导读:本文包含了人孤雌胚胎干细胞论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:孤雌胚胎干细胞,印迹基因,基因编辑,四倍体补偿
人孤雌胚胎干细胞论文文献综述
李旭,彭柯力,张金鑫,高倩,张文豪[1]（2019）在《印迹基因修饰使孤雌胚胎干细胞获得四倍体补偿能力》一文中研究指出孤雌胚胎干细胞(Parthenogenetic embryonic stem cells,pESCs)的遗传物质全部来源于母源基因组,因缺失父源基因而不具备四倍体补偿的能力。为了使pESCs也具备发育到个体的能力,呈现与受精卵来源ESCs类似的多能性,文中借助CRISPR/Cas9系统对孤雌来源的pESCs中的2个重要母源印迹基因的差异甲基化区域(Differentially methylated region,DMR)进行单等位基因敲除(H19-DMR,IG-DMR),获得双基因敲除的(DKO)pESCs。结果表明,pESCs虽然来源于母源基因组,但是其形态特征、多能干性标记分子的表达水平、体外神经分化能力与受精卵来源的ESCs基本一致。最后,通过基因修饰的DKOpESCs可以通过四倍体补偿获得发育到期的胎儿,表明经过印迹基因修饰的pESCs也具有发育到一个完整个体的多能性。从而为再生医学研究提供了一类具有主要组织相容性复合基因匹配且多能性良好的资源细胞。(本文来源于《生物工程学报》期刊2019年05期）
刘佳[2]（2018）在《小鼠新型二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立》一文中研究指出子代基因组可以来源于父本及母本双方,或者其中一方(即孤雄或孤雌),后者的遗传方式在自然界中尤为罕见,但却为我们探索生物的隐性遗传特征提供了极为重要的资源。本研究主要在小鼠二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立及新型多能性干细胞系的诱导两个方面进行了探讨。首先,我们采用化学成分明确的培养液来培养小鼠二倍体孤雌囊胚,培养液成分包括:基础培养基N2B27、激活素A(ActivinA)、成纤维细胞生长因子(b FGF)以及血清替代物(KSR),这种建系方法可以高效率的获得小鼠孤雌胚胎来源的上胚层干细胞(parthenogenetic epiblast like stem cell,下文称之为Pa-AFSCs),该细胞系的形态特征及部分鉴定结果如下:1.克隆形态以及碱性磷酸酶染色结果显示,Pa-AFSCs与上胚层干细胞(Epiblast stem cells,EpiSCs)相似。2.免疫荧光染色结果显示:Pa-AFSCs表达Nanog的细胞明显少于对照组胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs),而其表达Gata6的细胞明显多于完全阴性的ESCs,H3K27me3的结果显示几乎全部Pa-AFSCs细胞皆表现为一条X染色体处于失活的状态。3.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)结果显示:Pa-AFSCs的Oct4,Nanog,Gata4,Gata6和Eomes的转录水平与EpiSCs相差无几,但滋胚层标志基因Elf5和细胞周期相关基因cMyc的转录水平明显高于EpiSCs。4.畸胎瘤及嵌合体实验结果:畸胎瘤的实验结果显示未观察到明显畸胎瘤形成。实验获得1枚6.5天嵌合原肠胚,胚胎嵌合率4.2%,嵌合部位胚外外胚层(extraembryonic ectoderm,EXE)。5.生长曲线结果显示,来源于ICR小鼠的Pa-AFSCs生长速度明显高于来源于129小鼠的Pa-AFSCs。