导读:本文包含了花生基因克隆论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:花生,转录因子,ABI4,盐胁迫
花生基因克隆论文文献综述
郭瑞杰,骆璐,刘风珍,万勇善,张昆[1]（2018）在《花生转录因子ABI4基因克隆及其响应盐胁迫的功能研究》一文中研究指出花生是世界范围内重要油料和经济作物之一,挖掘花生耐盐基因是花生耐盐分子育种工作的关键。转录因子ABI4(abscisic acid-insensitive 4)在调控与逆境诱导相关基因的表达、参与植物对盐胁迫的响应及适应过程中发挥关键作用。本研究以花生栽培品种丰花2号为材料,采用同源克隆的方法得到分别位于A、B染色体组的2个花生ABI4基因(AhABI4)的cDNA序列。位于A染色体组的AhABI4-a基因cDNA全长1753bp,其中CDS区长度为1 092bp,编码一条363个氨基酸的肽链;位于B染色体组的AhABI4-b基因cDNA全长1 807bp,CDS区长1 074bp,编码一条357个氨基酸的肽链。序列比对分析发现,这两个AhABI4基因都携带经典的ABI4motif。经表达分析检测,AhABI4基因在花生萌发种子、幼苗根、茎、叶中均表达;在花生幼苗期植株主根、侧根和功能叶中均受盐胁迫诱导表达上调。通过VIGS技术诱导丰花2号AhABI4基因沉默,沉默效率最高可达59%。对AhABI4基因沉默植株进行盐胁迫处理,发现沉默植株萎蔫、失绿程度轻于野生型,复水后沉默植株存活率显着高于野生型;经对主茎高、根冠比等生理指标的统计发现,沉默植株的耐盐系数显着高于野生型,耐盐系数增幅约为20%。以上研究结果表明,AhABI4负调控花生幼苗期对盐胁迫的耐受性。(本文来源于《中国作物学会油料作物专业委员会第八次会员代表大会暨学术年会综述与摘要集》期刊2018-11-19）
王冕[2]（2018）在《花生应答果腐病病原菌侵染的转录组和miRNAs研究及抗性相关基因克隆》一文中研究指出花生果腐病是花生生产上的一种主要病害,对花生的产量和品质构成了严重的威胁。近年来此病在我国北方产区有连年加重之势。目前对花生果腐病的研究主要集中于对已知病原菌的分类和鉴定上,对于近几年果腐病多发的山东莱西地区的致病真菌的分离与鉴定却少有报道,有关花生响应果腐病的机理研究也鲜有报道。本研究以花生果腐病根际土壤和感病花生为材料,利用454 FLX+测序技术分离了莱西地区果腐病病原真菌;以感病前后的花生籽仁为样品,利用转录组和miRNA测序技术构建了花生响应果腐病相关基因和miRNA的表达变化图谱,并且筛选了关键基因AhMAKK4进行基因克隆和抗性分析等研究。通过这些研究,可以有目的性的分离病原真菌,克隆花生响应果腐病过程的关键基因及miRNA,为利用基因工程改良花生抗病性提供病原材料和理论基础。本研究取得主要结果如下:(1)利用454 FLX+测序技术分离了莱西地区花生果腐病土壤中的病原真菌。测序得到真菌ITS序列46,723条,注释得到1,706个OTUs(Operational Taxonomic Units),其中对照样品OTUs共计1206个,果腐病样品中OTUs共计974个,对照样品和果腐病样品中共有的OTUs数量是474个。真菌OTUs可以分类到6个门,24个纲,272个属。分类到种的水平上,物种丰度最高的真菌是Fusarium sp.OreYA。RDA(Redundancy analysis)分析发现花生品种、环境因子和病原真菌之间存在密切的相关性。这些分析表明,花生感染果腐病之后土壤真菌数量下降,而且其结构变化趋势受到土壤环境因子和花生品种的共同影响,且在莱西地区果腐病病原真菌以镰孢菌为主。