导读:本文包含了种源鉴定论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:灯盏花,专用型种质资源,灯盏乙素,相关性分析
种源鉴定论文文献综述
李锐,刘冠泽,卢迎春,杨建文,关德军[1]（2019）在《灯盏花成分专用型种源评价与鉴定》一文中研究指出收集和鉴定了云南省和贵州省共46份灯盏花种质资源,筛选出适合生产不同药品的成分专用型种源,为专用型品种选育提供参考。利用HPLC测定了灯盏花种源10种活性成分含量,相关分析阐明各成分含量间的相关性,聚类分析对种质资源进行分类。结果表明:16份灯盏花种源灯盏乙素(scutellarin, SE)含量在2.5%以上,是培育灯盏花素专用型品种的优良材料,其中4份种源同时含有高含量(>1.0%)的双咖啡酰奎宁酸酯(dicaffeoylquinic acids, diCQAs),是培育灯盏细辛专用型品种的优良材料;同时,筛选出8份总黄酮(total flavonoids, TFs)含量高于3.5%的种源,适合选育总黄酮专用品种。相关性分析表明,SE含量与diCQAs和TFs含量均显着正相关,是灯盏花品质育种的标志性成分。聚类分析将灯盏花种源分为叁大类,除1个种源的SE含量和diCQAs含量接近(第Ⅲ类)外,其他种源SE均占总活性成分的60%以上,其中第Ⅰ类为高TFs型种源,TFs占到总活性成分的80%以上,diCQAs占总成分的15%以下;第Ⅱ类为高diCQAs型种源,diCQAs占总成分的16.9%～28.9%,TFs占到总活性成分的80%以下。该结果表明灯盏花种源活性成分组成存在多种类型,为专用型品种选育提供了可能,灯盏乙素含量可以作为专用型种源筛选的首要指标。(本文来源于《热带作物学报》期刊2019年09期）
王文君[2]（2019）在《物种特异性和保守性DNA序列筛选及其在畜产品种源成分鉴定中的应用》一文中研究指出动物源性成分是一类来源于动物具有种属代表性的物质,可以是核酸、蛋白,也可以是各种脂类和小分子物质等。近年来,各种畜产品的掺假掺杂事件层出不穷,欧洲―马肉风波‖、中国―假羊肉事件‖等肉类掺假事件,饲料中非法添加反刍动物成分引起的疯牛病全球性传播等,这些畜产品安全问题严重影响肉类市场秩序和畜牧业的健康发展。对食品和饲料中动物源性成分的定性、定量检测是解决这一问题的重要技术手段。目前主要的检测方法是基于线粒体DNA(mtDNA)的PCR方法。然而,由于mtDNA在组织和个体间的拷贝数差异和碱基高变异性,使其易出现假阴性检测结果,且难以实现准确的定量,因而迫切需要筛选新的物种特异性的DNA序列。此外,肉类掺假检测中多物种通用内参的缺乏或保守性差等问题也影响畜产品定量检测的准确性。本研究利用动物全基因组序列和转录组信息,通过比较基因组学分析策略分别筛选物种特异性核DNA序列和多物种保守的核DNA序列,建立肉和饲料中多种动物源性成分的定性、定量检测方法。为满足畜产品安全监管部门对动物源性成分鉴别的系统化、多元化、快速化的迫切需求提供技术支撑。取得的主要结果如下:1.物种特异性DNA序列的筛选及其分子特征分析为了获得新的物种特异性DNA序列,本研究基于物种的全外显子序列,以独创的动态E-value结合Identity%、Quary-cover%为筛选条件,通过与Nt数据库、非目标物种基因组和目标物种基因组的3次本地BLASTN序列比对分析,根据物种的分类地位,在11个科的19个物种中筛选各物种特异性外显子。随后,将各物种的特异性外显子分为完全特异的外显子序列(CESS)和部分特异的外显子序列(PESS),并对其进行分布、结构和序列特征的分析发现:物种的特异性外显子占物种总外显子的比例很低,且与染色体的大小无关。