺水（EVLW）含量的测定3.7病理形态学检查和评分4.凉膈散对LPS诱发ALI模型大鼠肺组织水液转运障碍的保护作用机制研究4.1免疫组化（SP）法检测LPS诱发ALI模型大鼠肺组织α-rENaC，β-rENaC， γ-rENaC,Na+-K+-ATase蛋白的分布及表达4.2免疫印迹分析（WesternBlotting）法检测LPS致发ALI模型大鼠肺组织α-rENaC，β-rENaC，β-rENaC,APQ-3和Na+-K+-ATase蛋白表达4.3荧光反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测LPS致ALI模型大鼠肺组织α-rENaC、β-rENaC、γ-rENaC,Na+-K+-ATase基因的表达5.统计学分析采用SPSS17.0统计软件,计量资料均用均数±标准差（χ±s）表示,单独效应分析,各实验组间均数间多重比较均被采用,使用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,方差齐时各组间两两比较采用LSD法,方差不齐时使用Dunnett’s T3法,所有统计结果均以P<0.05表示差异具有统计学意义,P<0.01表示有显着性差异。实验结果：1.LPS型ALI大鼠模型的筛选及建立通过采用两种不同内毒素和三种给药方式,筛选和建立合适的ALI大鼠模型。结果发现大鼠气管滴注浓度为2mg/kg LPS0111:B4所导致的ALI模型损伤程度适中可控,符合实验要求,即定为实验目标内毒素、给药途径和实验浓度。2.大鼠的一般体征的观察各组支气管滴加LPS诱发大鼠ALI后,大鼠均出现心跳加快、呼吸急促、精神不振、烦躁不安、行动迟缓、恶寒、蜷缩成团状等症状,地塞米松组和凉膈散高低剂量组大鼠症状均好于模型组和Benzamil+凉膈散高剂量组。3.肺水含量（W/D）的变化LPS可以诱导大鼠肺组织湿质量/干质量值（W/D）升高。其中2、4、8、16h时间点,W/D在ALI模型组较对照组显着增加（P<0.01）,凉膈散各剂量组、地塞米松组较ALI模型组显着降低（P<0.05,P<0.05,P<0.01）。4.呼吸频率的变化LPS可以导致大鼠肺组织呼吸频率升高,其中ALI组在2、4、8、16h时间点呼吸频率较正常对照组显着加快（P<0.01）,凉膈散各剂量组、地塞米松组较ALI模型组显着降低（P<0.01,P<0.01,P<0.01）。5.呼吸周期的变化LPS可以导致大鼠肺呼吸周期缩短,其中ALI组在2、4、8、16h时间点呼吸周期较正常对照组显着缩短（P<0.01）,凉膈散各剂量组、地塞米松组较ALI模型组显着延长（P<0.01,P<0.01,P<0.05）。6.血气分析PaO2检测ALI模型大鼠肺PaO2显着降低,其中ALI组在2、4、8、16h时间点PaO2较正常对照组显着降低（P<0.01）,凉膈散各剂量组、地塞米松组较ALI模型组显着升高（P<0.05,P<0.05,P<0.01）。7.血气分析PaCO2检测ALI模型大鼠肺PaCO2升高,其中ALI组在2、4、8、16h时间点PaCO2较正常对照组显着升高（P<0.01）,凉膈散各剂量组、地塞米松组较LPS组显着降低（P<0.01,P<0.05,P<0.01）。8.肺泡通透指数（LPI）测定LPS诱导的ALI模型大鼠肺组织LPI显着升高,其中2、4、8、16h点LPI在ALI组较正常对照组显着增加（P<0.01）,凉膈散大小剂量组、地塞米松组较ALI模型组显着降低（P<0.05,P<0.01,P<0.01）。9.血管外肺水（EVLW）含量的测定LPS可以诱导大鼠肺组织血管外肺水（EVLW）升高,其中2、4、8、16h时间点EVLW在ALI模型组较正常对照组显着增加（P<0.01）,凉膈散高低剂量组、地塞米松组较ALI模型组显着降低（P<0.01,P<0.01,P<0.01）。10.病理形态学检查和评分肺大体观察,大鼠LPS致损后2h,双肺体积增大,明显肺水肿。随着时间的延长,肺水肿程度越来越明显,表面广泛分布斑点状红色出血灶。光镜下可见肺泡隔增厚,肺间质及肺泡水肿,出血,并有大量炎性细胞的浸润,部分肺不张,肺泡结构破坏。凉膈散各剂量组及地塞米松组可不同程度的减少肺泡间隔和炎性细胞的浸润。正常对照组肺泡结构完整、清晰,无渗出。11.凉膈散对LPS诱发大鼠ALI肺组织a-rENaC、β-rENaC、γ-rENaC,Na+-K+-ATase和AQP-3蛋白表达的影响11.1α、β、γ-rENaC免疫组化检测结果α、β、γ-rENaC蛋白为膜蛋白,其主要分布在细胞膜和细胞质中,在各组肺组织中均有表达,各组α、β、γ-rENaC蛋白相比较都有显着的统计学差异（F=110.376,P<0.01; F=132.29,P<0.01; F=826.509,P<0.05）。