从花生果腐病土壤中分离出4种未知真菌,从感病花生上分离到1种镰孢菌。花生幼苗和离体组织接种该镰孢菌发现,幼苗活体和离体组织均被其侵染并发病,这表明该镰孢菌可能是花生果腐病的致病真菌。(2)利用转录组测序得到花生响应果腐病相关的基因表达变化图谱。转录组测序共计得到Unigene 60,756个,其中差异表达基因共计14,482个,表达量上调的基因10,147,下调的基因4,334个。qRT-PCR检测了21个基因的表达变化趋势,其结果和转录组测序结果一致。GO富集分析差异表达基因被分类到24种细胞组分,5种分子功能和23种生物过程中。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析发现有4,291个差异基因被注释到34条代谢通路中,其中70个差异表达基因参与多种植物激素信号转导途径,50个差异表达基因参与植物-病原菌互作途径,17个差异表达基因参与MAPK信号转导途径。这些分析表明在花生响应果腐病过程中存在大量差异表达基因,推测其抗病过程是多基因共同作用的结果。(3)筛选得到花生响应果腐病相关的激素信号转导途径和关键基因。在水杨酸介导的抗病途径中,2个NPR1基因在果腐病样品中表达量下调;5个TGA基因在果腐病样品中表达量下调,而PR基因在两样品中表达量没有明显变化。在茉莉酸介导的抗病途径中,2个JAR1基因在对照样品中表达量上调,而JAZ在果腐病样品中表达量下调。在乙烯介导的抗病途径中,1个ETR基因在对照样品中表达量上调,而2个EIN3和1个EBF1-2基因在对照样品中表达量下调。这说明果腐病病原菌入侵花生时,可能是茉莉酸的含量上升降解了JAZ促使下游的转录因子EIN3和EBF1-2等的表达起始转录。在生长素介导的信号途径中,3个GH3基因在果腐病样品中表达量上调,6个IAA基因在对照样品中表达量上调。这说明花生响应果腐病与内源激素变化有很大关系,通过分析关键基因的表达变化图谱,推测花生可能通过JA/ET介导的抗病途径来抵抗果腐病病原菌的侵染。(4)利用小RNA测序分析得到花生响应果腐病过程中miRNAs的表达变化图谱。miRNA测序共获得了334个miRNAs,其中有97个miRNAs在果腐病胁迫后表达量下调,27个miRNAs在果腐病胁迫后表达量上调。qRT-PCR检测了15条miRNA的表达趋势,绝大多数的miRNA表达趋势与sRNA测序结果一致,这表明miRNA测序结果的准确性较高。对mi RNAs做靶基因预测,有303个miRNAs预测到1,998个靶基因和2,646个靶标位点。119个差异表达miRNA预测到152个靶基因。这说明,在花生响应果腐病的过程中产生不同的miRNA,其表达趋势也不同,而且同一个miRNA可以靶标多个基因,可能存在多个靶标位点。(5)转录组和miRNA测序的关联分析。结果发现受10个miRNA所调控的14个基因在转录组测序结果中均可以检测到。同时还检测到4个miRNA和其靶基因间存在负调控关系。这说明miRNA通过负调控靶基因参与花生响应果腐病的分子调控过程。(6)筛选出抗病关键基因AhMKK4,进行基因克隆和表达分析研究。克隆得到AhMKK4基因,其序列全长1,434bp,含有3'非编码区151bp,5'非编码区317bp,开放阅读框全长966bp,编码一条含有322个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为36.74kDa,属于MAPKK基因家族D组成员。亚细胞定位显示AhMKK4基因定位于细胞质和细胞核中。qRT-PCR分析发现该基因在根中表达量高于其他组织,具有组织表达特异性,受JA诱导时表达量上调,受SA诱导时表达量下调。