一、Cloning and identifying of a novel protein binding with death domain of the death receptor 4（论文文献综述）
王丽娟[1]（2021）在《甜瓜CmBAG6-2基因在其果实发育中功能的初步分析》文中研究说明甜瓜（Cucumis melo L.）是一种重要的瓜果类植物,其经济价值与市场潜力巨大。甜瓜染色体组为二倍体、种类众多、分布广泛、栽培周期短、表型丰富,尤其在果实发育过程中其果实大小、颜色、风味变化明显,是研究果实发育的理想对象。BAG基因家族广泛参与植物个体发育、激素信号传递和逆境胁迫。本研究以呼吸跃变型甜瓜品种河套蜜瓜（Cucumis melo L.cv Hetao melon）为研究材料,结合甜瓜不同发育时期果实转录组数据及Real-time PCR检测,挑选了在甜瓜果实生长发育过程中持续表达且呼吸跃变期果实中表达最高的CmBAG6-2基因,对其在甜瓜果实发育及逆境胁迫中的功能进行了分析,主要研究结果如下:（1）甜瓜全基因组中共鉴定出BAG基因家族成员10个,生物信息学分析表明CmBAG6-2位于11号染色体,CmBAG6-2具有典型的BAG保守结构域和IQ基序,是一种亲水性、热不稳定的酸性蛋白,定位于细胞核,启动子中含有脱落酸、乙烯、生长素等植物激素应答元件以及参与干旱、低温、防御和应激反应的顺式作用调节元件。（2）Real-time PCR分析,表明CmBAG6-2基因在甜瓜各组织中均有不同程度的表达,果实中表达量较高,且随着甜瓜果实发育其表达量逐渐上升,呼吸跃变期达到最高。（3）克隆了CmBAG6-2的cDNA序列,分别构建了其超表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用瞬时表达的方法初步分析了CmBAG6-2基因的功能,发现CmBAG6-2超表达可能促进果实成熟。（4）利用子房注射法将CmBAG6-2基因超表达载体和基因编辑载体导入甜瓜,检测结果表明,超表达和基因编辑载体PCR检测阳性率均为8.3%。超表达株系中CmBAG6-2的表达量是野生型的3倍以上。T1代超表达果实相对于野生型提早成熟5.2天,且果实硬度显着低于同一发育时期的野生型果实。（5）CmBAG6-2基因启动子序列分析,筛选了与果实发育和应激反应相关的转录因子基因CmAI5L6、CmERF12,酵母单杂交结果表明转录因子CmAI5L6、CmERF12与CmBAG6-2的启动子结合,其可能调控CmBAG6-2基因的表达。（6）酵母双杂交分析结果表明,CmBAG6-2与CmHsp70-8存在蛋白质之间的相互作用,但与CmHsp70-4、CmBAG1-3、CmBAG4之间不存在相互作用。（7）盐胁迫结果显示,T2代超表达种子发芽率高于野生型;超表达幼苗的胚轴、胚根长度比野生型长;56.52%的超表达幼苗发育出侧根,而野生型幼苗只有20%发育出侧根,而且超表达幼苗单株侧根数多于野生型,表明CmBAG6-2基因能够提高转基因甜瓜种子和幼苗对盐胁迫的耐受性。
王泉[2]（2021）在《蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B和SHP2变构调节机制的分子动力学模拟研究》文中指出蛋白质酪氨酸的可逆磷酸化是真核生物调节多种生理活动的重要手段。蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）超家族可以与蛋白酪氨酸激酶（PTKs）超家族协同作用,共同维持细胞内酪氨酸磷酸化和去磷酸化的生理平衡。虽然科学家们很早就开始研究PTPs的调控机制,但是单纯利用实验手段来研究PTPs的调节机制仍然存着较大的局限性,科学家们很难得到生理状态下PTPs的动态结构。随着计算机技术和模拟算法的高速发展,分子动力学模拟已经成为研究蛋白质结构和功能的重要手段。分子动力学模拟不仅可以研究蛋白质构象的动态变化,还可以得到伴随蛋白质构象变化的能量信息。PTP1B是第一个被发现的蛋白酪氨酸磷酸酶,目前已经成为研究其他蛋白酪氨酸酶的重要参照酶。SHP2则是PTPs超家族中的一个特殊成员,拥有独特的SH2蛋白域和自抑制机制。PTP1B和SHP2是PTPs家族中极有代表性的两个成员,探究PTP1B和SHP2的变构调节机制可以帮助我们更全面了解PTPs超家族的变构调节机制,为变构抑制剂的开发提供理论依据。本文利用分子动力学模拟的方法对蛋白酪酸磷酸酶PTP1B和SHP2的变构调节机制进行了系统的理论研究。主要内容如下:1.蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）变构调节机制的分子动力学模拟研究蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是治疗Ⅱ型糖尿病和肥胖的理想靶点。自从PTP1B在1988年被发现以来,科学家们在寻找其抑制剂的研究中投入了大量的时间与精力,但是直到现在,PTP1B抑制剂在临床治疗上的应用仍然十分有限。在本研究中,我们采用分子动力学模拟（MD）的方法来研究PTP1B与竞争性抑制剂（TCS401）和变构抑制剂（香豆酮化合物）的结合机制,并研究催化位点和变构位点之间的联系。研究结果表明催化位点和变构位点之间可以通过一条氢键网络（THR177-TYR152-ASN193-GLU297）相互作用。这条氢键网络是维持WPD loop开放或关闭的重要因素,并且可以在催化位点和变构位点之间传递结构变化信号。ASN193是重要的枢纽残基,它可以连接关键的Loop L11和螺旋α7。此外双解离状态的TCS401比其它解离状态有着更强的PTP1B亲和力。我们的研究揭示了PTP1B潜在的变构调节机制,为PTP1B变构抑制剂的设计提供了新的思路。2.蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2变构机制的分子动力学研究SHP2（由PTPN11编码）是一种变构磷酸酶,在细胞信号传导中发挥着重要作用。程序性死亡受体1（PD-1）上的免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和免疫受体酪氨酸转换基序（ITSM）上的酪氨酸被磷酸化后,可以与SHP2结合并引发T细胞失活。尽管SHP2-PD-1相互作用对调节免疫进程十分重要,但是SHP2与PD-1的结合模式以及变构机制尚不清楚。在本研究中,我们采用分子动力学模拟的方法来研究SHP2和PD-1的结合细节,探究SHP2的变构调节机制。结果表明,ITIM会优先选择与N-SH2蛋白域结合,而ITSM对N-SH2和C-SH2蛋白域没有选择性。只有当ITIM与N-SH2蛋白域结合,ITSM与C-SH2蛋白域结合时,SHP2才会被完全激活。ITIM和ITSM的结合会通过改变SHP2的运动模式来变构激活SHP2,从而开启下游的信号通路。3.不同EPIYA多肽变构激活SHP2机制的分子动力学模拟研究CagA蛋白是幽门螺旋杆菌的主要毒力因子。