其中的CESS主要分布在CDS区,且序列内部含有大量重复元件;长度较短的、高GC含量的外显子更易发生片段的完全缺失或增加,且其形成与序列上下游的同向重复序列以及序列内部的短重复序列有关。进一步利用各物种特异性DNA序列设计引物,并在19个物种中进行PCR检测,验证了序列和引物的物种特异性,实验结果说明筛选的物种特异性DNA序列可作为种源成分检测的靶标。2.基于物种特异性DNA序列建立肉制品及动物源性饲料中种源成分的定性PCR检测方法为了解决种源检测中靶序列单一匮乏、特异性和保守性差等问题,基于筛选获得的物种特异性DNA序列,建立了肉制品中牛、羊、猪、鸡和鸭源性成分的定性PCR检测方法。通过在线BLAST和ClustalW多序列比对分析,将物种特异性DNA序列分别与包含动物、植物和微生物在内的4个界、11个纲、21个目、36个科、47个属的53个代表性物种的参考基因组进行序列比对分析,发现各序列均具有高度的种间特异性和种内保守性。通过物种特异性引物设计并进行反应体系、反应条件优化,建立了5个物种5对引物相同反应程序(退火温度均为60℃)的PCR检测方法,实现了肉中牛、羊、猪、鸡、鸭成分的同时检测。所建立的PCR检测方法在19个物种中进行验证,结果表明5个物种的种源检测PCR方法具有高度的物种特异性,仅在目标物种中具有扩增产物,其他物种中无任何产物;同时利用5个物种的44个个体进行PCR扩增都得到预期的扩增产物,通过对PCR产物进行测序,在同一物种中的序列具有一致性,说明这些物种特异性序列在物种内具有高度的保守性。所建立的PCR检测方法,灵敏度均可达到0.5ng。进一步对牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉的熟肉制品进行检测,得到与产品种源成分一致的检测结果,说明本方法可用于加工肉食中种源成分的检测。针对疯牛病的饲料源性传播问题,筛选了牛科特异性基因TAF4,该基因在牛和羊中存在18bp片段差异,针对该差异片段设计一对牛羊通用引物,但扩增产物大小不同,通过一次PCR反应即可同时检测和鉴别牛(125bp)、羊(107bp)源性成分,并在23个物种中表现出高度的物种特异性。对牛(黄牛、牦牛、瘤牛、水牛)、羊(绵羊、山羊)不同品种进行PCR扩增和测序比对分析,结果表明该序列在牛、羊中都分别具有高度保守性。所建立的PCR检测方法,灵敏度可达到0.2ng DNA。最后,对5份委托制作的动物源性饲料的检测结果说明该方法具有检测饲料样品中牛、羊源性成分的能力,具有重要的应用价值。3.筛选哺乳动物和鸟类中高度保守的单拷贝序列作为多物种通用内参并建立定量检测方法定量检测是对畜产品掺假情况进行准确评估的一个重要方法。而可靠有效的定量内参是解决这一问题的前提。本文从全基因组水平出发,利用11个科的13个哺乳动物和鸟类物种的外显子数据,通过比较基因组学和生物信息学方法筛选了在哺乳动物和鸟类中同源率>95%的高度保守的核DNA序列,并在保守区设计了多物种通用引物。通过在18个动物物种基因组中试验验证发现,该序列具有高度保守性、且为单拷贝序列。基于多物种定量内参,进一步建立和优化了一种种源成分定量检测方法,相对误差(R.E.)和相对标准偏差(R.S.D.)均小于25%。并通过引入基因组当量(GE)和校正系数k的概念,实现了DNA混合样品中牛、兔、狗、狐、貂成分的更加精准的定量检测。为畜产品中种源成分的准确定量提供了可靠的多物种通用的定量内参和检测方法。4.