这结果推测该基因可能在花生根中参与到JA介导的抗病过程。(7)花生AhMKK4基因的转基因功能研究。将AhMKK4构建在正义植物表达载体上,转入拟南芥,经筛选验证后,获得AhMKK4超表达转基因拟南芥。继代培养转基因拟南芥到T_2,进行非生物胁迫下的抗性分析。获得转基因拟南芥,在非生物胁迫下的抗性分析发现,转基因植株不具备盐、渗透等抗性,在ABA、JA、IAA胁迫条件下,根生长受到抑制。这将为下一步花生中基因功能验证提供理论基础。(本文来源于《山东农业大学》期刊2018-05-10）
张欣[3]（2018）在《花生过氧化值、酸值和芥酸含量近红外分析模型构建及FAE1基因克隆》一文中研究指出花生作为全世界广泛栽植的油料及经济作物,不仅具有较高的经济价值,还对人体有很多有益作用。提高花生及其成品的品质、延长货架期是花生产业技术研究的重要课题。降低不利健康的芥酸、过氧化物等物质的含量具有重要意义。鉴于花生油是我国居民的主要食用油,检测花生油过氧化值和酸值攸关人体健康,故本研究通过近红外扫描,构建了花生油过氧化值和酸值近红外模型;同时本研究利用近红外光谱分析仪对自然风干花生种子进行光谱扫描,而后对花生种子芥酸含量进行化学法测定,构建了能够预测花生自然风干种子芥酸含量近红外模型;并成功克隆到栽培种花生两个亚基因组的FAE1基因。本研究主要结果如下:(1)花生油过氧化值和酸值近红外分析模型构建。采集32份花生油近红外光谱,并按标准方法进行过氧化值和酸值测定。经优化,过氧化值的最佳光谱预处理方法为“一阶导数+矢量归一化”,过氧化值谱区范围为7506~6094.3 cm-1,维数为6,模型的决定系数(R2)为91.93,根均方差(RMSECV)为1.23;酸值最佳光谱预处理方法为“矢量归一化”,酸值谱区范围为7506~6094.3 cm-1,维数为7,模型的决定系数(R2)为93.88,RMSECV为0.074。为快速测定花生油过氧化值和酸值,保证食用油质量安全,以及通过评价各种措施的效果进而延长货架期奠定了基础。(2)花生自然风干种子芥酸含量近红外分析模型构建。采集67份自然风干花生种子近红外光谱,并进行芥酸含量色谱测定。采用交叉检验,构建了多粒自然风干花生种子样品芥酸含量的近红外定量分析模型。经优化,最佳光谱预处理方法为“消除常量偏移法”,芥酸含量谱区范围为11980.2~4242.8 cm-1(厘米波数),维数为10,模型的决定系数(R2)为80.08,根均方差(RMSECV)为0.0238。构建的模型为花生脂肪酸遗传改良提供了快速的选择手段,可用于花生油原料的质量控制。(3)栽培种花生FAE1基因的克隆和序列分析。查找获取二倍体野生种A.duranensis和A.ipaensis的FAE1编码区序列,经引物设计、PCR扩增及克隆测序,从栽培种花生的两个亚基因组中分别克隆到2个FAE1基因,分别命名为FAE1-A和FAE1-B。FAE1只有一个开放阅读框,无内含子,完整编码区长1536 bp,编码511个氨基酸。利用相关软件或在线工具进行了FAE1同源序列查找、氨基酸序列分析、蛋白质功能预测和系统发育分析。为花生低芥酸分子育种提供了便利。(本文来源于《河南农业大学》期刊2018-05-01）