CagA蛋白根据其含有EPIYAC还是EPIYA-D多肽可以在地理上分为东亚型CagA（EPIYA-D）和西方型CagA（EPIYA-C）,东亚型CagA的致病性（胃癌）要强于西方型CagA。在本研究中,我们采用分子动力学模拟来探究SHP2与不同EPIYA片段的结合细节,并探究它们对SHP2的变构激活机制。我们的研究表明EPIYA-D与SH2蛋白域（无论是N-SH2还是C-SH2蛋白域）的结合能力要强于EPIYA-C。此外,单独的EPIYAD结合到SHP2的N-SH2蛋白域上会导致关键螺旋B发生偏转,偏转的螺旋B会进一步挤压N-SH2和PTP蛋白域的接触面,打破SHP2自抑制口袋。然而单独的EPIYA-C结合到SHP2的N-SH2蛋白域上只会破坏螺旋B的二级结构,无法破坏自抑制口袋。但是当两个串联的EPIYA-C多肽同时结合到N-SH2和CSH2蛋白域上时,不仅可以增加EPIYA-C与N-SH2蛋白域的结合能力,还会保护螺旋B的二级结构,变构激活SHP2。我们的研究可以帮助研究者们更好的了解由胃幽门螺旋杆菌感染导致的胃癌的致病机制。PTP1B和SHP2既是PTPs超家族中极有代表性的两个成员,又是治疗糖尿病和肿瘤的有效靶点。但是由于它们催化位点的特殊性,其竞争性抑制剂在临床上的应用面临着许多困难。随着结构生物学的发展,开发PTP1B和SHP2的变构抑制剂已经成为治疗糖尿病和癌症的新方向。在本研究中,我们采用分子动力学模拟的方法来解释PTP1B和SHP2的变构调节机制,为PTP1B和SHP2变构抑制剂的开发提供了理论支持。
王妍[3]（2020）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9及其特异性纳米抗体的结构解析》文中提出猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病原是PRRS病毒（PRRSV）,是一种危害严重的病毒性疫病,给全球养猪业造成巨大的经济损失。PRRSV非结构蛋白9（Non-structural protein 9,Nsp9）有RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）功能,对病毒复制至关重要。另外,Nsp9序列相对保守,是理想的抗PRRSV靶标。实验室前期研究发现在MARC-145细胞中稳定表达Nsp9特异性纳米抗体Nb6能抑制PRRSV复制。同时,还证明了Nb6与细胞穿膜肽（Cell penetrating peptide,CPP）融合表达的重组蛋白能进入宿主细胞并发挥抗病毒功能。然而,Nb6通过靶向Nsp9抑制PRRSV复制的抗病毒机制尚不清楚,此外,Nsp9的三维结构未知。本研究使用X-射线小角散射（Small-angle X-ray scattering,SAXS）技术,获得了Nsp9以及Nsp9-Nb6复合物的分子包膜信息,同时鉴定了参与Nsp9-Nb6相互作用的重要氨基酸位点。在此基础上,本研究进一步通过反向遗传技术构建了突变这些氨基酸位点的重组病毒,体外评估了突变病毒的复制效率,确定了影响PRRSV复制的关键氨基酸。另外,获得并解析了Nsp9特异性纳米抗体Nb7的高分辨率晶体结构（1.8?）。本研究为抗PRRSV感染以及开发基于结构的抗病毒药物提供了试验依据。本论文的研究内容及结果如下:1.使用阴离子交换柱、Ni-NTA和凝胶过滤层析柱纯化Nsp9重组蛋白,获得了纯度较高的重组蛋白并对其进行了结晶;通过I-TASSER在线服务器预测了全长Nsp9的结构,总体结构分为两个部分呈上窄下宽的桶形;根据此预测结构以及前期文献报道将Nsp9截短表达;使用动态光散射（Dynamic light scattering,DLS）方法检测了Nsp9重组蛋白在溶液中的粒径大小,结果表明此Nsp9重组蛋白溶液是均一的,单分散的;将不同浓度的Nsp9重组蛋白进行SAXS分析,最终获得了Nsp9重组蛋白的大分子包膜,其大分子包膜不对称且呈桶形。2.扩增Nb6/Nb7基因并将其克隆到p MECS载体中,构建p MECS-Nb6/Nb7重组表达载体;将载体转化BL21感受态细胞,诱导后,经验证Nb6/Nb7重组蛋白在大肠杆菌周质中成功表达;重组蛋白使用Ni-NTA和凝胶过滤层析柱纯化获得了高纯度蛋白;接下来,将Nb6/Nb7基因克隆到p PICZαA载体,构建p PICZαA-Nb6/Nb7重组表达载体;重组表达载体经线性化后电转化毕氏酵母菌株X-33感受态细胞;甲醇诱导后,经SDS-PAGE分析表明Nb6/Nb7重组蛋白在细胞上清中大量的分泌表达;Nb6/Nb7经Ni-NTA和凝胶过滤层析柱纯化,获得了高纯度的重组蛋白;结晶酵母表达的Nb6/Nb7的晶体并收集数据,Nb7重组蛋白的晶体具有较好的衍射,最终获得了1.8?高分辨率衍射数据,每个不对称单元中有两个Nb7,重组蛋白的形状总体呈现紧致的圆柱形,并且没有长的CDR3,这与其他的纳米抗体不一样。3.将纯化的Nsp9重组蛋白和过量Nb6重组蛋白孵育,通过凝胶过滤层析柱纯化,获得Nsp9-Nb6复合物;使用生物膜干涉技术（Bio-layer interferometry,BLI）分析了Nsp9与Nb6之间的亲和力大小,结果表明Nsp9与Nb6具有高亲和力;DLS分析显示Nsp9-Nb6复合物溶液是均一的;将不同浓度的Nsp9-Nb6复合物进行SAXS分析,获得了Nsp9-Nb6复合物在溶液中的结构信息数据,最终获得了Nsp9-Nb6复合物的大分子包膜信息;通过将复合物的大分子包膜和Nsp9单体的大分子包膜分析比较后确定了Nsp9-Nb6相互作用模型。在此模型中,复合物的相互作用是通过Nsp9的Ile588、Asp590、Leu643和Asp646与Nb6的Trp105、Pro107、Tyr62和Asp64介导的;使用BLI和ELISA方法验证Nsp9和Nb6之间相互作用的氨基酸,结果表明,Nsp9的588、590和643位氨基酸和Nb6的62、105和107位氨基酸参与了二者的相互作用;以高致病PRRSV（Highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV）SD16株感染性克隆为骨架,构建了Nsp9的第588位、590位和643位氨基酸替换的重组病毒;在MARC-145细胞上的复制动力学表明,第588位和643位氨基酸替换的突变病毒较其亲本毒复制效率明显降低并且其负链基因组RNA水平与其亲本病毒之间也存在明显差异。综上所述,本研究首次使用SAXS方法获得了Nsp9和Nsp9-Nb6复合物的分子包膜,并鉴定出对PRRSV复制至关重要的Nsp9的两个新的氨基酸。这些发现丰富了有关PRRSV Nsp9以及病毒复制和致病性的知识,有助于开发抗PRRSV感染的药物和新型疫苗。