ALI模型组和Benzamil+凉膈散低剂量组α、β、γ-rENaC蛋白表达显着低于正常对照组（P<0.01）,ALI模型组和Benzamil+凉膈散低剂量组α-rENaC蛋白相比较无统计学差异（P>0.05）。地塞米松组和凉膈散组高低剂量组的表达高于ALI模型组（P<0.05、P<0.01、P<0.05）。说明凉膈散能有效提高LPS致ALI模型大鼠肺组织α、β、γ-rENaC蛋白低表达。11.2α-Na+-K+-ATPase免疫组化检测结果α-Na+-K+-ATPase蛋白广泛分布于细胞当中,在各组肺组织中均有表达,各组α-Na+-K+-ATPase蛋白相比较都有显着的统计学差异（F=568.495,P<0.05）。ALI模型组和Benzamil+凉膈散高剂量组α-Na+-K+-ATPase蛋白表达显着低于正常对照组（P<0.01）,地塞米松组、凉膈散高低剂量组的表达高于ALI模型组（P<0.05）。说明凉膈散可促进LPS致ALI模型大鼠肺组织α-Na+-K+-ATPase蛋白的表达。11.3α、β、γ-rENaC免疫印迹检测结果各组α、β、β-rENaC表达比较有显着的统计学差异（F=493.841,P<0.01；F=370.742, P<0.01;F=6.526,P<0.01）, ALI模型组大鼠肺组织α、β、γ-rENaC表达与正常对照组相对比明显降低,统计学有显着性差异（P<0.01）,凉膈散高低剂量组与ALI模型组比较升高,有显着性差异（P<0.01）,α、β、γ-rENaC表达与凉膈散给药剂量高低有关,地塞米松组与ALI模型组比较,升高作用较明显,有统计学差异（P<0.01、P<0.05、P<0.05）,表明凉膈散可提高ALI模型大鼠肺组织α、β、γ表达水平。11.4AQP-3免疫印迹检测结果各组AQP-3表达比较有显着的统计学差异（F=73.925,P<0.05）, ALI模型组肺组织AQP-3表达与正常对照组相对比明显降低,统计学有显着性差异（P<0.05）,凉膈散高低剂量组与ALI模型组比较升高,有显着性差异（P<0.01,P<0.05）, AQP-3表达与凉膈散给药剂量高低有关,地塞米松组与ALI模型组比较,升高作用较明显,有统计学差异（P<0.01）。Benzamil+凉膈散高剂量组与ALI模型组比较,Benzamil+凉膈散高剂量组的AQP-3蛋白表达明显提高（P<0.05）,这说明当Benzamil抑制钠通道功能时,凉膈散还能通过调节AQP-3蛋白表达来改善ALI模型大鼠肺水转运障碍。11.5α-Na+-K+-ATPase免疫印迹检测结果各组α-Na+-K+-ATPase表达比较有显着的统计学差异（F=86.189,P<0.05）,ALI模型组肺组织α-Na+-K+-ATPase表达与正常对照组相对比明显降低,统计学有显着性差异（P<0.05）,凉膈散高低剂量组与ALI模型组比较升高,有显着性差异（P<0.01）,α-Na+-K+-ATPase表达与凉膈散给药剂量高低有关,地塞米松组ALI模型组比较,升高作用较明显,有统计学差异（P<0.05）,而且我们发现当Benzamil抑制钠通道功能时,Benzamil+凉膈散高剂量组与ALI模型组比较,Benzamil+凉膈散高剂量组的α-Na+-K+-ATPase蛋白表达明显提高,表明凉膈散减轻ALI模型大鼠肺水代谢障碍可能通过提高肺组织α-Na+-K+-ATPase表达水平来实现。当钠通道被抑制时,他还可以提高α-Na+-K+-ATPase和水通道蛋白来改善水液代谢。12.反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测凉膈散对内毒素诱发大鼠ALI肺组织α-rENaC、β-rENaC、γ-rENaC,Na+-K+-Atase基因表达的影响12.1qRT-PCR检测凉膈散对内毒素诱发大鼠ALI肺组织α、β、γ-rENaC基因表达的影响正常对照组α、β、γ-rENaC基因表达明显高于ALI模型组,有显着性差异（P<0.01,P<0.01,P<0.05）；地塞米松阳性对照组的α、β、γ-rENaC基因表达高于ALI模型组,具有统计学差异（P<0.01,P<0.01,P<0.05）；凉膈散各剂量组α、β、γ-rENaC基因表达高于与ALI模型组,有显着性差异（P<0.01,P<0.01,P<0.05）。12.2qRT-PCR检测凉膈散对内毒素诱发大鼠ALI肺组织α-Na+-K+-ATPase基因表达的影响ALI模型组的α-Na+-K+-ATPase基因表达低于正常对照组（P<0.01）,说明造模后大鼠体内α-Na+-K+-ATPase基因表达受到了影响。凉膈散各剂量组和地塞米松组α-Na+-K+-ATPase基因表达均高于与ALI模型组,有显着性差异（P<0.01,P<0.05,P<0.05）。实验结论：1.LPS支气管滴注诱发大鼠急性肺损伤后,大鼠肺组织肺水含量（W/D）、肺泡通透指数（LPI）、血管外肺水（EVLW）、病理形态学检查评分以及呼吸频率显着升高,而呼吸周期和Pa02显着下降,提示造模成功。凉膈散对大鼠急性肺损伤肺水肿有保护作用,能明显提高ALI模型大鼠呼吸周期和PaO2指数,降低肺组织肺水含量（W/D）、肺泡通透指数（LPI）和血管外肺水（EVLW）等指标。2.免疫组化、免疫印迹以及反转录聚合酶链式反应分析法检测结果提示,LPS诱发大鼠ALI后,与对照组比较,ALI模型大鼠肺组织内α，β，γ-rENaC. α-Na+-K+-ATPase和AQP-3蛋白表达明显减少。凉膈散可通过上调ALI模型大鼠肺组织内α，β，γ-rENaC，α-Na+-K+-ATPase和AQP-3蛋白表达水平和mRNA的表达水平,改善肺组织液体的异常转运,减轻ALI模型大鼠肺水肿症状。