基于多物种通用内参建立肉制品中多种动物源性成分的多重定量检测方法针对欧洲―马肉风波‖问题,结合牛、马的特异性DNA序列和多物种通用内参,建立了牛(223bp)、马(197bp)和动物(129bp)源性成分的叁重定性和定量检测方法;针对我国―假羊肉事件‖,结合羊、狐、鼠的特异性DNA序列和多物种通用内参,建立了羊(237bp)、狐(211bp)、鼠(160bp)源性成分的多重定性和定量检测方法。所有物种特异性序列均与包含动物、植物、微生物在内的53个物种的参考基因组进行BLAST和ClustalW序列比对,并在碱基差异区设计物种特异性引物和探针。利用普通PCR和TaqMan荧光PCR在多个物种DNA中对序列、引物和探针的特异性进行验证,并进而验证了各物种特异性序列均为固定拷贝数的序列。多重PCR体系的建立说明各组引物和探针之间不存在交叉互作,确保了单一体系中多种种源成分的同时检测和定量。保守性试验表明各物种特异性序列和引物在各自目标物种内的高度保守性。灵敏度检测结果表明检出限(LOD)为0.05ng DNA,定量限(LOQ)达5%。并通过构建各物种特异性序列和内参序列的标准曲线,建立了GE与Ct值的计算关系,对多组DNA混合样品和不同质量比的混合肉样品进行多重定量检测,R.E.和R.S.D.均小于25%,表明所建立的多重定量检测方法的具有良好的检测准确度和精确度。本研究利用比较基因组学方法筛选物种特异性核DNA序列用于种源成分检测;筛选保守性核DNA序列作为多物种定量内参。进而建立了肉和饲料中牛、羊、猪、马、鸡、鸭、狐等多种种源成分的定性和定量检测方法,为种源成分检测提供了相应的方法和候选素材,为食品和饲料安全提供重要的技术支撑。(本文来源于《华中农业大学》期刊2019-06-01）
郭亮[3]（2019）在《基于PCR_mtDNA技术在地方鸡种源性成分鉴定方面的研究进展》一文中研究指出综合论述PCR_mtDNA技术在地方鸡种鉴定中的适用性研究,并对其在物种鉴定方面的发展趋势进行讨论,以期为后续建立高效、快速、准确、便捷的检测方法提供理论依据。(本文来源于《畜牧与饲料科学》期刊2019年02期）
高燕,李桂琳,周侯光,罗凯,姜艳[4]（2018）在《鼓槌石斛的种源鉴定及种植情况》一文中研究指出课题组通过实地考察,总结了鼓槌石斛种源的纯正性及种源鉴定,并对现有资源及种植产业发展现状和种植技术进行了调查总结。现有的种源鉴定主要还是形态学等生物学特性鉴定,包括植株形态、生长环境、花的结构。结果表明:历经20年的发展,云南鼓槌石斛人工栽培面积达733.1hm~2,投产面积达722.1hm~2,产鲜花1 198.21t,实现产值2 396.4万元,产鲜茎13 309.7t,实现产值15 962.4万元。该研究结果将为鼓槌石斛优良品种选育,鼓槌石斛产业的健康、可持续发展提供技术支撑。(本文来源于《北方园艺》期刊2018年10期）
杜建梅,云晶晶,杨颜颜,张利娟,胡卫成[5]（2016）在《野生型和栽培型马齿苋的种源鉴定及生物学特性与生态适应性比较》一文中研究指出马齿苋种子为小种子,野生型的种子更小,千粒重仅为栽培型的1/6;两者种皮均具纹饰,野生型种子的正面纹饰和侧面瘤状突起较栽培型种子的更加规则整齐。根据种子大小和表面纹饰形态比对Danin的检索表,将本研究涉及的野生型马齿苋归为Portulaca granulatostellulata(Poelln.)C.Ricceri et P.V.Arrigoni亚种(4N=36),栽培型马齿苋归到Portulaca edulis Danin&Bagella亚种(6N=54)。马齿苋种子萌发迅速,但栽培型种子萌发更加迅速整齐;野生型植株匍匐生长,主侧枝区分不明显,叶、花、果实和种子均较栽培型小;栽培型植株直立,主侧枝区分明显;两者均可行有性生殖,且均可闭花传粉受精,但栽培型植株单株花苞数少,每一花苞内种子数少,显示其有性生殖能力相对较弱。野生型马齿苋种子更小、萌发不整齐、种子量大等特性提示其在形成地下种子库、躲避灾难性逆境的能力更强,更适于生态修复;而栽培型马齿苋的种子萌发迅速整齐、株型直立等特性更有利于其迅速建群,并在农业生产上应有更大的发展空间。(本文来源于《种子》期刊2016年01期）