吴琪,曹广英,唐月异,王秀贞,孙全喜[4]（2018）在《花生NADH脱氢酶1亚基10B-like基因克隆表达分析及载体构建》一文中研究指出NADH脱氢酶是线粒体氧化呼吸链上重要的复合物,对线粒体功能有至关重要的作用。本研究以花生品种"日花1号"为材料,利用RACE方法成功得到NADH脱氢酶1亚基10B-like基因(ND1-10B-like)的c DNA和DNA全长。基因开放阅读框为321 bp,编码106个氨基酸组成的肽链,预测的蛋白质分子量为12 570.29 Da,等电点为6.97。DNA序列包含一个内含子和两个外显子,共1 269 bp。检测了基因组织表达和胁迫表达情况,结果显示该基因在叶片中表达量最高,在青枯菌胁迫条件下0.5 h表达量即可升高到初始值的5.7倍,对生物胁迫反应非常迅速。并进一步构建了基因过表达载体p CAMBIA2300-OE-ND1和反义表达载体p CAMBIA2300-IN-ND1,并为进一步研究花生中该基因的功能及其在花生抗青枯病中的作用提供帮助。(本文来源于《分子植物育种》期刊2018年07期）
张欣悦,李佳婷,邹婷,黄婉茹,莫爱琼[5]（2018）在《花生响应干旱胁迫的FERONIA类受体蛋白激酶基因克隆与表达分析》一文中研究指出FERONIA(FER)类受体蛋白激酶是CrRLK1L(Catharanthus roseus RLK1-like)激酶亚家族成员,在植物受精、细胞伸长、顶端生长以及非生物胁迫响应等方面起重要作用。本研究克隆了两个花生(Arachis hypogaea)FER类受体蛋白激酶基因AhFER1和AhFER2,它们的完整编码序列(CDS)和相应基因组DNA序列完全一致,说明AhFER1和AhFER2基因编码区均无内含子,分别包括2 655和2 640 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白分别含885和880个氨基酸,分子量分别为99.58和98.96 kDa,等电点分别为6.5和6.22。生物信息学分析发现,AhFER1及AhFER2的氨基酸序列与其他植物FER蛋白均具有较高同源性,都包含malectin-like和蛋白激酶催化域两个保守结构域。AhFER1和AhFER2基因在花生幼苗的叶、茎和根中的表达水平有差异:AhFER1基因在叶中表达量最高,其次是根,茎中表达量最低;而AhFER2基因则在茎中表达量最高,其次是叶,表达量最低是根。干旱胁迫对花生茎和根中AhFER1基因的表达以及花生叶、茎和根中AhFER2基因的表达均无影响,但干旱胁迫显着增强花生叶中AhFER1基因的表达,说明AhFER1基因可能在花生叶响应干旱胁迫时起重要作用。(本文来源于《植物生理学报》期刊2018年02期）
吴琪,曹广英,唐月异,王秀贞,孙全喜[6]（2017）在《花生CAX相互作用蛋白4(CXIP4)基因克隆表达分析及载体构建》一文中研究指出钙离子是细胞信号传导中重要的第二信使。CAX interacting protein(CXIP)是一类能够激活Cation exchanger(CAX)的钙离子转运活性蛋白,在离子转运体系中起重要作用。本研究利用RACE方法获得花生CAX相互作用蛋白4(CXIP4)基因的cDNA和DNA全长序列。该基因cDNA序列的全长包括966bp的开放阅读框,编码321个氨基酸。DNA全长为966bp,不含有内含子序列。推测的蛋白质分子量为36706.24Da,等电点为9.62。使用荧光定量技术(qRT-PCR)分析了该基因在花生品种日花1号植株中的组织表达和青枯菌胁迫条件下的表达变化规律,并构建了该基因的过表达载体、反义表达载体以及原核表达载体,为进一步研究花生中该基因的功能及其在花生抗青枯病中的作用奠定基础。(本文来源于《花生学报》期刊2017年04期）