二、Ⅱ型肺上皮细胞钠通道的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Ⅱ型肺上皮细胞钠通道的研究进展（论文提纲范文）
（1）肺泡上皮细胞多糖包被及紧密连接在ARDS中变化及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 图A:总技术路线图 |
| 第一部分 LPS对肺泡上皮细胞多糖包被侧链-HS的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 LPS致ARDS中HPA对肺泡上皮细胞多糖包被的结构及功能的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第三部分 LPS致ARDS中肺泡上皮细胞紧密连接的变化 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第四部分 探讨HPA-HS与紧密连接损伤的相关性 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第五部分 创新性与局限性 |
| 第六部分 全文总结 |
| 综述 肺泡上皮屏障在ARDS中研究新进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 (待发表) |
（2）上皮细胞钠通道A663T多态性与突发性耳聋的相关性分析（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 上皮细胞钠通道A663T多态性研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（3）LncRNA AL137782.1在肺上皮细胞中的功能分析及对肺上皮细胞迁移的调控作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英汉缩写词对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 长链非编码RNA概述 |
| 1.2 长链非编码RNA的调控机制 |
| 1.3 长链非编码RNA对肺上皮细胞功能调控的研究进展 |
| 1.4 LIM域7(LMO7)的研究进展 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 LncRNA AL137782.1在肺上皮细胞中的表达、定位及功能分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 LncRNAAL137782.1调控肺上皮细胞迁移的机制初探 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）脂氧素A4缓解脂多糖诱导急性肺损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英汉缩略词表 |
| 1 前言 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 实验条件 |
| 2.2 主要的实验材料及实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 LPS及 LXA4对A549 细胞ENaC亚基表达的影响 |
| 3.2 寻找候选基因 |
| 3.3 NDRG1与LXA4 之间的关系 |
| 3.4 LXA4 介导NDRG1 经由的信号通路 |
| 4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表论文及科研成果清单 |
| 附记 |
（5）阿米洛利介导PI3K/AKT信号通路对ARDS大鼠肺损伤的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 ARDS研究进展 |
| 1.1.1 定义和流行病学 |
| 1.1.2 病理学 |
| 1.1.3 发病机制 |
| 1.1.4 药物治疗现状 |