随后,我们进一步将得到的Pa-AFSCs置于包含ActivinA、骨形态发生蛋白BMP4、CHIR99021、白血病抑制因子LIF(即ABCL培养体系)的培养液中进行诱导培养,得到新型小鼠多能性干细胞系,命名为:Ja-ASCs。其克隆形态以及碱性磷酸酶染色结果与对照组ESCs相比,无明显差别,可稳定传代至40代以上。免疫荧光染色结果显示:与对照组Pa-AFSCs相比,失活的X染色体重新活化。RT-qPCR实验结果显示:比较于Pa-AFSCs,Oct4,Nanog和Klf4的表达上调,Gata4和中胚层标志基因Sox17的转录下调。另外我们发现Cdx2的转录水平明显高于对照组Pa-AFSCs。嵌合体结果显示Ja-ASCs不具备贡献着床后胚胎的能力。综上所述,本实验由小鼠孤雌激活的囊胚建立了两种新型的细胞系:Pa-AFSCs和Ja-ASCs。从形态特征以及干细胞的某些特征来看,Pa-AFSCs接近于EpiSCs,而Ja-ASCs更类似于ESCs。然而Pa-AFSCs无法形成畸胎瘤,Ja-ASCs也无法贡献于着床后的嵌合体胚胎中,具体分子机制还有待进一步研究。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2018-06-01）
肖笑枭[3]（2018）在《黄芪注射液对人孤雌胚胎干细胞向肝样细胞分化的影响》一文中研究指出背景和目的:慢加急性肝功能衰竭(Acute-on-chronic liver failure,ACLF)是临床上一种非常危重的疾病,死亡率极高。目前临床仍缺乏理想的治疗措施。干细胞移植治疗ACLF成为现今一个新的研究方向。与人胚胎干细胞相比,人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESCs)同样具有强大的分化能力,还具备避免伦理学争议和移植免疫排斥方面的优势。药理研究表明,黄芪对实验性肝炎有保护作用,并可通过多环节避免肝细胞变性坏死、调节免疫及促进肝细胞再生。本研究拟探讨黄芪注射液对hPESCs向肝细胞分化的影响。方法:1)建立h PESCs/3T3体外培养体系,通过形态学观察和碱性磷酸酶法检测hPESCs能否稳定生长并保持未分化状态。2)分别使用化学诱导剂和黄芪注射液加化学诱导剂诱导hPESCs向肝细胞分化。通过检测Sox17、Gsc甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、白蛋白(albumin,ALB)CK18与Hepa等指标的表达来判断诱导细胞是否具有肝细胞功能。结果:1)hPESCs在hPESCs/3T3培养体系中生长状态良好,经过超过30代的体外培养之后,仍能保持生物学特性。2)黄芪加化学诱导组和化学诱导组hPESCs经诱导后细胞形态与人肝细胞较为相似。3)Sox17、Gsc、AFP和ALB在化学诱导组和黄芪加化学诱导组的表达均显着高于其在第0d的表达量。化学诱导组各指标表达量均高于黄芪加化学诱导组。4)CK18与Hepa蛋白在两个实验组均呈阳性表达。5)两个实验组上清液中AFP、ALB和BUN的含量均显着高于对照组;化学诱导组的含量均高于黄芪加化学诱导组。结论:1)hPESCs/3T3培养体系可有效扩增h PESCs并维持其未分化状态。2)两个实验组均可成功诱导hPESCs分化为具有一定功能的肝样细胞。3)黄芪注射液对hPESCs分化为肝样细胞具有一定的抑制作用。(本文来源于《云南中医学院》期刊2018-04-01）
余朝阳,韩宝生[4]（2016）在《孤雌胚胎干细胞在细胞疗法中的优势与局限性》一文中研究指出孤雌胚胎干细胞(p ESCs)是建立患者特异性多能干细胞的有效途径,因具有类似胚胎干细胞(ESCs)自我复制和多潜能特性,成为再生医学的"种子细胞"。杂合型p ESCs有望用于自体移植,纯合型p ESCs理论上可用于异体基因疗法,却因自然杀伤(NK)细胞识别而产生免疫排斥反应。本文旨在综述孤雌生殖的表观遗传特性,总结p ESCs在细胞疗法中的优势和局限性,阐述克服免疫排斥反应的新策略。(本文来源于《生殖与避孕》期刊2016年08期）