隋鹏飞,王麒然,王琰,王志葵,张茹琴[7]（2018）在《花生HyPGIP基因克隆及抗叶腐病表达分析》一文中研究指出本文采用基因克隆和生物信息学方法研究了花生Hy PGIP基因及编码蛋白的基本性质和生物学功能,并通过测定接种叶腐病菌后花生植株内PG酶的活性变化和PGIP蛋白的生成量变化,以及Hy PGIP基因瞬时表达分析,探讨了PGIP蛋白与寄主抗病性关系。结果表明,受叶腐病菌侵染的花生植株中,抗病品种的PG酶活性都明显低于感病品种,而生成的PGIP蛋白量都比感病品种显着多,暗示PGIP蛋白与花生叶腐病抗性有关。经基因克隆和测序获得HyPGIP基因全长序列为1 029 bp,编码342个氨基酸,无内含子,终止密码子为TGA,与已报道的五个花生PGIP序列的同源性都很高;结构预测发现该序列存在8个LRR结构域,存在信号肽,疏水性较强,定位于细胞壁上;RT-PCR显示,经接种叶腐病菌处理后,花生植株中的PGIP基因表达量明显增加。(本文来源于《植物病理学报》期刊2018年03期）
张建成[8]（2016）在《花生ERF转录因子基因克隆及其在非生物胁迫下的功能研究》一文中研究指出低温、干旱及高盐等非生物胁迫严重影响植物生长发育和产量。植物在遭受非生物胁迫后会产生一系列生理生化反应,建立一个系统的防御体系,这一适应过程中许多胁迫响应基因的表达受到调控。转录因子通过调控下游基因的表达,在植物非生物胁迫的基因表达调控中发挥作用。目前已证明参与植物非生物胁迫调控的转录因子包括WRKY、NAC、AP2/ERF及MYB等家族。AP2/ERF家族是植物在环境胁迫响应中重要的转录调控因子,该家族至少具有一个AP2/ERF结构域,该家族许多基因的表达受非生物胁迫的诱导。转基因研究表明,许多AP2/ERF基因在植物中过量表达能够提高转基因植株对非生物胁迫的抗性。花生是我国重要的油料作物和经济作物。低温、干旱和盐胁迫严重影响其生长发育和产量形成。目前为止,尚缺乏对花生非生物胁迫分子调控机理的深入研究。本文从花生cDNA文库中筛选并克隆到6个AP2/ERF家族基因,对这6个基因进行序列分析、组织表达模式分析、非生物胁迫下表达分析等,在此基础上构建AhERF6基因的超表达载体,并分别转化拟南芥和花生,通过对转基因植株抗性分析研究了该基因在植物非生物胁迫调控中的功能。本研究取得以下结果:1、目的基因筛选、克隆、序列分析及系统进化分析(1)利用BioEdit软件从花生cDNA文库中筛选到40个与拟南芥AtCBF1/ DREB1B(UU77378)和AtCBF3/DREB1A (AF074602)氨基酸序列中AP2/ERF结构域相似度较高的序列,表明这些序列可能编码AP2/ERF家族蛋白。(2)以“花育19号”花生品种为实验材料,通过RACE和RT-PCR克隆到6个ERF家族转录因子基因。氨基酸序列分析表明,这6个基因编码的蛋白均只包含一个单一的AP2/ERF保守结构域,属于ERF家族,将这6个基因分别命名为AhERF1、AhERF2、AhERF3、AhERF4、AhERF5和AhERF6。(3)在NCBI网站上通过Blast软件分析发现,花生中这6个ERF蛋白氨基酸序列与豆科植物的AP2/ ERF转录因子氨基酸序列具有较高的同源性,尤其是AP2/ ERF保守结构域中的序列,与拟南芥和豆科植物的DREB/CBF蛋白同源性均达到60%以上。(4)根据6个ERF家族转录因子和拟南芥ERF家族部分成员AP2/ERF保守结构域的氨基酸序列绘制了系统进化树,结果表明,AhERF2、AhERF3、AhERF5和AhERF6属于DREB/CBF亚家族,AhERF1和AhERF4属于ERF亚家族。2、6个ERF转录因子基因表达模式分析(1)通过荧光定量PCR分析了这6个ERF家族转录因子基因在花生叶片、根、茎、子叶、下胚轴和花中的表达,结果表明6个基因在花生各个组织中均有表达,但表达水平有所不同。(2)对6个基因在非生物胁迫下在花生中的表达模式进行分析,结果表明AhERF4和AhERF6在非生物胁迫下表达量快速明显的提高,AhERF1和AhERF5的表达在某些胁迫条件下只受到轻微的诱导。