| 1.2 PI3K/AKT信号通路与ARDS的研究进展 |
| 1.2.1 PI3K/Akt信号通路 |
| 1.2.2 PI3K/Akt信号通路与ARDS |
| 1.3 UPAR与 PI3K/AKT信号通路的研究进展 |
| 1.3.1 uPAR |
| 1.3.2 阿米洛利 |
| 1.3.3 uPAR与 PI3K/Akt信号通路 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 资料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 ARDS大鼠模型建立 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.2.3 样品收集 |
| 2.2.4 大鼠肺组织湿重/干重比测定 |
| 2.2.5 肺泡液体清除率(AFC)的测定 |
| 2.2.6 ELISA检测大鼠血清和肺泡灌洗液中uPAR、TNF-α、IL-6和IL-10含量 |
| 2.2.7 HE染色观察大鼠肺组织病理学变化 |
| 2.2.8 免疫组化检测大鼠肺组织VEGF、VCAM-1和ET-1 阳性表达水平 |
| 2.2.9 RT-PCR法检测大鼠肺组织uPAR、PI3K、Akt和 GSK3βmRNA表达 |
| 2.2.10 WB检测大鼠肺组织uPAR和 PI3K/Akt信号通过关键蛋白的表达 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 阿米洛利对大鼠肺组织LW/DW值的影响 |
| 3.2 阿米洛利对大鼠肺组织AFC的影响 |
| 3.3 阿米洛利对大鼠血清和肺泡灌洗液中UPAR、TNF-Α、IL-6和IL-10 含量的影响 |
| 3.3.1 血清 |
| 3.3.2 肺泡灌洗液 |
| 3.4 阿米洛利对大鼠肺组织形态学的影响 |
| 3.5 阿米洛利对大鼠肺组织中VEGF表达的影响 |
| 3.6 阿米洛利对大鼠肺组织中VCAM-1表达的影响 |
| 3.7 阿米洛利对大鼠肺组织中ET-1表达的影响 |
| 3.8 阿米洛利对大鼠肺组织中UPAR表达的影响 |
| 3.9 阿米洛利对大鼠肺组织中PI3K/AKT信号通路因子表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 在学期间的研究成果 |
| 伦理批准函 |
（6）骨髓间充质干细胞条件培养基及阿魏酸通过增加肺泡Ⅱ型上皮细胞的钠通道表达参与肺纤维化机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器和材料 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胎鼠ATⅡ的分离与培养 |
| 2.2.2 Masson染色 |
| 2.2.3 PF造模 |
| 2.2.4 Western Blot分析 |
| 2.2.5 q RT-PCR分析 |
| 2.2.6 细胞计数 |
| 2.2.7 CCK-8检测细胞相对生存率 |
| 2.2.8 BMSC-CM及 FA对 ATⅡ中ENa C及相关标识物表达影响 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 小鼠体重随造模时间的变化 |
| 3.2 造模时间内小鼠生存率 |
| 3.3 肺组织病理形态变化 |
| 3.4 PF组织模型中α-SMA、ENa C蛋白表达情况 |
| 3.5 PF组织中α-SMA、TGF-β、ENa C m RNA的表达情况 |
| 3.6 BMSC-CM对 ATⅡ的生存能力的影响 |
| 3.7 BMSC-CM对 ATⅡ细胞中ENa C蛋白表达水平的影响 |
| 3.8 BMSC-CM对小鼠PF标志物蛋白表达的影响 |
| 3.9 FA对ATⅡ生存率的影响 |
| 3.10 FA对 ATⅡ细胞中ENa C蛋白表达水平的影响 |
| 3.11 FA对小鼠PF标志物蛋白表达的影响 |
| 3.12 FA对 TGF-β所致PF的 ENa C及标志物m RNA表达影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）木犀草素通过上调上皮钠通道改善小鼠急性肺损伤（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 动物和细胞 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器和材料 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 ALI小鼠模型的建立和样本采集处理 |
| 2.2.2 HE染色 |
| 2.2.3 AFC的测定 |
| 2.2.4 H441细胞培养 |
