导读:本文包含了基因克隆与载体构建论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:脂肪酸代谢,微效基因,miRNA
基因克隆与载体构建论文文献综述
常涛,程潜,张振乾[1]（2019）在《脂肪酸合成相关miRNA的靶基因克隆及载体构建》一文中研究指出【研究背景】油酸合成受一个主效基因脂肪酸去饱和酶2 (FAD2)和多个微效基因影响,但目前的研究多集中于FAD2,对相关微效基因的研究仍然欠缺。miRNA测序灵敏度高,精度高,既能鉴定已知的miRNA,又能预测新的miRNA及其对应靶基因,在拟南芥、水稻、小麦等众多作物的不同组织、器官中均有应用。油菜中,已发现一些miRNA及其靶基因参与油菜生长发育过程,其中与脂肪酸代谢相关的mi R394、mi R838、mi R159等以及一些新预测的miRNA,同其靶基因相互作用,共同调控油菜脂肪酸代谢过程。可通过miRNA的靶基因克隆以深入脂肪酸合成的相关研究,以期为高油酸油菜分子育种提供参考资料。【材料与方法】供试材料为高油酸油菜近等基因系,由湖南农业大学油料所提供。实验菌株为大肠杆菌感受态DH5α,购自于北京擎科生物公司。实验载体为pCambia1300-35S-N1,购于上海康颜生物公司。试验方法包括:RNA的提取和检测、c DNA第一链的合成、PCR扩增、靶基因扩增、PCR产物回收、过表达载体构建、干扰载体的构建。【结果与分析】XbaI及BamHI双酶切pCambia1300-RNAi载体以及各个基因的RNAi片段的PCR产物,胶回收,进行连接,获得重组质粒。测序正确后,PstI和SalI双酶切重组质粒及各个基因的RNAi片段的PCR产物,再次进行连接,转化,获得最终的RNAi载体。以高油酸油菜20-35天自交种为材料,c DNA为模板,高保真扩增了这6个靶基因,其中bna-miR156b>c>g的4个靶基因长度分别为1122bp(949),1119bp(124)1119bp(829),1125bp(135),bna-miR396的2个靶基因114和148均为1350bp,目的条带符合预期。以合成的c DNA为模板,分别对6个靶基因特异片段进行PCR高保真扩增,均得到了目的片段长度大小的DNA片段。最终得到AT基因的两个拷贝114与148过表达重组质粒。OPR基因的124与829拷贝见,949与135拷贝。该工作对甘蓝型油菜的基因组进化规律进行揭示,从根本上促进了甘蓝型油菜的育种研究。本试验直接通过拟南芥与油菜基因共线性分析,在甘蓝型数据库进行检索,使试验设计更具有目的性与准确性,从而分别获得AT基因位于A基因组和C基因组的两个拷贝114与148,和OPR基因在A基因组和C基因组的各两个拷贝。且对6个基因分别构建了过表达载体与RNAi干扰载体,为下一步试验提供基础。【结论】基因克隆分别扩增到bna-miR396靶基因AT的两个拷贝114与148,两个拷贝全长均为1350bp。bna-miR156b>c>g靶基因OPR的4个拷贝,长度分别为1122bp(949),1119bp(124)1119bp(829),1125bp(135),的114和148均为1350bp,目的条带符合预期。成功构建了这6个基因的过表达载体pCambia1300-35S-X和RNAi干扰载体pCambia1300-RNAi-X,并绘制了相关图谱。(本文来源于《2019年中国作物学会学术年会论文摘要集》期刊2019-10-27）
俸云,赵鑫,许洁,余庆,沈朋雷[2]（2019）在《水牛KDM4D基因克隆分析及其真核表达载体的构建》一文中研究指出旨在克隆水牛组蛋白去甲基化酶KDM4D (lysine K-specific demethylase 4D)基因,对其进行生物信息学分析,并构建KDM4D基因的真核表达载体,为研究KDM4D基因在水牛体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎发育中的作用奠定基础。试验从水牛睾丸组织中提取总RNA,反转录cDNA后, RT-PCR技术克隆KDM4D基因片段,并运用生物信息学软件对序列进行分析;随后将KDM4D基因片段连接至真核表达载体pEGFP-C1,再把重组质粒转染进HEK293T细胞。结果表明,克隆所得的水牛KDM4D基因片段编码区全长1 155 bp,共编码384个氨基酸。水牛KDM4D基因与黄牛、山羊、绵羊、犬、猫、猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别为98.4%,96.6%,96.3%,84.9%,84.1%,81.4%,80.4%,77.4%,77.3%。多重比较和进化树分析结果显示,KDM4D基因在不同物种及生物进化中具有较高的保守性。蛋白结构域分析显示,克隆所得的KDM4D蛋白结构特殊,只具有1个JmjN (Jumonji N)和1个JmjC (jumonji C)结构域,与KDM4家族其他成员相比缺少PHD (plant homeodomain)和Tud (tudor)功能域。KDM4D蛋白质叁级结构预测结果显示,水牛、黄牛和人3种物种间具有较高的相似性。转染结果显示,构建的重组质粒可以在HEK293T细胞中表达。本试验成功克隆水牛KDM4D基因,对其进行生物信息学分析,构建了真核表达载体pEGFP-C1-KDM4D,并在HEK293T细胞中成功表达。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2019年10期）