还有一些基因在某些胁迫下表达量有所降低:如盐胁迫花生叶片中AhERF3的表达和干旱胁迫叶片中AhERF2的表达。AhERF3和AhERF5在干旱胁迫的根和叶片中则表现出相反的表达模式。以上结果说明不同基因在花生非生物胁迫调控中可能具有不同的功能。3、AhERF6在植物非生物胁迫中的功能及分子调控机理研究(1)对AhERF6编码蛋白特性进行研究。半乳糖苷酶活性实验表明,AhERF6蛋白在酵母中具有转录激活活性;亚细胞定位分析表明,AhERF6定位于烟草叶片细胞的细胞核中,以上均符合转录因子特征。(2)将pCAMBIA1301-AhERF6超表达载体转入拟南芥中,发现转基因植株对低温和盐胁迫抗性明显增强。(3)拟南芥低温胁迫下的分子机理研究表明,逆境调控网络中关键基因RD29A、COR15A和KIN1在转基因拟南芥植株中表达量高于野生型中的表达量,拟南芥内源基因DREB1A/CBF3的表达量在转基因拟南芥植株和野生型中则没有明显差异。判断AhERF6增强转基因植株对非生物胁迫的抗性可能是通过激活DREB/CBF信号途径下游基因的表达实现的。(本文来源于《山东农业大学》期刊2016-11-30）
曹广英,吴琪,唐月异,王秀贞,孙全喜[9]（2016）在《花生核糖体蛋白L29-1(RPL29-1)基因克隆表达分析及载体构建》一文中研究指出核糖体蛋白是核糖体的主要组成成分,在细胞内蛋白质生物合成过程中具有重要作用。RPL29-1是核糖体大亚基60S的一个组件。本研究以花生品种日花1号为材料,利用RACE方法成功得到RPL29-1基因的c DNA序列,并获得DNA序列。RPL29-1基因c DNA序列包括186 bp的开放阅读框,编码61个氨基酸。RPL29-1基因DNA序列含有两个外显子和一个内含子。一级结构分析表明,RPL29-1蛋白质分子量为7 127.02 Da,等电点为10.29。本研究采用荧光定量技术(q RT-PCR)分析了RPL29-1基因在花生品种日花1号植株中的组织表达和青枯菌胁迫条件下的表达变化规律,并构建了RPL29-1的过表达载体和反义表达载体,为进一步通过功能分析研究花生RPL29-1基因在抗青枯病中的作用奠定基础。(本文来源于《分子植物育种》期刊2016年07期）
张青云,孙全喜,唐月异,王秀贞,吴琪[10]（2016）在《花生AhCDPK32基因克隆及表达载体的构建》一文中研究指出利用RT-PCR方法,从花生品种"汕油21"成熟种子中克隆了钙依赖蛋白激酶(camcium-dependent protein kinase,CDPK)基因Ah CDPK32,该序列包含1 617 bp开放阅读框,共编码538个氨基酸。核苷酸序列在NCBI中进行Blast比较,结果显示与大豆Gm CDPK32(Gen Bank登录号为XM_003554131)基因同源性为87%。生物信息学分析结果,预测蛋白质分子量为60.807 k D,蛋白质等电点(PI)为6.96,蛋白质信号肽分析和疏水性分析,表明信号肽剪切可能性小,蛋白质具亲水性。我们构建了该基因超表达载体p CambiaAh CDPK32,为进一步研究该基因的功能提供了理论基础。这是第一次在花生中克隆到CDPK基因的报道。(本文来源于《分子植物育种》期刊2016年05期）
花生基因克隆论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