许春丽[5]（2016）在《小鼠父系遗传背景对孤雌胚胎干细胞特性的影响》一文中研究指出遗传背景影响动物的胚胎发育和出生后动物发育状态。动物卵母细胞孤雌激活后在体外培养可发育为囊胚,囊胚在ES细胞培养条件下生长、传代可分离孤雌胚胎干细胞(parthenogenetic embryonic stem cells, pESCs)。遗传背景影响孤雌胚胎发育和pESCs的分离效率。已有研究表明遗传背景可影响小鼠pESCs的获得效率,但父系遗传背景能否影响pESCs多能性和线粒体基因表达等特性还未知,本文立足于父系遗传背景这一因素,通过对pESCs多能性和线粒体基因表达的检测,探讨其对pESCs特性的影响,同时作为后续深入研究的参照数据。(1)本实验以父系(129/Sv、C3H)和母系(KM)小鼠来源的pESCs (KM×129/Sv FI和KM×C3H FI)为研究对象,J1 ESCs为对照,通过从形态学观察,PCR、qPCR测定多能性相关标志基因表达情况,免疫荧光检测干细胞标志蛋白的表达,细胞体外拟胚体形成及分化能力,检测实验组和对照组细胞特性的差异。结果显示：Ji ESCs和两株pESCs均保持全能性,但某些多能性基因的表达水平有显着差异：Oct-4在KM×C3HFI pESCs中表达水平显着高于J1ESCs (p<0.05),而Sox2、H19、IGF2、KIF4、C-myc表达水平极显着高于J1ESCs (p<0.01); 在KM×129/SvFIpESCS中, Sox2、Nanog的表达水平显着高于J1ESCs(p<0.05),C-myc表达水平极显着高于J1ESCs(p<0.01);另夕KM～C3HF1 pESCs形成的EBs直径显着小于J1ESCs(p<0.05), KM×129/Sv FI pESCs形成的EBs直径极显着小于J1ESCs(p<0.01)。综上所述,来源于129和C3H父系遗传背景的pESCs多能性标志基因的表达水平明显高于J1ESC,证明父系遗传背景影响pESCs多能性基因的表达。(2)检测两株pESCs以及J1ESCs增殖能力,并通过qPCR检测线粒体基因Pnpt1、 Cox2、tim23、tom40、12sRNA和CytoC的表达情况。结果显示：第2-5天KM×129/Sv FI pESCs增值速度显着低于J1ESCs (p<0.05),但在第6天细胞增殖速度显着加快(p<0.05)；第1、3、6天KM×C3H FI pESCs增殖能力显着低于J1ESCs (p<0.05),在第4天和第5天差异极显着(p<0.01); tim23在KM×C3H FI pESCs中表达水平显着低于J1ESCS (p<0.05):Tom40 在KM×129/Sv FI pESCs中表达水平显着高于JiESCs(p<0.05)。 CytoC表达水平极显着低于J1 ESCs (p<0.01),12sRNA表达水平极显着高于J1 ESCs(p<0.01)。结果证明父系遗传背景影响pESCs细胞活力和线粒体基因表达。(本文来源于《西北大学》期刊2016-06-30）
徐国旗[6]（2016）在《猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎干细胞的分离培养初探》一文中研究指出本试验以从屠宰场采集废弃的猪卵巢为研究材料,对卵母细胞体外成熟培养体系以及孤雌囊胚胚胎干细胞的分离培养进行了探究。首先以亮甲酚蓝染色对成熟培养前的卵母细胞进行筛选,并通过添加db-cAMP来达到核质的同步成熟,进而提高卵母细胞的体外成熟质量;随后以孤雌激活后得到的囊胚为材料,从胚龄、饲养层以及内细胞团的分离几个方面对孤雌胚胎干细胞的分离培养进行了探究。试验主要结果如下:1.