李永红[4]（2020）在《空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究》文中研究表明研究目的以手术及放化疗为主的胃癌治疗已经进入平台期。过去三十年中,以凋亡蛋白为靶标的新型抗肿瘤药物研发取得了一定的进展,但受凋亡蛋白高频可变剪接、肿瘤异质性等因素的影响,凋亡相关靶向药物在临床应用特别是在胃癌等实体肿瘤中疗效欠佳。因此,基于凋亡因子可变剪接调控的抗肿瘤研究引起广泛关注,但在胃癌中的相关研究尚未见相关报道。Mcl-1分子是Bcl-2凋亡基因家族的核心成员,Mcl-1 pre-mRNA可通过可变剪接表达抗凋亡蛋白Mcl-1L和促凋亡蛋白Mcl-1S两种剪接异构体。基于Mcl-1可变剪接的干预有望通过改变肿瘤细胞抗凋亡状态、促进肿瘤细胞凋亡而成为胃癌治疗的新策略和新靶点。本研究通过临床研究,明确凋亡因子Mcl-1可变剪接与胃癌病理分级、临床分期、生存预后的相关性;通过细胞学实验,探讨空间阻滞寡核苷酸（SBOs）调控Mcl-1可变剪接进而促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖的生物学效应;通过裸鼠移植瘤实验,在体内验证SBOs治疗对肿瘤组织Mcl-1可变剪接的调控作用及其促进肿瘤组织细胞凋亡、抑制肿瘤生长增殖的作用。研究方法临床研究:应用基因表达谱交互分析软件GEPIA分析来源于TCGA数据库的408例胃癌组织以及36例正常胃粘膜组织中Mcl-1 mRNA表达情况及其与胃癌病理分级、临床分期、生存预后之间的相关性;收集59例胃腺癌患者新鲜胃癌组织和31例胃炎患者胃黏膜组织,应用荧光定量PCR技术定量检测Mcl-1可变剪接产物Mcl-1L及Mcl-1S的mRNA表达;利用Western blotting技术对Mcl-1L及Mcl-1S蛋白表达水平进行半定量检测;Mcl-1L及Mcl-1S表达水平与胃癌病理分级、临床TNM分期、生存预后的相关性分析。体外实验:合成Mcl-1特异性SBOs,应用Endo-Porter系统转染至不同分化程度的胃癌细胞系（MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、MKN-45（低分化））;RT-q PCR及Western blotting技术检测转染不同浓度SBOs细胞的Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡率;Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡活化状态;CCK8增殖实验评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的增殖能力。体内实验:应用胃癌细胞系种植裸鼠背前壁皮下部位建立MKN-45和HGC-27两种胃癌移植瘤模型;通过瘤体局部多点注射不同剂量Mcl-1特异性SBOs,注射3天后处死裸鼠;记录裸鼠移植瘤体积治疗前后变化并组间比对分析;RT-q PCR及Western blotting技术检测不同浓度SBOs治疗后癌组织Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;HE染色后计算SBOs治疗后肿瘤组织细胞死亡面积;免疫荧光技术原位观察肿瘤组织细胞凋亡;组织研磨后制备组织细胞悬液,应用流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡率,同时应用Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价不同剂量SBOs治疗的胃癌组织的肿瘤凋亡活化状态;应用免疫组化技术检测细胞增殖指标Ki-67表达。研究结果临床研究:与正常胃粘膜组织相比,肿瘤组织中Mcl-1L mRNA表达显着升高（p<0.05）,与之相反,Mcl-1S mRNA表达则显着降低（p<0.01）,Mcl-1S/Mcl-1L mRNA亦明显降低（p<0.001）;与mRNA表达水平差异相一致,在胃癌组织中,Mcl-1L蛋白表达明显升高,Mcl-1S蛋白表达水平显着降低;同时,Mcl-1S与Mcl-1L mRNA表达水平的比值与胃癌T分期呈负相关,与N分期无明显关联性;Kaplan Meier生存分析显示,低Mcl-1S/Mcl-1L mRNA水平胃癌患者的总生存期低于Mcl-1S/Mcl-1L mRNA高水平胃癌患者。体外实验:相对GES-1正常细胞,不同分化程度的胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、MKN-45中Mcl-1L表达明显升高,Mcl-1S表达显着降低,但胃癌细胞株组间无显着差异;转染不同浓度SBOs 48 h后,Mcl-1L mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性降低,而Mcl-1S mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性增加;与mRNA水平的定量变化相似,SBOs处理的胃癌细胞系中,Mcl-1L蛋白表达水平下降,Mcl-1S蛋白表达水平升高;流式细胞术检测SBOs处理的胃癌细胞系显示三株细胞凋亡率均呈SBOs剂量依赖性升高;SBOs处理的胃癌细胞系中,细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）表达显着升高;转染不同浓度SBOs胃癌细胞的CCK8 OD值呈SBOs剂量依赖性升高。体内实验:SBOs治疗后,MKN-45和HGC-27两种小鼠移植瘤组织中Mcl-1S mRNA及蛋白表达上调,而Mcl-1L表达显着下调;肿瘤组织HE染色显示,相对于对照组,SBOs治疗组移植瘤组织细胞死亡面积呈SBOs剂量依赖性增加;免疫荧光原位检测显示,治疗后癌组织原位肿瘤细胞凋亡数量亦呈SBOs剂量依赖性增加;流式细胞术定量检测细胞凋亡显示,MKN-45异种移植模型中Con-SBO、6.25和12.5 mg/kg SBOs治疗组肿瘤细胞凋亡率分别为2.76%、14.44%和28.75%,在HGC-27异种移植模型中肿瘤细胞凋亡率分别为2.49%、31.26%和50.57%;SBOs治疗后,肿瘤组织中细胞凋亡关键标志物Bak、cleaved caspase9和cleaved caspase 3表达水平明显升高;SBOs治疗组肿瘤体积基本保持稳定,而对照组肿瘤体积增长超过30%;免疫组化检测显示,SBOs治疗组肿瘤生存能力和增殖的指标Ki-67表达率呈SBOs剂量依赖性下降。研究结论1.凋亡因子Mcl-1可变剪接异构体Mcl-1L和Mcl-1S在胃癌中表达不平衡,与胃癌临床进展及预后不良密切相关。2.Mcl-1特异性SBOs可以调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接从Mcl-1L转换为Mcl-1S mRNA剪接模式,抑制抗凋亡可变剪接异构体Mcl-1L的表达,诱导促凋亡异构体Mcl-1S的表达;这种干预能有效促进不同分化程度胃癌细胞的凋亡并抑制胃癌细胞增殖。3.在活体肿瘤组织内Mcl-1特异性SBOs亦可靶向调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接,使剪接模式从Mcl-1L向Mcl-1S mRNA转换,进而诱导胃癌移植瘤组织细胞凋亡并抑制移植瘤增殖和生长。4、以Mcl-1可变剪接为靶标的细胞凋亡调控,具有较高的特异性和有效性可作为抗胃癌治疗的新方向。