李向东,成彦武,周海燕,张斯杰,孙大学[6]（2015）在《霍山石斛的种源鉴定及种植产业发展现状考察报告》一文中研究指出霍山石斛是安徽大别山区特产的名贵药材,也是石斛中的极品。大多生长在云雾缭绕的悬崖峭壁崖石缝隙间,一直处于濒危状态,目前很难找到野生状态的霍山石斛。本文通过实地考察,着重阐述了霍山石斛种源的纯正性及种源鉴定,并对调查了解的种植产业发展现状和种植技术进行了总结,旨在为霍山石斛产业的健康、可持续发展提供依据。(本文来源于《中国现代中药》期刊2015年06期）
蒋梅[7]（2015）在《丹霞种源铁皮石斛叶黄酮苷分离鉴定、抗氧化活性及铁皮石斛黄酮苷含量测定研究》一文中研究指出铁皮石斛是一种生长在南方的珍稀名贵中药材,所谓“北有人参,南有石斛”。系兰科石斛属多年生草本植物,以茎入药,11月至翌年3月采收。具有益胃生津,滋阴清热功能。用于热病津伤,口干烦渴,胃阴不足,食少干呕,病后虚热不退,阴虚火旺,骨蒸劳热,目暗不明,筋骨痿软。随着人们对健康的日益重视,铁皮石斛正逐渐成为保健市场新宠。同时,其快速发展也带来了栽培品种、栽培区域环境与技术、产品开发与质量保障等系列制约产业可持续发展的问题。课题组前期研究发现铁皮兰种(云南、广西)、丹霞地貌种(广东、福建、浙江、江西)、浙江本地种(浙江)等不同种源的铁皮石斛叶及茎的黄酮类成分区别较大,但无法购买到相应对照品,影响了铁皮石斛黄酮类特征成分的含量测定研究及质量控制。因此本研究对丹霞种源铁皮石斛叶进行黄酮类成分的分离,以纯化鉴别得到的3个单体化合物为对照品,测定其在云南,浙江,广东,广西,福建5个不同产地的铁皮石斛中含量,为鉴别以及评价药材的质量起到一定的参考作用。本研究同时也探讨了分离得到单体化合物的抗氧化活性。目的:1、本文以丹霞种源铁皮石斛叶为原料提取、分离、纯化其黄酮类化单体化合物。为探讨铁皮石斛叶的药理作用、扩大铁皮石斛的药用部位以及充分利用资源奠定了良好的基础。2、通过PR-HPLC建立不同产地铁皮石斛中多个黄酮类化合物含量测定的方法。3、通过含量测定,考察不同产地铁皮石斛的差异性,为鉴别铁皮石斛产地提供方法依据,同时为完善铁皮石斛质量标准提供一定的参考意见。4、采用体外抗氧化实验,初步探讨分离得到单体化合物的抗氧化生理活性。为筛选黄酮类天然抗氧化剂提供实验依据。方法:1、用70%乙醇提取丹霞种源铁皮石斛叶总黄酮,采取有机溶剂萃取法,将铁皮石斛叶粗提物分成极性不同的萃取部位(石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇)。2、运用大孔吸附树脂AB-8及葡聚糖凝胶Sephadex LH-20,ODS柱层析对正丁醇部位浸膏进行分离纯化。3、通过化合物的理化性质结合现代仪器(ESI-MS、1H-NMR、1C-NMR)等方法鉴定分离纯化得到的黄酮类化合物。4、以分离得到的化合物为对照品,通过RP-HPLC法测定广东、广西、浙江、云南、福建5个产地铁皮石斛茎中的含量。色谱条件为:AgilentZORBAXSB-Aq(250×4.6mm,5μm)色谱柱;乙腈-0.2%甲酸水溶液作为流动相,梯度洗脱程序为0～15 min,12%～12%乙腈,15～80min,12%～15%乙腈;检测波长为340nm;流速为1.OmL ·min-1;柱温为30℃;进样量为20μL。