以13、26、39、52μmol/L的亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)对成熟培养前的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)染色90 min,比较不同浓度的BCB对卵母细胞的着色率、成熟率以及孤雌激活胚胎和核移植胚胎的早期发育情况。分析结果显示,BCB浓度为26μmol/L时,经染色的COCs既有较高的着色率,而又不影响其体外成熟的效率。挑选BCB+组卵母细胞进行孤雌激活和核移植试验,其卵裂率和囊胚率均显着高于BCB-组(P<0.05)。胚胎移植试验挑选BCB+组中发育较好的1~2细胞期重组胚对5头代孕母猪进行了移植,其中2头怀孕,1头顺利产下了6头健康胎儿。2.成熟培养液中分别添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-cAMP时,卵母细胞的成熟率随着浓度的增加依次降低,但浓度为1 mmol/L时,孤雌激活后的囊胚率最高(27.03%);卵丘细胞单层与卵母细胞共培养时,其成熟率、卵裂率及囊胚率(86.00%、89.04%、28.36%)也得到了显着提高;0.4 mmol/L的db-cAMP和卵丘细胞单层共培养时,其成熟率和卵裂率(85.78%和88.95%)与对照组差异不显着,但囊胚率(35.14%)显着提高。3.试验研究了囊胚的胚龄、饲养层的种类及囊胚的不同处理对猪孤雌囊胚胚胎干细胞分离培养的影响。实验结果显示:①第8天的囊胚贴壁率(25.00%)显着高于第7天和第9天;②以小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层时贴壁率为18.52%,显着高于猪胎儿成纤维细胞和猪子宫上皮细胞饲养层(P<0.05);③取孤雌激活后第8天的囊胚分成全胚组、孵化囊胚组、去透明带组和分离内细胞团(ICM)组进行体外培养时,分离的ICM贴壁率明显高于其他组(P<0.05)。(本文来源于《青海大学》期刊2016-05-01）
宋司航,张梓卉,廖辰,雷蕾[7]（2015）在《小鼠孤雌胚胎及孤雌胚胎干细胞中印记基因的表达》一文中研究指出小鼠孤雌胚胎体内发育最多不能超过10.5d,发育失败的主要原因是胚外组织发育缺陷和印记基因表达的异常。随着小鼠孤雌二倍体和单倍体胚胎干细胞的建系成功,不仅能作为研究印记基因的理想模型,还能够作为种子细胞应用于细胞治疗,拓宽了小鼠孤雌生殖的研究领域和再生医学应用范围。孤雌胚胎聚合作为一种简便易行的技术手段,能够显着提高孤雌胚胎干细胞的建系效率,还能促使异质胚胎间的印记基因相互补偿从而更加趋近于正常受精的胚胎干细胞。我们在文中主要阐释了小鼠孤雌胚胎、孤雌聚合胚胎、孤雌二倍体胚胎干细胞、孤雌单倍体胚胎、孤雌聚合胚胎干细胞中印记基因的表达。(本文来源于《解剖学报》期刊2015年05期）
宋司航,王振东,单智焱,孙瑞珍,刘春佳[8]（2015）在《多个胚胎聚合对小鼠孤雌胚胎干细胞印记基因表达影响的研究》一文中研究指出小鼠孤雌胚胎干细(PgESCs)能作为种子细胞应用于细胞治疗,避开了伦理和道德的限制,但其建系效率低。课题组前期研究发现,两个8-cell时期小鼠孤雌胚胎聚合后培养至囊胚期分离内细胞团建立孤雌聚合胚胎干细胞(a2PgESCs)的效率显着升高且父源表达的印记基因明显上调。在此基础上,本研究提出增加聚合的胚胎数目并提早聚合的时期可能会(本文来源于《中国解剖学会2015年年会论文文摘汇编》期刊2015-08-08）