雷娜娜,叶浩盈,赵靖悦,龚林,胡荣飞[3]（2019）在《叁角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因克隆、过表达载体构建及生物信息学分析》一文中研究指出通过RT-PCR的方法克隆叁角褐指藻的△5-脂肪酸延长酶基因的cDNA序列,利用双酶切技术构建重组表达载体,并对该基因进行相关的生物信息学分析。结果表明:叁角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因的cDNA全长为834 bp,编码278个氨基酸,预测的等电点为9.13,理论分子量32 348.91。△5-脂肪酸延长酶基因中存在1个内含子,该酶属于ELO系列延长酶,可能定位于内质网中,包含多个跨膜区域和保守区域。亲缘关系分析表明,叁角褐指藻△5-脂肪酸延长酶与假微型海链藻的亲缘关系最近。试验还成功构建了叁角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因过表达重组质粒pPha-T1-5e,为下一步叁角褐指藻中相关油脂代谢基因的表达和功能验证奠定基础。(本文来源于《福建农业科技》期刊2019年09期）
吕阳,曹阳,高一,刘理想,薛佳佳[4]（2019）在《草原红牛AIDA基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体的构建》一文中研究指出本研究旨在对草原红牛AIDA基因进行克隆、生物信息学分析和差异表达研究,并构建真核表达载体,以期在细胞水平上探究AIDA基因对牛前体脂肪细胞分化的影响。应用RT-PCR方法从草原红牛脂肪组织中扩增AIDA基因编码区,测序鉴定后对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR技术研究AIDA基因在草原红牛9个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肠、肌肉、脂肪)和前体脂肪细胞成脂分化过程中的表达规律;构建真核表达载体pBI-CMV3-AIDA,转染草原红牛前体脂肪细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测AIDA基因在mRNA水平上的表达情况。结果显示,AIDA基因编码区全长921 bp,编码306个氨基酸,含有4个潜在的糖基化位点和29个潜在的磷酸化位点;亚细胞定位主要分布于细胞质、细胞核和线粒体上。AIDA基因在草原红牛9个组织中均有表达,其中在肾脏组织中表达量最高,显着高于其他组织(P<0.05)。成脂分化结果表明,AIDA基因mRNA表达量在分化的第2天达到最高,随着脂肪细胞的成熟,其表达量逐渐降低;双酶切及测序结果表明,试验成功构建了AIDA基因的真核表达载体pBI-CMV3-AIDA,且过表达组AIDA基因mRNA表达量极显着高于对照组(P<0.01)。本试验成功构建了AIDA基因真核表达载体,并在草原红牛前体脂肪细胞中高度表达,该结果为体外研究牛AIDA基因对脂肪合成代谢及其机体代谢的调节机制提供了基础材料。(本文来源于《中国畜牧兽医》期刊2019年08期）
张超,付叁雄,周小婴,唐容,黄莎[5]（2019）在《甘蓝型油菜GPDH基因克隆、表达分析及植物过表达载体构建》一文中研究指出【目的】克隆甘蓝型油菜的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)基因(BnGPDH),分析其表达特性并构建植物过表达载体,为研究该基因在油菜种子叁酰甘油(TAG)合成和积累中的作用机制提供理论参考。【方法】以甘蓝型油菜H105为材料,采用同源克隆技术克隆与At3G07690同源的BnGPDH基因,对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BnGPDH基因在甘蓝型油菜不同组织[根、茎、叶、蕾、花及花后(DAF)7、14、21、30和40 d角果皮和种子]及高、低油含量自交系角果皮和种子中的表达情况,并将克隆获得的BnGPDH基因连接至携带napin启动子的pCAMBIA1390-NAPIN载体上构建植物过表达载体。【结果】克隆获得的BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因编码区(CDS)长度均为1338 bp,编码445个氨基酸,其编码蛋白仅有5个氨基酸差异,均具有NAD_Gly3P_dh_N和NAD_Gly3P_dh_C结构域,定位于细胞质,分别与白菜细胞质型GPDH蛋白(XP_009147040.1)和甘蓝细胞质型GPDH蛋白(XP_013585317.1)的氨基酸序列具有较高相似度,对应的相似度为100.00%和99.78%,且二者与双子叶植物GPDH蛋白亲缘关系较近,与单子叶植物GPDH蛋白亲缘关系较远。BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在甘蓝型油菜不同组织中均有表达,且表达模式总体上相似,在21DAF和30DAF种子中的表达量显着高于其他组织部位(P<0.05,下同),表明21DAF和30DAF是油菜种子TAG合成和积累的高峰期,但在角果生长发育不同时期这2个基因的表达略有不同,且在茎、蕾、种子(7DAF、21DAF、30DAF和40DAF)和角果皮(7DAF和40DAF)中,BnGPDHc2-1基因的表达量均显着高于BnGPDHc2-2基因,而在14DAF角果皮中BnGPDHc2-2基因的表达量显着高于BnGPDHc2-1基因。21DAF种子中BnGPDHc2-1基因在3个高油含量自交系中的表达量显着高于3个低油含量自交系,BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系IL130和IL594中的表达量显着高于3个低油含量自交系;在30DAF种子中,BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2在3个高油含量自交系中的表达量均显着高于3个低油含量自交系。将BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因分别连接至携带napin启动子的pCAMBIA1390-NAPIN载体上可成功构建获得植物过表达载体。【结论】BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在甘蓝型油菜不同发育期角果中行使的功能存在一定分化,在进化过程中可能分别来源于白菜基因组和甘蓝基因组,但均在甘蓝型油菜种子TAG合成和积累发挥重要调控作用。因此,构建的植物过表达载体可用于BnGPDH基因功能分析及油菜种子油含量基因工程改良研究。(本文来源于《南方农业学报》期刊2019年07期）
付亚娟,侯荟玲,乔洁,耿晓进,王聪艳[6]（2019）在《大花杓兰钙依赖蛋白激酶基因克隆及植物表达载体构建》一文中研究指出RT-PCR结合RACE技术,克隆到1个全长2079 bp的大花杓兰钙依赖蛋白激酶基因CmCDPK,cDNA为1491 bp,编码496个氨基酸。CmCDPK是1个具有CDPKs典型的Ser/Thr蛋白激酶保守结构域、含1个跨膜结构域、无信号肽、稳定的亲水性蛋白。CmCDPK二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲构成。相对于其他植物CDPKs,CmCDPK与小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛的亲缘关系更近。通过DNA重组技术将CmCDPK片段克隆到pBI121质粒上。PCR、酶切及DNA测序的结果表明,重组质粒pBI-CmCDPK包含1个1491 bp的CmCDPK片段,且核苷酸序列及插入方向完全正确。本研究首次克隆了大花杓兰CmCDPK基因,并成功构建了植物过表达载体pBI-CmCDPK,为CmCDPK基因在烟草中实现遗传转化和功能研究奠定基础。(本文来源于《植物遗传资源学报》期刊2019年06期）
奉玲丽,张瑞门,黄叶,夏攀洁,张名媛[7]（2019）在《广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建》一文中研究指出本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。(本文来源于《中国畜牧兽医》期刊2019年04期）
路宏朝,李蕊清,孙志阳,王令,张涛[8]（2019）在《略阳乌鸡METTL21C基因克隆及超表达载体构建》一文中研究指出旨在克隆略阳乌鸡 METTL21C基因,构建其超表达载体。采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测 METTL21C基因在略阳乌鸡7种组织中的表达,通过PCR扩增技术克隆 METTL21C基因完整的CDS区序列,分析其核苷酸序列及不同物种序列进化关系,将 METTL21C基因片段连接至pCD513B载体,构建其超表达载体并转染至293T细胞。结果显示: METTL21C基因在略阳乌鸡心肌中表达量最高,骨骼肌次之;克隆获得略阳乌鸡 METTL21C基因完整编码区序列,共747 bp,编码249个氨基酸残基,与原鸡的相应序列具有很高的同源性;构建的 METTL21C超表达载体能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后续 METTL21C基因功能探索的研究。(本文来源于《西北农业学报》期刊2019年03期）
李恺馨[9]（2019）在《羟胺氧化酶基因克隆载体构建及生物信息学分析》一文中研究指出工业污水的氮元素积累导致水体的富营养化是污水处理过程中的重要挑战。而节能环保的生物脱氮技术作为一种新型的脱氮方法受到大量关注和应用。在生物脱氮过程中,羟胺氧化酶作为反应的关键酶起着承上启下的作用。本文通过对欧洲亚硝化单胞菌体内的羟胺氧化酶进行生物信息学分析,根据其基因序列设计引物并构建重组载体进行全长克隆,为研究者实验进行羟胺氧化酶蛋白表达及脱氮反应机理研究提供帮助。(本文来源于《当代化工研究》期刊2019年02期）
