高锦亢小玉
（徐州医学院221004）
【摘要】目的构建并包装大鼠Six2基因过表达慢病毒及建立稳定过表达Six2基因的MES23.5细胞株。方法采用RT-PCR方法扩增Six2基因片段并将其连接于含有嘌呤霉素抗性的pLV-CS2.0-N-HA载体质粒，采用慢病毒包装四质粒系统（pRRE/pVSVG/pREV/pLV），用转染试剂Lipofectamine2000将四质粒按一定比例转染293T细胞；收集慢病毒上清并感染MES23.5细胞株，嘌呤霉素筛选稳定表达Six2的MES23.5细胞株，Westernblotting检测Six2蛋白的表达。结果限制性内切酶酶切结果表明在900bp处有一明显条带;Six2测序结果显示序列与genebank上的序列完全一致；嘌呤霉素筛选病毒感染的MES23.5细胞，传代筛选第5代后细胞几乎无死亡现象；Westernblotting结果显示，在分子量为23.4kDa处有相应条带。结论成功构建过表达Six2基因的慢病毒表达载体；得到了较高滴度的病毒悬液；建成稳定表达Six2基因的MES23.5细胞株，此研究为进一步探讨Six2基因的功能提供了良好的研究工具。
【关键词】Six2；慢病毒；载体构建；过表达
【中图分类号】R39【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）30-0042-02
前言：
帕金森病（ParkinsonDisease，PD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病。主要的病理特征是中脑黑质多巴胺（Dopamine，DA）能神经细胞的慢性进行性变性死亡。如何保护残存的神经细胞以及阻止受损神经细胞的死亡是当前治疗PD的研究热点之一。
在肾脏发育过程中，转录因子Six2可通过促进胶质细胞系源性神经营养因子（Glialcellline-DerivedNeurotrophicFactor，GDNF）的表达而维持肾脏的正常发育[1，2]。GDNF对DA能神经细胞具有很好的保护作用。已经有大量研究表明外源性给予GDNF能够明显减轻DA能神经细胞的损伤[3，4]。在6-OHDA损伤早期的DA能神经细胞中，Six2是否也能通过促进GDNF的表达而保护受损的DA能神经细胞，至今尚未见相关报道。鉴于此，本研究中我们利用基因工程技术构建了Six2过表达的慢病毒，并筛选出过表达Six2基因的稳定细胞株，为后续研究Six2调控GDNF功能奠定了很好的实验基础。
材料和方法：
1材料与方法
1.1质粒、菌株、细胞株、试剂
目的基因：Six2，876bp，NM_016932.4。载体质粒为pLV-CS2.0-N-HA（抗性：嘌呤＋8821bp），293T细胞株、DH5α感受态，均由厦门大学生科院陈瑞川教授馈赠。RNA提取，试剂盒、反转录试剂盒、小量和中量质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNAMarker、限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ及T4DNALigase均购自NEB公司。
1.2携带Six2的慢病毒载体pLV-N-HA-Six2的构建
收集培养的细胞，Trizol法提取总RNA。
1.3慢病毒pLV-N-HA-Six2的包装
采用含10%FBS的DMEM培养基培养293T细胞，细胞密度生长至50%-60%时用于病毒的转染。
1.4慢病毒pLV-N-HA-Six2生物学滴度测定
因为在包装的病毒中不含发光蛋白，所以在做实验的过程中，在同样的实验条件下，我们同时包装了携带GFP基因的慢病毒pLV-N-GFP，以此慢病毒来测定病毒的滴度，以及验证病毒感染成功与否。
1.5蛋白免疫印迹法(WesternBlotting)
培养的正常和过表达Six2的稳定细胞株处理好之后置于Odyssey仪器扫描观察结果。扫描照片用软件Image·Quant5.0进行分析，以光密度值表示各组的蛋白相对表达量。
1.6慢病毒pLV-N-HA-Six2感染靶细胞后Six2蛋白表达鉴定及稳定细胞株的筛选
用含有终浓度为1.5ug/ml嘌呤霉素的培养基传代筛选能够稳定表达Six2的细胞株，继续传代稳定细胞株，收集细胞westernblotting方法检测Six2蛋白的过表达。
1.7统计分析