单智焱,武玢,张玥,薛媛,吴嫣爽[9]（2015）在《孤雌胚胎干细胞来源的诱导多能干细胞的建立及对印记基因表达的影响》一文中研究指出目的通过诱导多能干细胞(i PSCs)技术重编程孤雌胚胎干细胞,探讨i PSCs技术对孤雌胚胎干细胞的多能性及印记基因的影响。方法从孤雌激活的囊胚中建立了孤雌胚胎干细胞;利用反转录病毒将多能性转录因子转入孤雌胚胎干细胞中,建立孤雌i PS细胞。结果建立的孤雌来源的i PS细胞体内外分化能力与孤雌胚胎干细胞的差别无显着性;Real-time PCR结果显示,孤雌i PS细胞母源印记基因的表达明显高于孤雌胚胎干细胞,父源印记基因表达下降,多能性基因表达升高。结论 i PSCs技术能影响基因的表达,尤其是印记基因,印记使其更接近于正常受精来源的胚胎干细胞中印记基因水平。(本文来源于《解剖学报》期刊2015年04期）
刘韦[10]（2015）在《小鼠孤雌胚胎干细胞向肌腱细胞诱导分化的研究》一文中研究指出肌腱是肌肉两端索状的致密结缔组织,分别附着在两块或两块以上不同的骨上便于肌肉附着和固定,其功能是从肌肉传递力至骨、支持身体移动。由于急性创伤或慢性损伤导致的肌腱损伤是常见疾病,常伴随疼痛及躯体发病从而影响生活。由于肌腱缺乏血管和细胞,所以受伤的肌腱自愈能力极为有限。目前,临床选择治疗肌腱损伤大多为自体移植和异体移植。自体移植会对患者造成二次创伤,而同种异体移植又会有传染病原体及免疫排斥的风险。近年来,组织工程技术显示了对肌腱再生和修复的强大潜力。大量的研究方法使用了多种类型的细胞,支架材料对肌腱进行再生和修复,但直到现在还没有得到临床切实可行的办法。腱细胞(Tenocytes)是肌腱的固有细胞,具有其他种子细胞无法比拟的优势,但是,获得腱细胞会对患者造成二次伤害,而且取得的细胞数量少,体外培养腱细胞短期内就会丢失其表型。真皮成纤维细胞(Dermal fibroblast)可以通过皮肤活检获得而且适合于体外培养,真皮成纤维细胞能够与多数生物材料粘附并增殖,合成丰富的细胞外基质,但真皮成纤维细胞在腱修复的过程中易形成瘢痕,影响肌腱的力学功能,而且受限于患者的年龄。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-derived Stem Cells)可以通过微创获得,体外培养有较强的增殖能力,拥有骨,软骨,脂肪和肌腱分化的潜力。以往的研究结果显示,MSCs可以形成肌腱样组织并改进受伤肌腱的机械性能。但长期体内移植表明,修复的肌腱组织经常发生骨化、损害了肌腱的结构并影响功能。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell)因具有全能性及无限增殖能力而备受学者青睐。欧阳宏伟等建立了胚胎干细胞在体外分化为肌腱细胞、并用于腱再生的方法,其结果表明,胚胎干细胞来源的肌腱细胞通过表达肌腱特异性蛋白,分泌生长因子从而促进腱再生,同时无任何畸胎瘤和骨化发生。然而,使用胚胎干细胞涉及胚胎的破坏,所以一直受到伦理道德的限制。孤雌干细胞(parthenogenetic Embryonic Stem Cells)可通过孤雌囊胚的内细胞团获得,在许多方面具有与ESCs相似的特性。pSCs来源于化学或物理方法激活的卵母细胞,没有破坏受精卵,从而避免了伦理道德方面的限制。在灵长类动物中,孤雌囊胚不能发育为胎儿(遗传缺陷影响胎盘形成),而且HLA单倍型使pSC有较好的组织相容性,可以减少移植后免疫排斥的风险,相比较ESCs具有更大的优越性。pSCs可以分化为视网膜色素上皮样细胞、肌肉样和骨样细胞、神经细胞和肝细胞。据报道pSCs分化的心肌细胞可以明显改善受损的心肌,更重要的是,pSCs来源的心肌细胞在异体移植中表现出免疫耐受,赋予了pSCs广阔的应用前景。实验方法目前已可以将ESCs向肌腱细胞定向诱导,然而迄今为止没有研究利用pSCs向肌腱细胞定向诱导分化。因此本研究以pSCs作为种子细胞,通过拟胚体(EBs)的自主分化、刮取纤维样细胞、接种并扩增；通过流式细胞术、免疫细胞化学鉴定其表型为间充质干细胞(pMSCs),通过体外成骨、成软骨及成脂能力进一步验证。将pMSCs接种于Flexcell弹力板进行力学加载,诱导pMSCs分化为肌腱细胞；将pMSCsi(pMSCs加载力学刺激后)接种于PLGA叁维支架材料,进行异位移植,在体内成功构建了肌腱样组织。