朱伯金南通大学附属海安医院呼吸科江苏南通２２６６００作者简介:朱伯金,男,１９７９．０５－,江苏海安人,硕士学位,主治医师,研究方向:呼吸内科学.
【摘要】目的探讨非小细胞肺癌中SIRT６蛋白表达情况.方法搜集２０１１年０５月至２０１３年１０月在本院手术治疗、术后病理诊断为Ⅰ~Ⅲ期NSCLC患者３８例为研究组,其中腺癌２０例,鳞癌１８例,其中１６例患者癌旁正常肺组织作对照组.应用SIRT６免疫荧光检测研究组NSCLC组织以及对照组正常肺组织中SIRT６蛋白阳性情况,并行组间比较.结果正常肺组织可见到较多的SIRT６阳性细胞,而NSCLC组织中SIRT６表达阴性,组间比较差异有统计学意义(P＜０．０５).结论NSCLC癌组织中几乎不表达SIRT６,SIRT６基因表达缺失可能有助于NSCLC的临床诊断.【关键词】非小细胞肺癌;SIRT６;【中图分类号】R７３４．２【文献标识码】B【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０１３５－０２
肺癌是恶性肿瘤,在世界范围内都具有较高的病死率[１].SIRT６是重要的抑癌蛋白,在肿瘤的发生发展过程中起到重要作用.SIRT６在肺癌中的表达情况目前国内外鲜见报道.本研究应用SIRT６免疫荧光检测其在非小细胞肺癌(non－small－cell－lung－cancer,NSCLC)组织中的表达情况,以期为临床诊断NSCLC寻找新的生物标志物.
１资料与方法
１．１一般资料选取２０１１年０５月至２０１４年１２月之间,在本院胸外科行手术治疗且术后病理诊断明确,皆为Ⅰ~Ⅲ期NSCLC患者３８例为研究对象,３８例癌组织为研究组,其中１６例患者癌旁正常肺组织作对照组.其中男性２２例,女性１６例,年龄３５~７６岁,平均年龄为５９．１２±９．４３岁,腺癌２０例,鳞癌１８例.TNM分期:Ⅰ期８例、Ⅱ期１４例、Ⅲ期１６例.组织常规１０％中性福尔马林液固定、石蜡包埋以及４μm切片、二甲苯脱蜡、酒精梯度脱水,部分切片HE染色用于组织学观察,确定分化级别,余下切片行SIRT６免疫荧光染色.
１．２SIRT６免疫荧光染色取各组切片,阴干后用PBS缓冲液漂洗３遍后,放入含有封闭液中封闭２h,再放入４℃冰箱中过夜后,每张切片,分别滴加１:１００稀释的兔抗SIRT６多克隆抗体１００μl,３６℃湿盒孵育４h,用PBS漂洗３遍后,每张切片滴加１:１０００稀释的AlexaFluor?５６８标记的山羊抗兔二抗１００μl,室温避光孵育２h,用PBS清洗３遍,加入１:２０００稀释的Hoechst室温避光孵育０．５h,PBS清洗后用甘油磷酸缓冲液封片,镜下观察.另取切片用作免疫荧光的阴性对照实验,用０．０１mol/LPBS替代一抗,其余步骤同上,结果为阴性.在不知临床资料的情况下,由２位病理科医生读免疫荧光片,计算SIRT６阳性细胞数,按阳性细胞所占百分数分为:阳性细胞率≤５％为阴性(一);６％~２５％为弱阳性(＋);２６％~５０％为阳性(＋＋);＞５０％为强阳性(＋＋＋).１．３统计学处理用SPSS２１．０统计学软件对所取得的数据进行分析,计量资料用Mean±SD表示,采用独立t检验进行组间比较,以P＜０．０５认为差异有统计学意义.２结果对照组正常肺组织中可见到大量的SIRT６阳性细胞,位于细胞核中,阳性细胞百分比为６９．６９±３．８８％,为强阳性,研究组腺癌、鳞癌癌组织中几乎未见SIRT６阳性细胞,阳性细胞百分比分别为１．８９±０．１３％、１．６８±０．１１％,为阴性,与对照组比较,差异有统计学意义(P＝０．０００,P＝０．０００).研究组腺癌、鳞癌癌组织SIRT６阳性细胞数百分比之间差异无统计学意义(P＝０．９６７)(图１).
３讨论
SIRT６属于Sirtuin(SIRTS)家族成员之一,SIRTS不但具有组蛋白去乙酰基酶活性还具有单核糖基转移酶的活性,广泛存在于生物体.肿瘤细胞具有增殖不可控、基因组不稳定以及通过无氧呼吸提供能量等重要的特征,而随着对SIRT６研究的深入,诸多学者研究发现,SIRT６参与了维持基因组稳定、调控炎症反应以及调节糖和脂类代谢,这说明SIRT６很可能一种抑癌基因,参与了肿瘤的发生发展过程[２－３].Sebastian等[１０]将MEF细胞敲除SIRT６基因后,MEF细胞会转化为肿瘤细胞,SIRT６表达下降会导致肿瘤的发生.Sebastian等在进一步的研究中观察到,MEF细胞发生癌变的机制与抑癌基因的失活或其它已知癌基因激活无关,而可能是由于SIRT６缺乏,从而引起的糖代谢变化所致的.图１SIRT６阳性细胞检测.正常肺组织可见到大量的SIRT６阳性细胞(红),SIRT６蛋白主要表达于细胞核内,研究组腺癌、鳞癌癌组织中几乎未见SIRT６阳性细胞.Bar＝１００mm.?P＜０．０５vs．对照组正常肺组织.本研究应用免疫荧光检测正常肺组织、研究组腺癌、鳞癌癌组织SIRT６表达情况.对照组正常肺组织中可见到大量的SIRT６阳性细胞,位于细胞核中,为强阳性,研究组腺癌、鳞癌癌组织中几乎未见SIRT６阳性细胞,为阴性,与对照组比较差异有统计学意义.结果表明,一旦发生NSCLC,癌细胞中已经不表达SIRT６蛋白.这与Sebastian等[１０]应用疫组化分析肠癌和胰腺癌临床病理切片发现SIRT６表达明显降低结果一致.总之,SIRT６在非小细胞肺癌发生发展中的机制如何,仍有待于进一步的研究.本研究结果显示,NSCLC癌组织中几乎不表达SIRT６,SIRT６基因表达缺失可能有助于NSCLC的确诊.参考文献[１]黄美金,吴雪铭,王春芳等．AEG－l基因在非小细胞肺癌中的表达及其意义．重庆医学,２０１４,４３(５):５４５－５５０．[２]NorthBJ,VerdinE．Sirtuins:Sir２－relatedNAD－dependentproteindeacetylases[J]．Genomebiology,２００４,５(５):２２４．[３]RichonVM,O＇BrienJP．Histonedeacetylaseinhibitors:anewclassofpotentialtherapeuticagentsforcancertreatment[J]．ClinicalcancerreＧsearch:anofficialjournaloftheAmericanAssociationforCancerReＧsearch,２００２,８(３):６６２－４．[４]SebastianC,ZwaansBM,SilbermanDM,etal．ThehistonedeacetylaseSIRT６isatumorsuppressorthatcontrolscancermetabolism．Cell,２０１２,１５１:１１８５－１１９９．