孙少慧,张静华,杨帅,高云飞,闵凡祥[10]（2019）在《马铃薯晚疫病菌RxLR效应因子RD24基因克隆及其PVX表达载体构建与鉴定》一文中研究指出马铃薯晚疫病病原菌致病疫霉菌(Phytophthora infestans)在侵入寄主细胞的同时分泌效应因子(Effector),该类蛋白在晚疫病致病过程中发挥着关键作用,是抑制植物免疫的重要因素。PITG_RD24是马铃薯晚疫病菌位于细胞核核的一个重要效应因子。为了快速鉴定效应因子RD24在马铃薯中瞬时表达的状况及抗性情况,构建效应子RD24的PVX表达载体是十分必要的。本研究利用PCR、酶切、分子克隆等生物学技术,将RD24片段连接插入至PVX (pGR106)载体中,然后用热击法将连接产物转化至大肠杆菌DH10B感受态细胞中。通过PCR筛选、质粒提取、测序比对,结果表明成功获得含有目的表达载体pGR106·RD24的质粒,可为下一步筛选马铃薯广谱抗病基因研究提供必备载体。(本文来源于《中国农学通报》期刊2019年05期）
基因克隆与载体构建论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
旨在克隆水牛组蛋白去甲基化酶KDM4D (lysine K-specific demethylase 4D)基因,对其进行生物信息学分析,并构建KDM4D基因的真核表达载体,为研究KDM4D基因在水牛体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎发育中的作用奠定基础。试验从水牛睾丸组织中提取总RNA,反转录cDNA后, RT-PCR技术克隆KDM4D基因片段,并运用生物信息学软件对序列进行分析;随后将KDM4D基因片段连接至真核表达载体pEGFP-C1,再把重组质粒转染进HEK293T细胞。结果表明,克隆所得的水牛KDM4D基因片段编码区全长1 155 bp,共编码384个氨基酸。水牛KDM4D基因与黄牛、山羊、绵羊、犬、猫、猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别为98.4%,96.6%,96.3%,84.9%,84.1%,81.4%,80.4%,77.4%,77.3%。多重比较和进化树分析结果显示,KDM4D基因在不同物种及生物进化中具有较高的保守性。蛋白结构域分析显示,克隆所得的KDM4D蛋白结构特殊,只具有1个JmjN (Jumonji N)和1个JmjC (jumonji C)结构域,与KDM4家族其他成员相比缺少PHD (plant homeodomain)和Tud (tudor)功能域。KDM4D蛋白质叁级结构预测结果显示,水牛、黄牛和人3种物种间具有较高的相似性。转染结果显示,构建的重组质粒可以在HEK293T细胞中表达。本试验成功克隆水牛KDM4D基因,对其进行生物信息学分析,构建了真核表达载体pEGFP-C1-KDM4D,并在HEK293T细胞中成功表达。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
基因克隆与载体构建论文参考文献
[1].常涛,程潜,张振乾.脂肪酸合成相关miRNA的靶基因克隆及载体构建[C].2019年中国作物学会学术年会论文摘要集.2019
[2].俸云,赵鑫,许洁,余庆,沈朋雷.水牛KDM4D基因克隆分析及其真核表达载体的构建[J].中国兽医学报.2019
[3].雷娜娜,叶浩盈,赵靖悦,龚林,胡荣飞.叁角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因克隆、过表达载体构建及生物信息学分析[J].福建农业科技.2019
[4].吕阳,曹阳,高一,刘理想,薛佳佳.草原红牛AIDA基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体的构建[J].中国畜牧兽医.2019
[5].张超,付叁雄,周小婴,唐容,黄莎.甘蓝型油菜GPDH基因克隆、表达分析及植物过表达载体构建[J].南方农业学报.2019
[6].付亚娟,侯荟玲,乔洁,耿晓进,王聪艳.大花杓兰钙依赖蛋白激酶基因克隆及植物表达载体构建[J].植物遗传资源学报.2019
[7].奉玲丽,张瑞门,黄叶,夏攀洁,张名媛.广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建[J].中国畜牧兽医.2019
[8].路宏朝,李蕊清,孙志阳,王令,张涛.略阳乌鸡METTL21C基因克隆及超表达载体构建[J].西北农业学报.2019
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[10].孙少慧,张静华,杨帅,高云飞,闵凡祥.马铃薯晚疫病菌RxLR效应因子RD24基因克隆及其PVX表达载体构建与鉴定[J].中国农学通报.2019