新生组织具有天然肌腱的结构特征,表达胶原合成相关因子、肌腱修复相关因子和肌腱细胞表型标志。1.pSCs的体外培养特征及全能性鉴定将C57BL/6小鼠pSCs及129S4/SvJae小鼠ESCs (J1)体外培养并进行全能性鉴定,包括碱性磷酸酶染色,全能性表面抗原SSEA-1和全能性转录因子Oct4、Nanog免疫细胞化学染色,WST-1实验检测细胞增殖活性,实时定量PCR检测与细胞周期相关的印记基因；克隆形成实验鉴定细胞形成克隆的能力,实时定量PCR检测与细胞粘附,迁移相关基因,为其向肌腱细胞定向诱导分化提供理论和实验基础。2. pSCs形成EBs及特征将pSCs接种于低粘附性96孔培养板形成EBs,计算EBs形成的效率。将5天后形成的EBs包埋于石蜡,行H&E及TUNEL染色,观察EB的大体及凋亡特征。3.体内体外分化全能性鉴定EBs形成5天后,将EBs接种于铺有明胶的培养板中,继续培养7天、14天、21天、28天,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,实时定量PCR检测内,中,外胚层相关基因表达。实时定量PCR和免疫细胞化学染色检测pSCs与ESCs自主分化中上皮-间充质转化标志基因。免疫组织化学染色确定EBs分化时,中胚层基因是否表达。皮下注射pSCs和ESCs观察体内畸胎瘤形成。4.获得pSCs来源的间充质干细胞(pMSCs)据上述实时定量PCR结果,在EBs接种于铺有明胶的培养板中7天后,使用细胞刮刮取纤维状细胞团块,自然沉降后接种至新的培养板,体外扩增。流式细胞术及免疫细胞化学检测所得到的细胞系。5.pMSCs向骨,软骨,脂肪诱导分化使用成骨、成软骨及成脂诱导液,将上述得到的细胞向骨、软骨及脂肪细胞定向分化。对pMSCs进行诱导后,在不同的时间点通过细胞形态学观察和实时定量PCR检测骨、软骨及脂肪细胞标志性基因、茜素红、Von Kossa、番红O、油红O染色和免疫组织化学染色对诱导后的细胞进行鉴定。6.机械拉伸诱导pMSCs向肌腱细胞方向分化对pMSCs实施不同时间的机械拉力(频率：0.1Hz;应变力大小：10%形变；拉伸时间：24小时和10天),通过实时定量PCR、Western-blot及免疫组织化学检测肌腱细胞标志基因的变化。C57/BL6小鼠骨髓MSCs和fibroblast作为对照组。7.拉力诱导后的细胞与PLGA的生物可容性将拉力刺激10天后的pMSCs接种叁维支架材料PLGA上,通过DNA提取、激光共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜观察细胞在叁维支架上的生长和细胞外基质分泌情况。8.体内生成组织工程肌腱将上述支架-细胞(CM-Dil标记)复合物接种于裸鼠皮下,分别在6周和12周后取出,通过大体观察、组织学染色、免疫组织化学染色、特殊染色及激光共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜检测新生组织。实验结果通过上述实验方法,我们获得了如下实验结果：1.pSCs具有全能性、克隆形成及增殖能力,随体外传代次数增加全能性保持不变。pSCs碱性磷酸酶染色阳性,SSEA-1、Nonog和OCT4表达强阳性。体外培养时,细胞具有克隆形成的能力,不过较ESCs少。当接种密度为100和250/孔时,pSCs及ESCs形成的克隆分别为14.00 ± 3.08 vs.20.44 ± 4.95 (p= 0.004),38.22 ± 4.43 vs.44.22 ± 4.32 (p= 0.01)。pSCs形成点状克隆,为典型的"holocolony",而ESCs形成点状或环状克隆,随细胞接种密度增加,此现象愈加明显。与pSCs相比,ESCs显着高表达vtn但itgbl表达并无差异。免疫细胞化学结果显示ESCs表达Itgbl及Vtn强烈且均匀的分布的分布于整个细胞克隆。