| 2.2.5 CCK-8实验 |
| 2.2.6 尤斯灌流实验 |
| 2.2.7 Western Blot分析 |
| 2.2.8 RT–PCR分析 |
| 2.2.9 ELISA分析 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Lut降低ALI小鼠肺组织W/D |
| 3.2 HE染色实验染色检测模型小鼠肺组织结果变化情况 |
| 3.3 Lut增加小鼠AFC |
| 3.4 Lut上调ALI小鼠肺组织α-、γ-ENa C总蛋白表达 |
| 3.5 Lut上调ALI小鼠肺组织α-、β-和γ-ENa C m RNA表达 |
| 3.6 Lut对H441细胞增殖能力的影响 |
| 3.7 Lut增加H441 细胞中Isc |
| 3.8 Lut上调H441 细胞α-、γ-ENa C总蛋白表达 |
| 3.9 Lut上调H441 细胞以及小鼠肺组织α-、γ-ENa C膜蛋白表达 |
| 3.10 Lut增加小鼠血清和肺组织c GMP表达 |
| 3.11 Lut通过c GMP/PI3K通路上调H441 细胞α-、γ-ENa C膜蛋白表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）青天葵总黄酮干预急性肺损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 理论研究 |
| 1.1 急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的现代医学认识 |
| 1.1.1 急性呼吸窘迫综合征的诊断标准 |
| 1.1.2 发病机制和病理生理认识 |
| 1.1.3 急性呼吸窘迫综合征的药物治疗 |
| 1.2 祖国医学对急性肺损伤的认识 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 病因病机 |
| 1.2.3 辨证分型 |
| 1.2.4 方药论治 |
| 1.2.5 小结 |
| 1.3 肺泡水液转运机制研究 |
| 1.3.1 被动转运机制 |
| 1.3.2 主动转运机制 |
| 1.3.3 “肺主治节”与肺水转运蛋白的相关性 |
| 1.4 紧密连接蛋白(Tight Junction Protein, TJ)与肺水肿的关系 |
| 1.4.1 Claudins |
| 1.4.2 Occludin |
| 1.4.3 ZO-1 |
| 1.5 青天葵的研究状况 |
| 1.5.1 概述 |
| 1.5.2 化学成分研究 |
| 1.5.3 青天葵药理研究 |
| 1.5.4 导师运用青天葵的经验 |
| 1.6 青天葵与急性肺损伤关系前期基础研究 |
| 第二章 青天葵总黄酮的提取及成份比对 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 设备及仪器 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 中药材品种及鉴定 |
| 2.1.4 青天葵对照品 |
| 2.2 实验方法及步骤 |
| 2.2.1 青天葵醇提物的制备及浓缩 |
| 2.2.2 青天葵总黄酮的提取 |
| 2.2.3 青天葵总黄酮洗脱液的干燥 |
| 2.2.4 青天葵总黄酮提取物的比对 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 高效液相色谱结果 |
| 2.3.2 液相质谱连用结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 不同LPS剂量及不同LPS干预时间对BALB/c小鼠ALI模型的影响(一) |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 设备及仪器 |
| 3.1.2 试剂及器械 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.2 实验步骤、观察内容及操作方法 |
| 3.2.1 动物分组 |
| 3.2.2 小鼠状态观测、小鼠体重监测 |
| 3.2.3 LPS的配制及气管内滴注 |
| 3.2.4 取材及检验 |
| 3.3 数据处理及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 小鼠一般情况 |
| 3.4.2 小鼠体重变化 |
| 3.4.3 小鼠湿肺干肺重量比较 |
| 3.4.4 肺组织RT-PCR检测 |
| 3.4.5 小鼠新鲜肺组织外观形态比较 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 小鼠一般状态及体重变化 |
| 3.5.2 小鼠肺组织湿重、干重、湿干重比及多余肺水量的情况 |