花生果腐病是花生生产上的一种主要病害,对花生的产量和品质构成了严重的威胁。近年来此病在我国北方产区有连年加重之势。目前对花生果腐病的研究主要集中于对已知病原菌的分类和鉴定上,对于近几年果腐病多发的山东莱西地区的致病真菌的分离与鉴定却少有报道,有关花生响应果腐病的机理研究也鲜有报道。本研究以花生果腐病根际土壤和感病花生为材料,利用454 FLX+测序技术分离了莱西地区果腐病病原真菌;以感病前后的花生籽仁为样品,利用转录组和miRNA测序技术构建了花生响应果腐病相关基因和miRNA的表达变化图谱,并且筛选了关键基因AhMAKK4进行基因克隆和抗性分析等研究。通过这些研究,可以有目的性的分离病原真菌,克隆花生响应果腐病过程的关键基因及miRNA,为利用基因工程改良花生抗病性提供病原材料和理论基础。本研究取得主要结果如下:(1)利用454 FLX+测序技术分离了莱西地区花生果腐病土壤中的病原真菌。测序得到真菌ITS序列46,723条,注释得到1,706个OTUs(Operational Taxonomic Units),其中对照样品OTUs共计1206个,果腐病样品中OTUs共计974个,对照样品和果腐病样品中共有的OTUs数量是474个。真菌OTUs可以分类到6个门,24个纲,272个属。分类到种的水平上,物种丰度最高的真菌是Fusarium sp.OreYA。RDA(Redundancy analysis)分析发现花生品种、环境因子和病原真菌之间存在密切的相关性。这些分析表明,花生感染果腐病之后土壤真菌数量下降,而且其结构变化趋势受到土壤环境因子和花生品种的共同影响,且在莱西地区果腐病病原真菌以镰孢菌为主。从花生果腐病土壤中分离出4种未知真菌,从感病花生上分离到1种镰孢菌。花生幼苗和离体组织接种该镰孢菌发现,幼苗活体和离体组织均被其侵染并发病,这表明该镰孢菌可能是花生果腐病的致病真菌。(2)利用转录组测序得到花生响应果腐病相关的基因表达变化图谱。转录组测序共计得到Unigene 60,756个,其中差异表达基因共计14,482个,表达量上调的基因10,147,下调的基因4,334个。qRT-PCR检测了21个基因的表达变化趋势,其结果和转录组测序结果一致。GO富集分析差异表达基因被分类到24种细胞组分,5种分子功能和23种生物过程中。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析发现有4,291个差异基因被注释到34条代谢通路中,其中70个差异表达基因参与多种植物激素信号转导途径,50个差异表达基因参与植物-病原菌互作途径,17个差异表达基因参与MAPK信号转导途径。这些分析表明在花生响应果腐病过程中存在大量差异表达基因,推测其抗病过程是多基因共同作用的结果。(3)筛选得到花生响应果腐病相关的激素信号转导途径和关键基因。在水杨酸介导的抗病途径中,2个NPR1基因在果腐病样品中表达量下调;5个TGA基因在果腐病样品中表达量下调,而PR基因在两样品中表达量没有明显变化。在茉莉酸介导的抗病途径中,2个JAR1基因在对照样品中表达量上调,而JAZ在果腐病样品中表达量下调。在乙烯介导的抗病途径中,1个ETR基因在对照样品中表达量上调,而2个EIN3和1个EBF1-2基因在对照样品中表达量下调。这说明果腐病病原菌入侵花生时,可能是茉莉酸的含量上升降解了JAZ促使下游的转录因子EIN3和EBF1-2等的表达起始转录。在生长素介导的信号途径中,3个GH3基因在果腐病样品中表达量上调,6个IAA基因在对照样品中表达量上调。这说明花生响应果腐病与内源激素变化有很大关系,通过分析关键基因的表达变化图谱,推测花生可能通过JA/ET介导的抗病途径来抵抗果腐病病原菌的侵染。(4)利用小RNA测序分析得到花生响应果腐病过程中miRNAs的表达变化图谱。miRNA测序共获得了334个miRNAs,其中有97个miRNAs在果腐病胁迫后表达量下调,27个miRNAs在果腐病胁迫后表达量上调。