徐珩[5]（2020）在《靶向肿瘤凋亡相关靶标的先导化合物发现及作用机制研究》文中进行了进一步梳理细胞凋亡逃逸是肿瘤的六大特征之一,靶向肿瘤细胞凋亡治疗癌症一直是抗肿瘤药物研发的主要方式之一。肿瘤细胞凋亡受多种信号转导通路、蛋白和内源小分子调控,是一个非常复杂的网络。其中,较早开始研究的是凋亡信号通路相关蛋白,如IAP家族蛋白,目前已有多个IAP小分子在进行临床I期和II期的研究。核受体是细胞凋亡调控中非常重要的一环,在结合其内源性配体后,核受体被激活进而调控众多的细胞凋亡相关的基因转录。其中比较特别的是,孤儿核受体Nur77。Nur77接受凋亡信号后从细胞核向线粒体转位,并通过直接的相互作用将抗凋亡蛋白BCL-2转变成促凋亡蛋白。研究发现活性氧（ROS）在细胞中的作用类似于第二信使,能调控众多蛋白和信号通路。靶向直接调控ROS的蛋白是肿瘤细胞凋亡调控的新思路。来源于中草药的天然产物种类繁多,化学空间巨大,生物学活性广泛,其中很多都有诱导肿瘤细胞凋亡的表型。本文结合上述因素进行三方面的课题研究。第一个方面,是从小分子诱导cIAP1蛋白发生二聚化进而降解的现象入手,结合文献中cIAP1的氨基酸残基突变实验,采用分子动力学模拟的方法,解释了在小分子诱导cIAP1二聚化降解过程中,关键残基E447与周围氨基酸残基的氢键网络、静电相互作用发挥的重要作用。动力学模拟结果显示cIAP1的氨基酸残基D303与自发泛素化关键残基T612存在氢键作用,据此结果设计并表达纯化了cIAP1新突变体蛋白D303A,通过实验观察到D303A的自发二聚化。结果证明了在溶液状态下,关键残基的氢键相互作用对cIAP1二聚化降解的影响。为挖掘天然产物靶向cIAP1蛋白的潜力,我们针对天然产物小分子库,采用基于蛋白热稳定性筛选的方法,得到分子水平亲和力为163.5 nM的土木香内酯,亲和力为359.8 nM的6-姜烯酚,比阳性对照小分子BV6靶向cIAP1的亲和力（1.63μM）更强。cIAP1是这两个天然产物目前已有报导的结合活性最强的靶标,并且它们也是为数不多的靶向cIAP1的天然产物抑制剂。通过细胞水平相关实验,我们进一步证明了土木香内酯和6-姜烯酚靶向cIAP1的在靶效应。综上,分子水平和细胞水平实验结果都表明土木香内酯和6-姜烯酚是具有改造前景的靶向cIAP1的天然产物抑制剂。第二个方面,是通过分子动力学模拟分析比较Nur77已报道的炎症调控位点和凋亡调控位点。比较分析小分子结合在不同口袋对蛋白构象影响的差别。与此同时,我们靶向Nur77开展了基于蛋白热稳定性的天然产物筛选,发现了结合强度为1.81μM的去甲氧基姜黄素和3.07μM的宝霍苷I,而Nur77蛋白也是去甲氧基姜黄素和宝霍苷I目前已报道的亲和力最强的分子靶标。细胞水平实验也证明这两个小分子是活性较好的靶向Nur77的诱导肿瘤细胞凋亡的小分子。第三个方面,是利用共价对接结合酶活实验的策略,获得了靶向细胞氧化还原调控关键蛋白过氧化物氧化还原酶1（PRDX1）的活性、选择性较好的抗肿瘤先导化合物P1-L02。P1-L02靶向PRDX1的酶活性抑制IC50为89.3 nM,在PRDX家族中也有较好的选择性。通过分子动力学模拟结合结晶条件筛选的方式,我们解决了PRDX1晶体稳定性差的问题,获得了高分辨率的PRDX1蛋白晶体,进而成功解析了PRDX1和P1-L02的复合物晶体结构。细胞水平实验证实了P1-L02的表型符合PRDX1的生物学功能,深入的解析具体分子机制发现P1-L02是通过靶向PRDX1-ASK1蛋白相互作用来实现促凋亡活性。P1-L02是目前报导的活性最强的PRDX1抑制剂,有望作为工具化合物,用于对PRDX1相关的进一步机制研究。P1-L02也为靶向PRDX1的抗肿瘤先导化合物开发奠定了坚实的基础。
王子璇[6]（2020）在《TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究》文中提出急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一种异质性的血液系统恶性肿瘤,对人类的健康构成了严重的威胁。目前,AML的临床治疗仍旧是以放化疗、骨髓移植为主。尽管治疗手段在逐渐进步,但AML患者的整体存活率仍旧很低。对于一线化疗药物产生耐药反应是导致治疗失败的最主要原因,因此继续寻求新的治疗方式是当前AML治疗的首要任务。随着生命科学和医学研究的深入发展,溶瘤病毒（Oncolytic virus）成为目前治疗恶性肿瘤的一个重要发展方向。然而,由于靶向性较弱和感染效率不足,利用溶瘤病毒治疗白血病等血液系统恶性肿瘤目前仍然受到限制。溶瘤腺病毒是恶性肿瘤溶瘤病毒疗法研究中应用最为广泛的病毒类型之一。然而,受给药方式（目前主要通过瘤内给药）的限制,溶瘤腺病毒治疗血液恶性肿瘤的研究较少。在课题组的前期研究中,我们利用亮氨酸拉链异二聚体系统,通过对腺病毒衣壳蛋白进行结构改造修饰,成功构建了一种靶向型溶瘤腺病毒载体（rAd5pz-zTRAIL-RFP-SΔ24E1a,A4）。该载体可以通过静脉给药对乳腺癌小鼠模型产生较好的治疗效果。因此,本论文希望通过对载体进行优化,进一步考察其应用于AML治疗的潜力。溶瘤腺病毒A4可以表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）,且能够利用亮氨酸拉链（zipper）连接于病毒表面,从而靶向肿瘤细胞并增强肿瘤杀伤能力。因此,论文首先检测了AML细胞系和原代细胞表面腺病毒受体和TRAIL受体的表达水平。结果显示:在永生型AML细胞系THP-1和MV4-11均表达较高水平的死亡受体DR4、DR5,但假死亡受体（DcR1和DcR2）表达水平较低,并且两株细胞均表达较低水平的腺病毒受体（CAR,整合素αvβ3和整合素αvβ5）。而在所检测的19例AML患者来源的原代细胞中,有50%以上的样本表达中等水平的DR4、DR5。这一结果对经过我们改造的重组溶瘤腺病毒载体的应用奠定了基础。前期研究发现,尽管A4病毒的衣壳表面通过zipper修饰有TRAIL,但病毒衣壳修饰的TRAIL量小于理论值。所以,为了进一步提升A4的肿瘤靶向能力,我们首先构建了C端融合亮氨酸拉链zipper E·E34单链的截短型TRAIL的融合蛋白z-sTRAIL的原核表达质粒pET-28a-z-sTRAIL,并在大肠杆菌内成功表达并纯化出z-sTRAIL蛋白。在验证了z-sTRAIL的基本生物学活性后,将z-sTRAIL蛋白与腺病毒衣壳pIX修饰有zipper R·R34单链的病毒进行体外共孵育,经过CsCl密度梯度离心的方法对其进行纯化。通过对其进行dot blot和ELISA检测后证实,经过体外优化可以得到比A4病毒衣壳TRAIL修饰量多出一倍的重组溶瘤腺病毒载体,优化后的载体命名为zA4。