而pSCs中,Itgbl及Vtn只是零星的分布于细胞表面。WST-1实验证明细胞具有增殖能力,但也较ESCs低。igf2r和p57kiP2表达并无差异,igf2在J1细胞明显高表达(3.26±0.4 vs.1.09±0.21,p<0.001).2.pSCs体外悬浮培养均可以有效地形成EBs,但形成EBs的能力比ESCs低(21.7%±3.4%vs.35.3%±5.2%)。TUNEL实验结果显示,EBs形成的过程中ESCs凋亡细胞比率较低(8.79%±2.21%vs.9.28%±3.8%),但差异无显着性。3.将上述EBs接种至包被有明胶的培养板,不同时间点收取样品总RNA。实时定量PCR结果显示伴随EBs自主分化,pSCs和ESCs均具有向内、中、外叁胚层分化的能力,经历上皮-间充质转化,免疫细胞化学结果证明两种细胞均具有向中胚层分化的能力。EBs接种至铺有明胶的培养板,迁移出的细胞具有多种形态,分别有上皮状、纤维状及心肌细胞。畸胎瘤实验证明pSCs在体内也具有向内、中、外叁胚层分化的能力,形成成熟的骨、软骨、肌肉、淋巴管、粘液上皮及神经节。4.使用细胞刮刮取纤维状细胞团块,接种后可以体外扩增,可获得形态较一致纤维状细胞(pMSCs)。流式细胞术检测结果证明pMSCs表达CD29、CD13、CD44、CD73、 CD90.2和CD105。免疫细胞化学证实pMSCs表达中胚层标志物Vimentin, Myog, Myosin heavy chain和α-Actin。与eMSCs的特征基本一致。5.获得的间充质干细胞(pMSCs及eMSCs)均具有向骨,软骨,脂肪分化的能力。实时定量PCR结果显示成骨标志基因alp, ibsp, bglapl, opn和runx2表达明显上调。茜素红和Von Kossa染色阳性,证明pMSCs及eMSCs均具有成骨能力。实时定量PCR显示col2al及aggrecan在pMSCs及eMSCs诱导21天后均出现明显地上调,番红O及免疫细胞化学染色显示COL2al及Aggrecan阳性,证明pMSCs及eMSCs均具有成软骨能力。实时定量PCR显示fabp4及c/ebp在pMSCs及eMSCs诱导28天后均出现明显地上调,油红O染色阳性,表明pMSCs及eMSCs具有成脂肪能力。6.机械拉伸可以诱导pMSCs向肌腱细胞方向分化。细胞持续加载应力24小时或者间隔加力10天(16h/d)均可以使肌腱特异性基因(tnc、collal、col3al、tnmd、eya2、ephap4)表达上调。col1a1:3a1胶原比率上升。加载力学刺激后,细胞排列具有方向性,免疫细胞化学显示Col1a1、Col3a1、Col5a1、Hsp47、TNMD、EYA2、TNC、Bmp2及Bmp13均阳性表达。7.激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察结果显示,PLGA与应力加载后的细胞具有良好的组织相容性。细胞在3D支架可以增殖及分泌细胞外基质。8.异位移植后取出细胞-材料复合物,样本表面光滑,呈半透明状。组织学染色结果表明新生组织细胞排列整齐,且延长轴分布,大体观察显示6周及12周组织Collal, Col3a1, Col5a1, Hsp47, TNMD, EYA2, TNC, Bmp2及Bmp13均阳性表达。移植12周后,新生组织胶原纤维沿长轴密集排列且呈典型的波浪状。激光共聚焦显微镜观察CM-Dil标记阳性,表明新生组织由移植后的细胞构成。结论孤雌胚胎干细胞可以分化为MSC,经定向诱导分化后可分化为肌腱样细胞,用于组织工程肌腱再造。创新点：1,对小鼠pSCs体外悬浮培养是否形成拟胚体、形成拟胚体的效率进行研究,有助于研究pSCs的后续分化。TUNEL染色证实小鼠pSCs在缺少父系基因印记时,也可以发生凋亡。2,通过拟胚体自主分化,证明pSCs与ESCs均表现出上皮-间充质转化。3,通过拟胚体自主分化,得到较纯的小鼠pSCs来源的间充质细胞。4,将pSCs来源的间充质细胞诱导分化为肌腱样细胞,并用于体内肌腱样组织再生。(本文来源于《西北大学》期刊2015-06-30）