qRT-PCR检测了15条miRNA的表达趋势,绝大多数的miRNA表达趋势与sRNA测序结果一致,这表明miRNA测序结果的准确性较高。对mi RNAs做靶基因预测,有303个miRNAs预测到1,998个靶基因和2,646个靶标位点。119个差异表达miRNA预测到152个靶基因。这说明,在花生响应果腐病的过程中产生不同的miRNA,其表达趋势也不同,而且同一个miRNA可以靶标多个基因,可能存在多个靶标位点。(5)转录组和miRNA测序的关联分析。结果发现受10个miRNA所调控的14个基因在转录组测序结果中均可以检测到。同时还检测到4个miRNA和其靶基因间存在负调控关系。这说明miRNA通过负调控靶基因参与花生响应果腐病的分子调控过程。(6)筛选出抗病关键基因AhMKK4,进行基因克隆和表达分析研究。克隆得到AhMKK4基因,其序列全长1,434bp,含有3'非编码区151bp,5'非编码区317bp,开放阅读框全长966bp,编码一条含有322个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为36.74kDa,属于MAPKK基因家族D组成员。亚细胞定位显示AhMKK4基因定位于细胞质和细胞核中。qRT-PCR分析发现该基因在根中表达量高于其他组织,具有组织表达特异性,受JA诱导时表达量上调,受SA诱导时表达量下调。这结果推测该基因可能在花生根中参与到JA介导的抗病过程。(7)花生AhMKK4基因的转基因功能研究。将AhMKK4构建在正义植物表达载体上,转入拟南芥,经筛选验证后,获得AhMKK4超表达转基因拟南芥。继代培养转基因拟南芥到T_2,进行非生物胁迫下的抗性分析。获得转基因拟南芥,在非生物胁迫下的抗性分析发现,转基因植株不具备盐、渗透等抗性,在ABA、JA、IAA胁迫条件下,根生长受到抑制。这将为下一步花生中基因功能验证提供理论基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
花生基因克隆论文参考文献
[1].郭瑞杰,骆璐,刘风珍,万勇善,张昆.花生转录因子ABI4基因克隆及其响应盐胁迫的功能研究[C].中国作物学会油料作物专业委员会第八次会员代表大会暨学术年会综述与摘要集.2018
[2].王冕.花生应答果腐病病原菌侵染的转录组和miRNAs研究及抗性相关基因克隆[D].山东农业大学.2018
[3].张欣.花生过氧化值、酸值和芥酸含量近红外分析模型构建及FAE1基因克隆[D].河南农业大学.2018
[4].吴琪,曹广英,唐月异,王秀贞,孙全喜.花生NADH脱氢酶1亚基10B-like基因克隆表达分析及载体构建[J].分子植物育种.2018
[5].张欣悦,李佳婷,邹婷,黄婉茹,莫爱琼.花生响应干旱胁迫的FERONIA类受体蛋白激酶基因克隆与表达分析[J].植物生理学报.2018
[6].吴琪,曹广英,唐月异,王秀贞,孙全喜.花生CAX相互作用蛋白4(CXIP4)基因克隆表达分析及载体构建[J].花生学报.2017
[7].隋鹏飞,王麒然,王琰,王志葵,张茹琴.花生HyPGIP基因克隆及抗叶腐病表达分析[J].植物病理学报.2018
[8].张建成.花生ERF转录因子基因克隆及其在非生物胁迫下的功能研究[D].山东农业大学.2016
[9].曹广英,吴琪,唐月异,王秀贞,孙全喜.花生核糖体蛋白L29-1(RPL29-1)基因克隆表达分析及载体构建[J].分子植物育种.2016
[10].张青云,孙全喜,唐月异,王秀贞,吴琪.花生AhCDPK32基因克隆及表达载体的构建[J].分子植物育种.2016