通过对THP-1和MV4-11细胞进行感染分析,我们发现zA4对AML细胞的感染能力明显优于A4和衣壳未经修饰的A3病毒。并且通过THP-1与病毒的结合与内在化实验进一步证明了病毒载体表面修饰的TRAIL蛋白越多,越有利于增强病毒载体对THP-1细胞的结合能力。随后通过体外的抑瘤效果评价我们可以发现,以不同MOI病毒（A3、A4和zA4）分别感染THP-1和MV4-11细胞,三种溶瘤腺病毒均可以诱导剂量依赖的AML细胞毒性。并且对人正常淋巴T细胞H9无明显杀伤。并且以相同方法对19例AML患者的原代细胞样本进行相同的细胞毒性分析,结果表明三种溶瘤腺病毒均可以对原代AML细胞造成明显杀伤,并且杀伤能力随着病毒衣壳TRAIL蛋白修饰量的增加而增强。之后,使用THP-1细胞在Balb/c裸鼠中进行了体内抑瘤效果评价。我们成功建立了皮下荷瘤模型和静脉荷瘤模型两种AML模型。在两种模型中,三种病毒均有较明显的肿瘤靶向效果和抑制肿瘤效果,并且zA4显示出最佳的肿瘤靶向能力和效果最明显肿瘤细胞杀伤能力。由于发现溶瘤病毒在部分TRAIL受体表达较低的原代AML细胞中活性并不理想,因此为了进一步提升重组溶瘤腺病毒zA4在TRAIL死亡受体相对低表达的肿瘤细胞系中的杀伤能力,我们针对TRAIL活性进行了化药筛选。研究结果表明,人参皂苷Rh2能够提升肿瘤细胞的死亡受体表达,从而增强TRAIL引起的细胞凋亡活性。并且发现在同时应用低剂量的Rh2与低剂量的sTRAIL联合后,可以降低sTRAIL的半数抑制浓度IC50,二者之间存在着较强的协同作用。之后我们分别使用永生化AML细胞系THP-1与原代AML细胞分别进行了Rh2联合zA4的体外抑瘤效果评价,发现Rh2在这两类AML细胞中均能够显着增强zA4的肿瘤杀伤能力。最后,我们利用静脉荷瘤模型对这种联合疗法进行了体内评价验证。实验结果表明,这种联合治疗的方式可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖及肝浸润现象,并且有效地延长了小鼠的生存期。综上所述,在本论文的研究中,我们通过对前期获得的靶向型溶瘤腺病毒进行优化,获得了具有更多TRAIL蛋白修饰的溶瘤腺病毒载体zA4。然后利用AML细胞系和原代AML细胞在体外细胞水平验证了zA4具有较好的抗肿瘤活性,并在裸鼠荷瘤模型中通过静脉注射的方式进行治疗性评价,证实优化后的zA4具有更强的肿瘤靶向能力及更强的抑瘤效果。此外,Rh2与zA4的联合应用增强了zA4对原代AML细胞和移植型AML裸鼠模型的靶向治疗效果。本研究提供了将溶瘤腺病毒载体应用于治疗包括AML在内的血液系统恶性肿瘤中的可行性。
王亚楠[7]（2020）在《蜱唾液腺组织退化中的细胞自噬和细胞凋亡的联络机制研究》文中指出蜱是仅次于蚊子的第二大病原传播媒介。蜱的唾液腺在吸血过程中具有关键作用,也是蜱传播病原的主要器官。蜱的唾液腺在饱血后会经历快速的退化,以适应后续蜕皮发育或生殖产卵的生理学需要,但其调控机制不明。本论文以镰形扇头蜱为研究对象,聚焦蜱吸血后唾液腺退化这一生物学现象,从唾液腺退化过程中细胞自噬和凋亡的联络机制上展开研究,以期在分子水平上解析蜱的退化机制,为蜱的新型控制技术提供理论基础。主要研究结果如下:一、蜱唾液腺退化过程中的细胞自噬和细胞凋亡的动态检测和转录组分析通过透射电镜（TEM）和TUNEL染色结果显示在整个蜱的吸血期和饱血后均可观察到双层膜包裹的自噬体,细胞自噬无显着变化;但进入快速吸血期和饱血后蜱的唾液腺TUNEL染色阳性率显着升高,表明蜱的唾液腺退化以细胞凋亡为主。根据上述结果,选择未吸血及饱血后唾液腺进行转录组差异分析筛选关键基因,结果表明大部分细胞自噬相关基因的转录水平无显着变化,而大部分细胞凋亡相关基因的转录水平饱血后显着上升,与饱血后蜱唾液腺细胞凋亡水平显着升高基本一致。二、蜱唾液腺退化中重要的细胞自噬和凋亡分子的基因克隆、序列分析和重组表达根据不同吸血时间唾液腺转录组的分析结果,我们选择其中两个自噬相关（ATG）分子和三个细胞凋亡相关胱天蛋白酶（Caspase）分子开展进一步研究,分别克隆其编码基因。根据序列比对结果,两个ATG分子命名为RhATG5和RhATG6。三个细胞凋亡相关Caspase分子,命名为RhCaspases-7、-8、-9,均具有胱天蛋白酶的保守序列特征。经原核表达获得重组蛋白用于制备多克隆抗体,后续研究奠定了基础。三、RhCaspase-7、-8、-9之间的相互作用及其在蜱唾液腺退化中的作用机制RT-qPCR分析证实,RhCaspase-7、-8、-9的转录水平在每个发育阶段的饱血阶段（饱血幼蜱、饱血若蜱和饱血成蜱）显着升高。饱血后唾液腺中RhCaspases-7、-8、-9的转录水平比其他组织增加也更加显着。RNA干扰RhCaspase-9可显着抑制蜱的吸血,而干扰RhCaspase-7、-8后对蜱的吸血并无影响;与对照组相比,干扰RhCaspase-7、-8和-9后,凋亡水平显着降低。共转染实验表明RhCaspase-7可被RhCaspase-8和RhCaspase-9剪切,表明了RhCaspase-7为效应Caspase分子,而RhCaspase-8和RhCaspase-9为启始Caspase分子。四、RhATG5调控蜱唾液腺退化过程中细胞自噬向细胞凋亡的转化通过western blot检测发现RhATG5在蜱的吸血前期表达量低,后期表达量升高,与凋亡标志分子一致。同时RhATG5在蜱的吸血后期发生剪切。His-RhATG5与μ-Calpain共孵育,结果显示RhATG5在Ca2+存在的条件下可被μ-Calpain剪切。体外培养的蜱的唾液腺组织中加入不同浓度的20E,高浓度的20E处理后,导致蜱唾液腺中的Ca2+浓度和RhCalpains的转录水平表达量升高,RhATG5裂解为NtRhATG5,自噬标志分子降低而凋亡标志分子表达量升高,促进了细胞自噬向细胞凋亡转化。RhATG5的体外RNAi结果显示,唾液腺中的细胞自噬和细胞凋亡均被抑制,证明RhATG5对蜱的细胞自噬和细胞凋亡均有调节作用。上述结果表明,高浓度的20E可通过升高细胞内Ca2+的浓度导致RhATG5的剪切,并引起细胞自噬向细胞凋亡的转化,加快唾液腺的退化进程。五、宿主Beclin-1分子调控唾液腺退化过程中细胞自噬向细胞凋亡的转化通过免疫荧光检测,发现宿主来源的Beclin-1出现在蜱唾液腺退化过程中,且其出现在蜱血淋巴中的时间（吸血第5-7天）要早于蜱唾液腺中（饱血后1-2天）时间。蜱显微注射homo-Beclin-1重组蛋白可引起唾液腺的自噬和凋亡相关分子转录水平和TUNEL染色阳性率的显着升高,与注射20E效果一致。同时注射Beclin-1和20E后,蜱的唾液腺退化进程加快,而当加注自噬和凋亡抑制剂后,自噬和凋亡相关因子转录水平明显降低。Beclin-1被Caspase酶降解是Beclin-1促凋亡作用的机制之一,western blot检测结果表明在快速吸血期蜱唾液腺中宿主来源的Beclin-1发生了剪切。体外共转染实验结果显示,homo-Beclin-1可被三个RhCaspase剪切,而切割位点突变后的homo-Beclin-1不会被剪切。Co-IP结果发现homo-Beclin-1可与RhBCL-2结合形成免疫共沉淀,使RhBCL-2的BH3结构域被封闭,RhBCL-2抗凋亡作用消失,加速细胞凋亡发生。综上所述,本研究表明蜱唾液腺的退化是以细胞凋亡为主,细胞自噬参与的细胞程序化死亡的过程。快速吸血期,血淋巴中蜕皮激素浓度升高,Ca2+浓度升高,导致自噬分子ATG5发生剪切,细胞自噬转化为细胞凋亡;另一方面,宿主Beclin-1分子在唾液腺内发生累积,可被蜱源的Caspase剪切,或通过与蜱源BCL-2的结合,进一步促进细胞自噬向细胞凋亡转化,加快唾液腺的退化进程。因此,蜱唾液腺退化过程中,蜱自噬分子ATG5和宿主来源的Beclin-1发挥了细胞自噬和凋亡之间的分子联络作用。