5、通过3种不同的抗氧化体系,分别测定了从丹霞种铁皮石斛叶中分离纯化得到单体化合物对DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)自由基,ABTS(2,2-联氮-二-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)-二胺盐)自由基的清除能力以及对铜的还原能力。成果:1、本次研究分离纯化得到了牡荆素-4"-O-葡萄糖苷、牡荆素-2"-O-木糖苷、芦丁叁个化合物,其中牡荆素-4"-O-葡萄糖苷、牡荆素-2"-O-木糖苷首次从丹霞种源铁皮石斛植物中得到。2、经色谱条件分析,不同产地的铁皮石斛中牡荆素-4"-O-葡萄糖苷、牡荆素-2"-O-木糖苷、芦丁的分离度能达到HPLC含量测定的分离要求,牡荆素-4"-O-葡萄糖苷的回归方程为 Y=2463713X-46232.5,r = 0.9997,线性范围为 23.2～116.0 μg/mL,牡荆素-2"-O-木糖苷的回归方程为Y= 2355633X-24328.6,r= 0.9997,线性范围为13.65～68.25 μg/mL,芦丁的回归方程为 Y= 1720543X-12895.2,r = 0.9995,线性范围为 77.4～387.0μg/mL。平均加样回收率(n=6)分别为 99.58%、99.64%、99.39%,RSD依次为 0.88%、1.46%、0.78%。3、含量测定结果:丹霞、云南、浙江、广西种源均含有牡荆素-4"-0-葡萄糖苷和牡荆素-2"-O-木糖苷,只有云南和丹霞种源含有芦丁。牡荆素-4"-0-葡萄糖苷含量分别为:云南种源50-70ug/g、浙江种源20-40ug/g、广西种源17-30ug/g、丹霞种源15-35ug/g。牡荆素-2"-0-木糖苷含量分别为:云南种源约30ug/g、浙江种源10-30ug/g、广西种源约15ug/g、丹霞种源10-30ug/g。芦丁的含量:云南种源之间以及丹霞种源之间差异也比较大,云南种源30-115ug/g,丹霞种源75-340ug/g。有待扩大样本量进行含量测定。4、对DPPH的清除率试验中当牡荆素-4"-O-葡萄糖苷浓度达到1.0mg/mL时清除率为48.82%,与0.1mg/mLBHT的效果相当,表明牡荆素-4"-O-葡萄糖苷对DPPH自由基有一定的清楚作用,但效果不强。5、ABTS自由基的清除率实验结果:当牡荆素-4"-O-葡萄糖苷浓度达到0.5mg/ml时具有与BHT相似的效果,清除率为86%,说明牡荆素-4"-O-葡萄糖苷对ABTS自由基具有较强的清除效果。6、对铜的还原能力试验:1mg/mL牡荆素-4"-O-葡萄糖苷对铜的还原能力为22.04%,而1mg/mLBHT的清除率高达100%,表明牡荆素-4"-O-葡萄糖苷对铜的还原能力微弱。7、体外抗氧化实验:牡荆素-4"-O-葡萄糖苷清除ABTS自由基能力>DPPH ·自由基清除能力>对铜的还原能力。结论:1、不同产地的铁皮石斛中牡荆素-4"-O-葡萄糖苷、牡荆素-2"-O-木糖苷、芦丁含量存在差异,可通过RP-HPLC含量测定的方法鉴定铁皮石斛的产地。建议以牡荆素-4"-O-葡萄糖苷作为不同产地铁皮石斛共有成分进行含量测定。2、推测造成不同产地铁皮石斛黄酮类含量差异的原因可能与环境气候以及种植方式有关。为了保证药材质量,建议明确引种以及规范化种植。3、铁皮石斛黄酮类RP-HPLC含量测定方法操作简单,准确可靠,重复性好,为铁皮石斛产地区别以及质量方面控制提供了方法依据。4、牡荆素-4"-O-葡萄糖苷具有一定的抗氧化作用,可进一步证实以及探讨其抗氧化机制。(本文来源于《广州中医药大学》期刊2015-05-01）