| 3.5.3 小鼠肺组织RT-PCR肺水转运蛋白的情况 |
| 3.5.4 小鼠肺组织RT-PCR细胞因子的情况 |
| 3.5.5 小鼠新鲜肺组织外观形态比较的情况 |
| 3.5.6 其它因素对RT-PCR指标的影响 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 不同LPS剂量及不同LPS干预时间对BALB/c小鼠ALI模型的影响(二) |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 设备及仪器 |
| 4.1.2 试剂及器械 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.2 实验步骤及操作方法 |
| 4.2.1 动物分组 |
| 4.2.2 LPS的配制及气管内滴注 |
| 4.2.3 支气管肺泡灌洗液的灌洗 |
| 4.2.4 支气管肺泡灌洗液的处理步骤 |
| 4.3 数据处理及统计方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 支气管肺泡灌洗液总细胞计数比较 |
| 4.4.2 支气管肺泡灌洗液中性粒细胞计数比较 |
| 4.4.3 支气管肺泡灌洗液巨噬细胞计数比较 |
| 4.4.4 支气管肺泡灌洗液淋巴细胞计数比较 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 青天葵总黄酮干预急性肺损伤BALB/c小鼠模型的研究(一) |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 设备及仪器 |
| 5.1.2 试剂及器械 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.2 实验步骤 |
| 5.2.1 动物分组 |
| 5.2.2 药物配制方法 |
| 5.2.3 药物干预 |
| 5.2.4 模型建立 |
| 5.3 观察指标 |
| 5.3.1 小鼠湿肺干肺重量比较 |
| 5.3.2 肺组织RT-PCR检测 |
| 5.4 数据统计及分析 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 小鼠湿肺干肺重量比较 |
| 5.5.2 肺组织RT-PCR检测 |
| 5.6 讨论 |
| 5.6.1 小鼠模型评价 |
| 5.6.2 青天葵总黄酮的疗效评价 |
| 5.6.3 地塞米松的疗效评价 |
| 5.6.4 空白对照组与假手术组的设立评价 |
| 5.7 结论 |
| 第六章 青天葵总黄酮干预急性肺损伤BALB/c小鼠模型的研究(二) |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 设备及仪器 |
| 6.1.2 试剂及器械 |
| 6.1.3 实验动物 |
| 6.2 实验步骤 |
| 6.2.1 动物分组 |
| 6.2.2 药物配制方法 |
| 6.2.3 药物干预 |
| 6.2.4 模型建立 |
| 6.3 观察指标 |
| 6.3.1 支气管肺泡灌洗液总细胞计数及分类细胞计数 |
| 6.3.2 肺组织HE切片及肺损伤评分 |
| 6.3.3 Western Blot实验方法简略步骤 |
| 6.4 数据处理及统计方法 |
| 6.5 实验结果 |
| 6.5.1 支气管肺泡灌洗液细胞计数比较 |
| 6.5.2 肺组织病理学及评分 |
| 6.5.3 Western Blot |
| 6.6 讨论 |
| 6.6.1 青天葵总黄酮对支气管肺泡灌洗液的影响 |
| 6.6.2 青天葵总黄酮对肺组织病理学的影响 |
| 6.6.3 青天葵总黄酮对紧密连接蛋白Occludin蛋白表达的影响 |
| 6.7 结论 |
| 第七章 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（9）新型H7N9禽流感病毒感染后肺部保护屏障的改变（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 缩略语/符号说明 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 一、人感染H7N9禽流感病例资料收集与分析 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 研究方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 一般资料 |
| 1.2.2 临床表现、并发症及预后 |
| 1.2.3 影像学改变 |