人孤雌胚胎干细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
子代基因组可以来源于父本及母本双方,或者其中一方(即孤雄或孤雌),后者的遗传方式在自然界中尤为罕见,但却为我们探索生物的隐性遗传特征提供了极为重要的资源。本研究主要在小鼠二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立及新型多能性干细胞系的诱导两个方面进行了探讨。首先,我们采用化学成分明确的培养液来培养小鼠二倍体孤雌囊胚,培养液成分包括:基础培养基N2B27、激活素A(ActivinA)、成纤维细胞生长因子(b FGF)以及血清替代物(KSR),这种建系方法可以高效率的获得小鼠孤雌胚胎来源的上胚层干细胞(parthenogenetic epiblast like stem cell,下文称之为Pa-AFSCs),该细胞系的形态特征及部分鉴定结果如下:1.克隆形态以及碱性磷酸酶染色结果显示,Pa-AFSCs与上胚层干细胞(Epiblast stem cells,EpiSCs)相似。2.免疫荧光染色结果显示:Pa-AFSCs表达Nanog的细胞明显少于对照组胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs),而其表达Gata6的细胞明显多于完全阴性的ESCs,H3K27me3的结果显示几乎全部Pa-AFSCs细胞皆表现为一条X染色体处于失活的状态。3.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)结果显示:Pa-AFSCs的Oct4,Nanog,Gata4,Gata6和Eomes的转录水平与EpiSCs相差无几,但滋胚层标志基因Elf5和细胞周期相关基因cMyc的转录水平明显高于EpiSCs。4.畸胎瘤及嵌合体实验结果:畸胎瘤的实验结果显示未观察到明显畸胎瘤形成。实验获得1枚6.5天嵌合原肠胚,胚胎嵌合率4.2%,嵌合部位胚外外胚层(extraembryonic ectoderm,EXE)。5.生长曲线结果显示,来源于ICR小鼠的Pa-AFSCs生长速度明显高于来源于129小鼠的Pa-AFSCs。随后,我们进一步将得到的Pa-AFSCs置于包含ActivinA、骨形态发生蛋白BMP4、CHIR99021、白血病抑制因子LIF(即ABCL培养体系)的培养液中进行诱导培养,得到新型小鼠多能性干细胞系,命名为:Ja-ASCs。其克隆形态以及碱性磷酸酶染色结果与对照组ESCs相比,无明显差别,可稳定传代至40代以上。免疫荧光染色结果显示:与对照组Pa-AFSCs相比,失活的X染色体重新活化。RT-qPCR实验结果显示:比较于Pa-AFSCs,Oct4,Nanog和Klf4的表达上调,Gata4和中胚层标志基因Sox17的转录下调。另外我们发现Cdx2的转录水平明显高于对照组Pa-AFSCs。嵌合体结果显示Ja-ASCs不具备贡献着床后胚胎的能力。综上所述,本实验由小鼠孤雌激活的囊胚建立了两种新型的细胞系:Pa-AFSCs和Ja-ASCs。从形态特征以及干细胞的某些特征来看,Pa-AFSCs接近于EpiSCs,而Ja-ASCs更类似于ESCs。然而Pa-AFSCs无法形成畸胎瘤,Ja-ASCs也无法贡献于着床后的嵌合体胚胎中,具体分子机制还有待进一步研究。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
人孤雌胚胎干细胞论文参考文献
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