詹梓金[8]（2010）在《武夷大红袍种源追溯与基因鉴定》一文中研究指出1前言近年耒武夷岩茶的国内外市场看好,大红袍的声誉也越来越高。但市场上以次充好现象时有发生。究其原因有二,主观上经营者有唯利是图思想作祟。客观上,生产原料的种源问题,缺乏正确认识。典型的流行大红袍一代、二代说,甚至说目前市场上卖的还有叁代、四代。意思是说大红袍经扦插繁殖,一代不如一代。另外长期来大红袍以‘名丛'身份存在,生产数量的有限导致产品供不应求。本文就这个问题,对大红袍茶树成为(本文来源于《福建茶叶》期刊2010年08期）
舒红锁[9]（2010）在《不同种源忽地笑的鉴定》一文中研究指出本研究以10份不同来源的忽地笑(Lycoris aurea Herb.)为材料,通过对忽地笑叶形态、核型的分析以及SRAP指纹图谱的构建,来探讨不同种源忽地笑鉴定的方法,为忽地笑资源开发利用和品种选育提供了理论依据。首先忽地笑的叶形态在不同种源间变异较大,按其形态可归为五类:(1)中山植物园的忽地笑叶片色泽最暗,叶背亮绿无白粉;(2)重庆金佛山、湖北恩施的叶片宽大而薄,叶背网纹清晰;(3)江西和福建的叶片平整稍呈肉质;(4)四川名山、峨眉山、云南昆明的叶片略呈革质且叶下白粉显着;(5)湖南桑植的叶片最狭窄,且叶背中脉多呈紫色。其次不同种源忽地笑在染色体核型上也存在巨大变异,按染色体数目的不同可分为五类:(1)2n=12=10m+2T,代表种源为中山植物园;(2)2n=14=8m+4T,代表种源有湖北恩施、重庆金佛山、广西来宾;(3)2n=15=7m+8T,代表种源有江西和福建;(4)2n=16=6m+10T,代表种源有四川峨眉山、四川名山、云南昆明;(5)2n=18=4m+11t+3T,可能由2n=8m+6T的忽地笑同2n=22t的石蒜杂交而成,是忽地笑也是石蒜属首次发现的核型,代表种源仅湖南桑植。忽地笑染色体的变异不仅体现在染色体数目上,而且具同样染色体数目的不同种源之间核型也存在较大变异,主要体现在染色体形态以及臂比上,以此也可以将不同来源的忽地笑加以区分。最后利用64对引物组合对忽地笑进行SRAP扩增,成功筛选出7对引物组合构建了忽地笑特异带指纹图谱,可区分10个种源中的7个。同时筛选出11对引物组合用来构建忽地笑带型组合指纹图谱,其中有7对引物组合能完全将10份材料区分,而将另外4对引物进行再组合同样能达到鉴定的目的。就本实验所针对的材料而言,用SRAP分子标记可以对其进行有效的鉴定。(本文来源于《南京林业大学》期刊2010-06-01）
寿旦,章建民,俞忠明[10]（2009）在《白术高效液相色谱指纹图谱的建立及在品种鉴定与种源差异分析中的应用》一文中研究指出目的:采用高效液相色谱法建立白术的指纹图谱,并对不同产地的白术种源及同科混淆品苍术进行成分比较。方法:采用岛津高效液相色谱仪,资生堂Capcell C18柱(4.6mm×250mm);以乙腈(A)-水(B)为流动相,梯度洗脱程序(A):0～15min,75%;15～20min,75%～95%;20～35min,95%;35～40min,95%～75%;40～50min,75%;流速:1mL/min;检测波长220nm。结果:对13个不同产区的白术及苍术醇提取物进行了指纹图谱研究,建立了白术的高效液相指纹图谱;对其中的内酯Ⅲ、Ⅰ和苍术酮进行了归属;并进一步对不同产地的种源进行分析比较。结论:白术与苍术的色谱图存在显着差异;该方法简便、快捷,能够用于白术的鉴定及种源优选与质量控制。(本文来源于《中华中医药学刊》期刊2009年10期）