| 1.2.4 实验室检查 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 人感染H7N9禽流感流行病学 |
| 1.3.2 人感染H7N9禽流感临床表现、并发症 |
| 1.3.3 人感染H7N9禽流感影像学及实验室检查 |
| 1.4 小结 二、人感染H7N9禽流感病例组织标本的病理改变 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 人感染H7N9禽流感患者及对照组标本收集 |
| 2.1.2 组织标本制备及HE染色 |
| 2.1.3 总RNA提取及实时荧光定量PCR |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 H7N9组和对照组肺组织HE染色镜下改变 |
| 2.2.2 H7N9组及对照组肺部粘蛋白相对表达量的改变 |
| 2.2.3 H7N9组及对照组肺部紧密连接蛋白相对表达量的改变 |
| 2.2.4 H7N9组及对照组肺部表面活性蛋白相对表达量的改变 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 人感染H7N9禽流感患者肺部病理表现 |
| 2.3.2 人感染H7N9禽流感患者气道粘蛋白改变 |
| 2.3.3 人感染H7N9禽流感肺部紧密连接蛋白改变 |
| 2.3.4 人感染H7N9禽流感肺表面活性蛋白改变 |
| 2.4 小结 结论 参考文献 发表论文和参加科研情况说明 附录 综述 人感染H7N9禽流感 |
| 综述参考文献 致谢 个人简历 |
（10）凉膈散对内毒素型急性肺损伤肺组织水液转运的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 LPS型急性肺损伤大鼠模型的筛选和建立 |
| 1.1 技术路线图 |
| 1.2 材料与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 1.7 参考文献 |
| 第二章 凉膈散对内毒素(LPS)诱发急性肺损伤(ALI)大鼠肺水肿的治疗和保护作用 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三章 免疫组化法探讨凉膈散对内毒素致急性肺损伤大鼠肺组织α-rENaC、β-rENaC、γ-rENaC及Na~+-K~+-ATase蛋白表达水平影响 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 3.6 参考文献 |
| 第四章 免疫印迹分析(Westernblotting)法检测LPS致急性肺损伤大鼠肺组织α、β、γ,-rENaC、α-Na~+-K~+-ATP和AQP-3蛋白表达 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 4.6 参考文献 |
| 第五章 反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测LPS致急性肺损伤大鼠肺组织α、β、γ-rENaC,α-Na~+-K~+-ATP基因的表达 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 5.7 参考文献 |
| 创新和展望 |
| 攻读学位期间成果 |
| 中英文缩略词对照表 |
四、Ⅱ型肺上皮细胞钠通道的研究进展（论文参考文献）
- [1]肺泡上皮细胞多糖包被及紧密连接在ARDS中变化及机制[D]. 李君. 山东大学, 2021(11)
- [2]上皮细胞钠通道A663T多态性与突发性耳聋的相关性分析[D]. 陈家磊. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]LncRNA AL137782.1在肺上皮细胞中的功能分析及对肺上皮细胞迁移的调控作用研究[D]. 张颖. 宁夏大学, 2021
- [4]脂氧素A4缓解脂多糖诱导急性肺损伤的机制研究[D]. 刘颖. 暨南大学, 2020(07)
- [5]阿米洛利介导PI3K/AKT信号通路对ARDS大鼠肺损伤的影响[D]. 朱磊. 兰州大学, 2020(01)
- [6]骨髓间充质干细胞条件培养基及阿魏酸通过增加肺泡Ⅱ型上皮细胞的钠通道表达参与肺纤维化机制研究[D]. 王琳. 中国医科大学, 2020
- [7]木犀草素通过上调上皮钠通道改善小鼠急性肺损伤[D]. 刘宏飞. 中国医科大学, 2020
- [8]青天葵总黄酮干预急性肺损伤的机制研究[D]. 尹硕淼. 广州中医药大学, 2019(04)
- [9]新型H7N9禽流感病毒感染后肺部保护屏障的改变[D]. 王巧兴. 天津医科大学, 2018(02)
- [10]凉膈散对内毒素型急性肺损伤肺组织水液转运的影响及机制研究[D]. 王国全. 南方医科大学, 2014(11)