统计学分析采用多因素方差分析，P<0.05被认为差异具有显著意义。
2结果
2.1成功构建慢病毒pLV-N-HA-Six2质粒
成功构建慢病毒pLV-N-HA-Six2质粒，测序结果经Blast验证，发现基因克隆完全正确，无点突变和缺失（图1）。
2.2成功包装制备慢病毒pLV-N-HA-Six2
转染24h后细胞内可见绿色荧光表达，48h时细胞绿色荧光表达明显。慢病毒pLV-GFP-Six2的生物学滴度检测为3.0×107TU/ml（图２）。
2.3慢病毒pLV-N-HA-Six2对靶细胞的感染及稳定细胞株的制备
感染72h后，细胞用含有嘌呤霉素的培养基传代培养，传代最初发现细胞死亡比较多，待传代5代以后细胞几乎无死亡现象，表明剩余的细胞均是含有嘌呤抗性的细胞，稳定表达Six2的MES23.5细胞株已经被成功筛选（图4）。
2.4Six2表达量的鉴定
收集培养的稳定表达Six2基因的细胞和对照组的MES23.5细胞，WesternBlotting结果鉴定Six2蛋白的表达量，结果显示过表达细胞株中的Six2表达显著高于对照组细胞中的表达（图5）。
3结论
GDNF维持肾脏的正常发育与保护受损DA能神经细胞一样，均需要RET受体通过PI3K-Akt信号通路来介导[5]。在肾脏发育过程中，Six2可直接结合于GDNF启动子区促进GDNF的表达[1]，在6-OHDA损伤早期的DA能神经细胞，Six2是否也能促进GDNF的表达至今尚未见报道。
为了后续更好地探讨转录因子Six2能否促进内源性GDNF的表达，我们首先构建了携带Six2基因的慢病毒载体质粒，酶切结果显示在900bp和9000bp的条带处分别有两条明显的条带，这一结果表明我们成功将目的基因和慢病毒载体连接在了一起，因为目的基因的片段长度约900bp，载体质粒的片段长度为8821bp。为了进一步验证连接的目的基因是否有点突变或基因的缺失，我们委托上海生工生物工程有限责任公司进行了碱基测序，测序结果进一步证实了构建的碱基序列完全正确。然后将构建好的载体质粒和包装质粒同时转染293T细胞，48h时细胞内荧光显著表达，这一结果表明在293T细胞内，载体质粒和包装质粒进行了整合，形成了完整的病毒，故我们选择在转染48h和64h时收集转染的上清，因为上清中包含已经分泌出的成功包装的病毒颗粒。最后上述病毒上清感染MES23.5细胞，72h时可见荧光显著表达，说明包装的病毒是具有感染能力的病毒，能够很好的感染MES23.5。因为此时细胞的感染效率只有50%左右，而载体质粒本身携带有嘌呤霉素抗性的基因，所以我们利用嘌呤霉素杀灭了没有成功感染病毒的MES23.5细胞。用含有嘌呤霉素的培养基筛选大约第5代之后，细胞几乎无死亡现象，说明剩余的细胞均是含有目的基因的具有嘌呤抗性的细胞。Westernblotting结果进一步显示目的基因Six2在细胞内成功获得了高表达。
参考文献
[1]Brodbeck，S.，B.Besenbeck，andC.Englert，ThetranscriptionfactorSix2activatesexpressionoftheGdnfgeneaswellasitsownpromoter.MechDev，2004.121(10):p.1211-22.
[2]Self，M.，etal.，Six2isrequiredforsuppressionofnephrogenesisandprogenitorrenewalinthedevelopingkidney.EMBOJ，2006.25(21):p.5214-28.
[3]Pascual，A.，etal.，GDNFandprotectionofadultcentralcatecholaminergicneurons.JMolEndocrinol，2011.46(3):p.R83-92.
[4]Wang，M.，etal.，N-cadherinisaNovelERalphaAnchorthatProtectsAgainst6-OHDADamagetoDopaminergicCells.CellMolNeurobiol，2014.34(1):p.123-31.
[5]Moore，M.W.，etal.，RenalandneuronalabnormalitiesinmicelackingGDNF.Nature，1996.382(6586):p.76-9.
基金项目：国家自然科学基金项目（31040035）