种源鉴定论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
动物源性成分是一类来源于动物具有种属代表性的物质,可以是核酸、蛋白,也可以是各种脂类和小分子物质等。近年来,各种畜产品的掺假掺杂事件层出不穷,欧洲―马肉风波‖、中国―假羊肉事件‖等肉类掺假事件,饲料中非法添加反刍动物成分引起的疯牛病全球性传播等,这些畜产品安全问题严重影响肉类市场秩序和畜牧业的健康发展。对食品和饲料中动物源性成分的定性、定量检测是解决这一问题的重要技术手段。目前主要的检测方法是基于线粒体DNA(mtDNA)的PCR方法。然而,由于mtDNA在组织和个体间的拷贝数差异和碱基高变异性,使其易出现假阴性检测结果,且难以实现准确的定量,因而迫切需要筛选新的物种特异性的DNA序列。此外,肉类掺假检测中多物种通用内参的缺乏或保守性差等问题也影响畜产品定量检测的准确性。本研究利用动物全基因组序列和转录组信息,通过比较基因组学分析策略分别筛选物种特异性核DNA序列和多物种保守的核DNA序列,建立肉和饲料中多种动物源性成分的定性、定量检测方法。为满足畜产品安全监管部门对动物源性成分鉴别的系统化、多元化、快速化的迫切需求提供技术支撑。取得的主要结果如下:1.物种特异性DNA序列的筛选及其分子特征分析为了获得新的物种特异性DNA序列,本研究基于物种的全外显子序列,以独创的动态E-value结合Identity%、Quary-cover%为筛选条件,通过与Nt数据库、非目标物种基因组和目标物种基因组的3次本地BLASTN序列比对分析,根据物种的分类地位,在11个科的19个物种中筛选各物种特异性外显子。随后,将各物种的特异性外显子分为完全特异的外显子序列(CESS)和部分特异的外显子序列(PESS),并对其进行分布、结构和序列特征的分析发现:物种的特异性外显子占物种总外显子的比例很低,且与染色体的大小无关。其中的CESS主要分布在CDS区,且序列内部含有大量重复元件;长度较短的、高GC含量的外显子更易发生片段的完全缺失或增加,且其形成与序列上下游的同向重复序列以及序列内部的短重复序列有关。进一步利用各物种特异性DNA序列设计引物,并在19个物种中进行PCR检测,验证了序列和引物的物种特异性,实验结果说明筛选的物种特异性DNA序列可作为种源成分检测的靶标。2.基于物种特异性DNA序列建立肉制品及动物源性饲料中种源成分的定性PCR检测方法为了解决种源检测中靶序列单一匮乏、特异性和保守性差等问题,基于筛选获得的物种特异性DNA序列,建立了肉制品中牛、羊、猪、鸡和鸭源性成分的定性PCR检测方法。通过在线BLAST和ClustalW多序列比对分析,将物种特异性DNA序列分别与包含动物、植物和微生物在内的4个界、11个纲、21个目、36个科、47个属的53个代表性物种的参考基因组进行序列比对分析,发现各序列均具有高度的种间特异性和种内保守性。通过物种特异性引物设计并进行反应体系、反应条件优化,建立了5个物种5对引物相同反应程序(退火温度均为60℃)的PCR检测方法,实现了肉中牛、羊、猪、鸡、鸭成分的同时检测。所建立的PCR检测方法在19个物种中进行验证,结果表明5个物种的种源检测PCR方法具有高度的物种特异性,仅在目标物种中具有扩增产物,其他物种中无任何产物;同时利用5个物种的44个个体进行PCR扩增都得到预期的扩增产物,通过对PCR产物进行测序,在同一物种中的序列具有一致性,说明这些物种特异性序列在物种内具有高度的保守性。所建立的PCR检测方法,灵敏度均可达到0.5ng。进一步对牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉的熟肉制品进行检测,得到与产品种源成分一致的检测结果,说明本方法可用于加工肉食中种源成分的检测。