王兵[8]（2020）在《MDM2/MDMX-p53通路在肿瘤及其微环境中的功能研究》文中研究指明p53作为重要的肿瘤抑制因子,几乎在所有的人类肿瘤中都出现功能缺失。目前已有许多p53的激活剂被开发成肿瘤治疗药物,但是由于激活p53对正常组织带来的安全问题限制了其治疗效果。MDM2和MDMX是p53关键的两个负调控蛋白,MDM2与MDMX形成异源二聚体负责p53最核心的调控机制。对于生理状态下MDM2/MDMX异二聚体在成体中对p53的调控作用鲜有研究。肿瘤细胞与周围的基质组织和浸润的免疫细胞等共同构成复杂的肿瘤微环境,肿瘤免疫抑制的微环境干预着肿瘤的预后和治疗效果。肿瘤微环境中p53的失活也有助于免疫抑制微环境的形成。但是MDM2/MDMX-p53信号通路在肿瘤细胞和肿瘤微环境中的作用和具体调控机制仍不清楚。本论文主要以MdmxC462A和MdmxS314A两种突变小鼠为实验模型,分别探究了MDM2/MDMX异二聚体在生理状态、肿瘤及其微环境中对p53的调控以及p53发挥功能的机制。获得了如下的研究结果:（1）在生理状态下,利用时间特异性诱导表达的CreER MdmxC462A小鼠模型,克服了MdmxC462A/C462A胚胎致死的问题,MDMX RING结构域突变打开MDM2/MDMX异二聚体后未检测到p53的活性,小鼠脏器未出现病理变化,证明了该异二聚体在成体中对p53的调控并不是必需的。（2）在肿瘤发生发展过程中,以全身表达的ACTB-Cre MdmxC462A小鼠为模型,通过与E?-Myc小鼠杂交和不同p53功能突变质粒的转染,发现了部分打开的MDM2/MDMX异二聚体可以预保留p53的水平,预保留的p53以转录非依赖的方式在体外抑制MEF细胞的生长,在体内抑制淋巴瘤的发生。（3）在肿瘤微环境中,首次构建了MdmxS314A磷酸化突变的小鼠模型,利用该模型小鼠和原代骨髓来源巨噬细胞,通过皮下注射成瘤、流式分析、实时荧光定量PCR和组织免疫荧光等手段,发现Mdmx-S314A磷酸化突变介导的基质组织中p53上调可以通过提高肿瘤微环境中多种免疫细胞的浸润和M1型巨噬细胞的极化逆转免疫抑制的微环境进而抑制肿瘤的生长,提供了微环境中p53调控免疫状态的新功能。以上结果表明通过MDMX RING结构域或者磷酸化位点的突变靶向MDM2/MDMX异二聚体在正常生理状态下不影响p53的活性,揭示了预保留的p53非转录激活抑制肿瘤的新方式和调控肿瘤免疫微环境的新功能,这为利用MDM2/MDMX-p53通路开发更安全有效的肿瘤治疗手段提供了新的思路和理论依据。
朱医高[9]（2020）在《脊椎动物肿瘤坏死因子受体超家族成员进化分析和七鳃鳗tnfr10-like功能初探》文中进行了进一步梳理肿瘤坏死因子受体超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily,TNFRSF）是重要的细胞因子受体同时也是一个古老的蛋白质超家族,研究表明TNFRSF参与炎症反应、细胞凋亡、淋巴细胞内稳态和组织发育等事件,在脊椎动物免疫系统中发挥重要的作用。七鳃鳗作为研究发育进化的模式生物,到目前为止,关于TNFRs在七鳃鳗基因组中含有的数目、蛋白质结构和体内发挥的作用仍然是未知的,为此开展了本文研究。1.利用雷氏七鳃鳗数据库筛选出7个七鳃鳗TNFR成员（L-TNFR1、5、10B、11B、16、21和10-like）,通过构建系统发育树、保守的蛋白质结构域、蛋白质基序、同线性和基因结构分析对L-TNFRs成员同其他脊椎动物TNFRs成员从进化角度进行比较。明确了七鳃鳗基因组中TNFRs家族成员在进化分支中处于其他脊椎动物TNFRs成员的外群并且在基因结构和蛋白质结构上是保守的,贯穿从低等脊椎动物到高等脊椎动物的进化过程。研究还发现L-tnfrs邻近基因同其他脊椎动物tnfrs邻近基因相比存在巨大的差异,脊椎动物tnfrs与邻近基因间形成基因连锁关系起始于两栖类或者硬骨鱼类。2.通过绘制热图明确了L-tnfrs基因在不同组织中的含量情况并结合实时定量检测技术检测L-tnfrs基因应答病原菌入侵后在转录水平上的变化。L-tnfrs基因在七鳃鳗肠、鳃和白细胞中含量丰富并且能够对病原菌的入侵产生免疫应答,应答方式与病原菌的种类存在相关性。3.利用分子生物学技术分别构建p ET-32a-L-tnfr10-like和p EGFP-N1-L-tnfr10-like原核表达载体和真核表达载体,分离纯化重组蛋白L-TNFR10-like并制备多克隆抗体。通过体内和体外实验对L-TNFR10-like分子的功能进行了初步探究。体外实验表明L-TNFR10-like特异性高表达于七鳃鳗粒细胞中,同时也高表达于七鳃鳗纵褶和鳃组织血管上皮细胞中,参与免疫防御反应;体内实验表明过表达L-tnfr10-like基因的细胞,细胞活力显着下降且能激活NF-κB转录因子,这与高等脊椎动物TNFR10A/10B成员在功能上存在相似性。本文一方面从进化角度对无颌类脊椎动物七鳃鳗TNFRs成员同有颌类脊椎动物TNFRs成员进行了比较分析,对揭示TNFRs成员在脊椎动物进化中发生的变化提供参考;另一方面从组织分布及功能上对七鳃鳗TNFR成员进行了初探,证明了TNFRs成员在七鳃鳗免疫防御中发挥重要的作用;此外,证实了L-TNFR10-like分子可作为七鳃鳗粒细胞的标记分子并对其在七鳃鳗固有免疫防御中发挥的作用有了初步认识,为将来对其进行深入研究奠定了基础。
孟鑫[10]（2020）在《Akkermansia muciniphila源蛋白酶Amuc-1434对Muc2的降解及其抑制结直肠癌LS174T细胞增殖的研究》文中研究表明肠道菌群在人类健康和疾病中起着重要的作用。肠黏膜表面的黏膜层是肠细胞与肠道菌群相互作用的场所,对维持肠道健康和肠道微生态平衡至关重要。黏蛋白2（Muc2）是肠黏膜层的主要成分。黏蛋白基因家族中有17个人类黏蛋白基因,根据其不同的结构主要分为分泌型黏蛋白和膜结合型黏蛋白两大类,其中Muc2是第一个被克隆并完全测序的人类分泌型黏蛋白基因,它主要由人结肠和小肠的杯状细胞表达,是小肠和大肠黏液的主要成分。Muc2已被证明是对抗外部病原体的重要保护屏障,与多种癌症疾病相关,如结直肠癌（CRC）、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌。在CRC中Muc2过表达有助于肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫效应分子的识别从而促进CRC的发展。Akkermansia muciniphila是肠道菌群的重要组成部分,具有多种生物学功能,如通过自身的蛋白水解酶调节Muc2的水平。Akkermansia muciniphila利用黏蛋白作为其生长唯一的碳源和氮源,还能产生多种降解黏蛋白的蛋白,但目前尚不清楚哪些蛋白可以降解黏蛋白。本论文工作主要包括三个部分:第一部分,从Akkermansia muciniphila基因库中选择一个编码假定蛋白的基因Amuc-1434,通过原核表达系统纯化重组蛋白Amuc-1434,探究其活性和基本的酶学性质。第二部分,主要制备和评估重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体,研究重组蛋白Amuc-1434与结直肠癌细胞系LS174T细胞表达的Muc2之间的相互作用和其降解Muc2的能力,并研究蛋白Amuc-1434在小鼠肠道中的表达位置。第三部分,主要探究重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞增殖、周期、凋亡、ROS水平和线粒体膜电位的影响及其发挥作用的机制。第一部分:重组蛋白Amuc-1434的纯化、活性鉴定、酶学性质及其活性位点的初步探究首先委托华大基因（公司）全基因合成了含有组氨酸标签的Amuc-1434重组质粒,重组的Amuc-1434以pET25b（+）为载体,酶切位点为BamH?和Xho?。将重组的Amuc-1434转到表达菌E.coli Rosetta感受态细胞中,经氨苄和氯霉素抗性筛选得到E.coli Rosetta-pET25b（+）-Amuc-1434转化子,通过对诱导条件的优化,确定在诱导时间为4 h、诱导剂IPTG浓度为1.0 mM、诱导温度为37℃条件下可以实现重组蛋白Amuc-1434的可溶表达。采用Ni2+-NTA亲和层析纯化了重组蛋白Amuc-1434,并通过Western blot鉴定了纯化结果。在接下来的测活实验中,通过紫外分光光度法发现重组蛋白Amuc-1434能够水解血红蛋白,活性为17.21 U/μg。通过动力学分析发现重组蛋白Amuc-1434对血红蛋白的Km值为0.22μM,Vmax值为0.26μM/min,Kcat值为0.18 min-1,催化效率(Kcat/Km)为0.82/min/μM。我们还发现重组蛋白Amuc-1434的浓度与水解血红蛋白的酶促反应速率呈正相关。重组蛋白Amuc-1434于pH 8.0和40℃条件下具有最佳水解活性,并且在40℃下具有良好的热稳定性,半衰期大于4 h。通过抑制剂Pepstatin A预处理,我们鉴定出重组蛋白Amuc-1434属于天冬氨酸蛋白酶家族的一员。通过不同金属离子预处理,我们发现Ca2+和Mn2+的存在能够显着提高重组蛋白Amuc-1434的活性。随后,我们发现将重组蛋白Amuc-1434含有的天冬氨酸蛋白酶保守位点“DTG”和“LLG”突变为“AAA”后,得到的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG仍然具有活性,为此,我们得出结论蛋白Amuc-1434的活性中心与“DTG”和“LLG”无关,可能涉及其序列中的其他天冬氨酸。第二部分:重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体的制备、对Muc2的降解及其在小鼠肠道中表达位置的研究本研究制备了重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体,通过ELISA检测其效价为1:4000,通过Western blot验证其特异性良好,通过HPLC鉴定其纯度可达89.72%。Dot-blot实验和细胞黏附实验表明,重组蛋白Amuc-1434与LS174T细胞表达的Muc2之间存在相互作用,并且重组蛋白Amuc-1434浓度越高,它们之间相关作用越强。ELISA实验发现这两个蛋白间的作用表现为重组蛋白Amuc-1434对Muc2的降解作用。此外,Western blot和免疫荧光实验也发现重组蛋白Amuc-1434可以降解Muc2。随后,通过免疫组化实验发现蛋白Amuc-1434主要表达在BALB/c小鼠的结肠中。第三部分:重组蛋白Amuc-1434对结直肠癌细胞LS174T增殖的抑制作用及机制的研究本研究通过MTT法发现重组蛋白Amuc-1434可以抑制LS174T细胞增殖,并且和其降解Muc2的能力有关。流式细胞术分析显示重组蛋白Amuc-1434会使LS174T细胞周期阻滞在G1期,并且上调细胞周期相关蛋白p53的表达。流式细胞术分析还表明重组蛋白Amuc-1434促进LS174T细胞凋亡,也能升高LS174T细胞内和线粒体相关的ROS水平。荧光显微镜观察表明重组蛋白Amuc-1434下调LS174T细胞线粒体膜电位。本研究通过Western blot发现重组蛋白Amuc-1434通过上调死亡配体TRAIL和与之结合的死亡受体DR4和DR5的表达激活了外源性死亡受体途径,活化形式的Caspase 8和Caspase 3被检测到表达上调,这可能是重组蛋白Amuc-1434促进LS174T细胞凋亡和抑制LS174T细胞增殖的原因。我们还发现由于Caspase 8的激活,重组蛋白Amuc-1434又间接激活线粒体途径,引起线粒体途径中凋亡相关蛋白表达的变化。研究结果显示,重组蛋白Amuc-1434诱导促凋亡蛋白Bid和Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,线粒体释放因子CytC、EndoG以及活化形式的Caspase 9表达上调,从而促进LS174T细胞凋亡。本篇论文首次表达纯化了来源于Akkermansia muciniphila的假定蛋白Amuc-1434,并发现其基本的酶学性质和天冬氨酸蛋白酶的属性,同时发现重组蛋白Amuc-1434具有降解Muc2的能力和通过上调TRAIL的表达激活细胞凋亡途径进而抑制LS174T细胞增殖的功能特性。
二、Cloning and identifying of a novel protein binding with death domain of the death receptor 4（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Cloning and identifying of a novel protein binding with death domain of the death receptor 4（论文提纲范文）
（1）甜瓜CmBAG6-2基因在其果实发育中功能的初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 一 引言 |
| 1.1 甜瓜 |
| 1.2 BAG家族研究进展 |