针对疯牛病的饲料源性传播问题,筛选了牛科特异性基因TAF4,该基因在牛和羊中存在18bp片段差异,针对该差异片段设计一对牛羊通用引物,但扩增产物大小不同,通过一次PCR反应即可同时检测和鉴别牛(125bp)、羊(107bp)源性成分,并在23个物种中表现出高度的物种特异性。对牛(黄牛、牦牛、瘤牛、水牛)、羊(绵羊、山羊)不同品种进行PCR扩增和测序比对分析,结果表明该序列在牛、羊中都分别具有高度保守性。所建立的PCR检测方法,灵敏度可达到0.2ng DNA。最后,对5份委托制作的动物源性饲料的检测结果说明该方法具有检测饲料样品中牛、羊源性成分的能力,具有重要的应用价值。3.筛选哺乳动物和鸟类中高度保守的单拷贝序列作为多物种通用内参并建立定量检测方法定量检测是对畜产品掺假情况进行准确评估的一个重要方法。而可靠有效的定量内参是解决这一问题的前提。本文从全基因组水平出发,利用11个科的13个哺乳动物和鸟类物种的外显子数据,通过比较基因组学和生物信息学方法筛选了在哺乳动物和鸟类中同源率>95%的高度保守的核DNA序列,并在保守区设计了多物种通用引物。通过在18个动物物种基因组中试验验证发现,该序列具有高度保守性、且为单拷贝序列。基于多物种定量内参,进一步建立和优化了一种种源成分定量检测方法,相对误差(R.E.)和相对标准偏差(R.S.D.)均小于25%。并通过引入基因组当量(GE)和校正系数k的概念,实现了DNA混合样品中牛、兔、狗、狐、貂成分的更加精准的定量检测。为畜产品中种源成分的准确定量提供了可靠的多物种通用的定量内参和检测方法。4.基于多物种通用内参建立肉制品中多种动物源性成分的多重定量检测方法针对欧洲―马肉风波‖问题,结合牛、马的特异性DNA序列和多物种通用内参,建立了牛(223bp)、马(197bp)和动物(129bp)源性成分的叁重定性和定量检测方法;针对我国―假羊肉事件‖,结合羊、狐、鼠的特异性DNA序列和多物种通用内参,建立了羊(237bp)、狐(211bp)、鼠(160bp)源性成分的多重定性和定量检测方法。所有物种特异性序列均与包含动物、植物、微生物在内的53个物种的参考基因组进行BLAST和ClustalW序列比对,并在碱基差异区设计物种特异性引物和探针。利用普通PCR和TaqMan荧光PCR在多个物种DNA中对序列、引物和探针的特异性进行验证,并进而验证了各物种特异性序列均为固定拷贝数的序列。多重PCR体系的建立说明各组引物和探针之间不存在交叉互作,确保了单一体系中多种种源成分的同时检测和定量。保守性试验表明各物种特异性序列和引物在各自目标物种内的高度保守性。灵敏度检测结果表明检出限(LOD)为0.05ng DNA,定量限(LOQ)达5%。并通过构建各物种特异性序列和内参序列的标准曲线,建立了GE与Ct值的计算关系,对多组DNA混合样品和不同质量比的混合肉样品进行多重定量检测,R.E.和R.S.D.均小于25%,表明所建立的多重定量检测方法的具有良好的检测准确度和精确度。本研究利用比较基因组学方法筛选物种特异性核DNA序列用于种源成分检测;筛选保守性核DNA序列作为多物种定量内参。进而建立了肉和饲料中牛、羊、猪、马、鸡、鸭、狐等多种种源成分的定性和定量检测方法,为种源成分检测提供了相应的方法和候选素材,为食品和饲料安全提供重要的技术支撑。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
种源鉴定论文参考文献
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