| 1.2.1 哺乳动物BAG家族研究进展 |
| 1.2.2 植物BAG家族的研究进展 |
| 1.2.3 拟南芥BAG蛋白的作用 |
| 1.2.4 植物BAG与植物激素的研究 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 二 材料和方法 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验菌株和载体 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 生物信息学分析 |
| 2.3 CmBAG6-2 基因表达模式分析 |
| 2.3.1 甜瓜各组织RNA的提取 |
| 2.3.2 CmBAG6-2 基因表达模式分析 |
| 2.4 CmBAG6-2 基因的cDNA克隆与超表达载体构建 |
| 2.4.1 CmBAG6-2 基因cDNA片段扩增 |
| 2.4.2 克隆载体检测 |
| 2.4.3 双酶切反应 |
| 2.4.4 重组质粒筛选与鉴定 |
| 2.5 CmBAG6-2 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载体构建 |
| 2.5.1 sgRNA靶向序列的选择及接头引物的设计 |
| 2.5.2 靶位点接头制备 |
| 2.5.3 sgRNA表达盒构建 |
| 2.5.4 sgRNA表达盒组装进双元载体并转化 |
| 2.5.5 重组质粒筛选与测序 |
| 2.6 CmBAG6-2 基因在甜瓜果实中的瞬时表达 |
| 2.6.1 CmBAG6-2 基因表达载体转化农杆菌感受态细胞 |
| 2.6.2 农杆菌侵染液的制备 |
| 2.6.3 CmBAG6-2 基因在甜瓜果实中的瞬时表达 |
| 2.7 CmBAG6-2 蛋白亚细胞定位 |
| 2.7.1 CmBAG6-2 基因目的片段的获取 |
| 2.7.2 重组质粒筛选与鉴定 |
| 2.7.3 侵染本氏烟草 |
| 2.8 甜瓜的遗传转化与T_1代转化植株的检测 |
| 2.8.1 甜瓜的遗传转化 |
| 2.8.2 T_1代转化植株载体检测 |
| 2.8.3 T_1代转基因植株基因编辑位点突变检测 |
| 2.9 CmBAG6-2 基因在T_1代果实中表达特性分析 |
| 2.10 T_1代甜瓜果实农艺性状测定 |
| 2.11 T_2代植株载体检测 |
| 2.12 盐胁迫对T_2代种子的萌发和及幼苗生长的影响 |
| 2.12.1 NaCl浓度的选择 |
| 2.12.2 T_2代种子的盐胁迫处理 |
| 2.12.3 高盐胁迫对T_2代超表达种子萌发的影响 |
| 2.13 差异基因筛选 |
| 2.14 酵母单杂交分析CmBAG6-2 启动子与转录因子的结合作用 |
| 2.14.1 目的片段的克隆 |
| 2.14.2 重组质粒筛选与鉴定 |
| 2.14.3 重组质粒转化Y1H Gold酵母菌株感受态细胞 |
| 2.14.4 抑制Bait菌株生长的Ab A浓度筛选 |
| 2.14.5 酵母表达载体转化Bait酵母菌株感受态细胞 |
| 2.14.6 靶蛋白与启动子结合作用的验证 |
| 2.15 酵母双杂交筛选互作蛋白 |
| 2.15.1 目的基因的克隆 |
| 2.15.2 重组质粒筛选与鉴定 |
| 2.15.3 重组质粒转化AH109 酵母菌株感受态细胞 |
| 2.15.4 CmBAG6-2 与候选互作蛋白在酵母中的相互作用 |
| 三 实验结果 |
| 3.1 生物信息学分析 |
| 3.1.1 甜瓜BAG蛋白家族鉴定 |
| 3.1.2 保守结构域和保守位点分析 |
| 3.1.3 CmBAG6-2 蛋白质磷酸化位点分析 |
| 3.1.4 CmBAG6-2 蛋白质二级结构分析 |
| 3.1.5 CmBAG6-2 的启动子序列分析 |
| 3.2 CmBAG6-2 基因的表达模式 |
| 3.3 CmBAG6-2 基因cDNA克隆及超表达载体构建 |
| 3.3.1 CmBAG6-2 基因cDNA克隆 |
| 3.3.2 克隆载体重组质粒筛选 |
| 3.3.3 CmBAG6-2 基因超表达载体构建 |
| 3.4 CmBAG6-2 基因的CRISPR/Cas9 基因编辑载体构建 |
| 3.4.1 构建sgRNA表达盒 |
| 3.4.2 编辑载体重组质粒鉴定 |
| 3.5 瞬时表达分析CmBAG6-2 基因的功能 |
| 3.5.1 CmBAG6-2 基因表达载体转化农杆菌感受态 |
| 3.5.2 瞬时表达鉴定CmBAG6-2 基因的功能 |
| 3.6 CmBAG6-2 亚细胞定位分析 |
| 3.6.1 重组质粒的构建、筛选与鉴定 |
| 3.6.2 CmBAG6-2 蛋白亚细胞定位结果 |
| 3.7 T_1代转化植株的筛选 |
| 3.8 CmBAG6-2 基因在T_1代果实中表达特性 |
| 3.9 T_1代甜瓜果实农艺性状统计 |
| 3.10 T_2代转基因植株的筛选 |
| 3.11 盐胁迫对T_2代超表达种子萌发及幼苗生长的影响 |
| 3.11.1 T_2代超表达植株盐耐受性分析 |
| 3.11.2 高盐胁迫中T_2代超表达种子萌发能力的分析 |
| 3.12 差异基因的筛选 |
| 3.13 调控CmBAG6-2 表达的果实发育和应激反应相关转录因子筛选 |
| 3.13.1 重组质粒构建、筛选与鉴定 |
| 3.13.2 重组质粒转化酵母菌株 |
| 3.13.3 抑制Bait菌株生长的AbA浓度的筛选 |
| 3.13.4 CmBAG6-2 与果实发育和应激反应相关转录因子相互作用的鉴定 |
| 3.14 CmBAG6-2 互作蛋白筛选 |
| 3.14.1 诱饵载体与捕获载体的构建 |
| 3.14.2 重组质粒酶切验证 |
| 3.14.3 CmBAG6-2 互作蛋白的筛选 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1 英文缩略词对照表 |
| 附录2 实验材料与引物一览表 |
（2）蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B和SHP2变构调节机制的分子动力学模拟研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| §1.1 生物信息学简介 |
| §1.2 蛋白质结构预测 |
| §1.3 计算机模拟概述 |
| §1.4 蛋白质酪氨酸磷酸酶简介 |
| §1.4.1 PTP1B蛋白的结构与功能 |
| §1.4.2 PTP1B抑制剂 |
| §1.4.3 SHP2蛋白的结构与功能 |
| §1.4.4 SHP2蛋白与疾病相关 |
| §1.5 选题依据 |
| §1.6 技术路线 |
| §1.7 研究目的和研究内容 |
| 第2章 理论基础和计算方法 |
| §2.1 分子力场 |
| §2.1.1 分子力场函数简介 |
| §2.1.2 常用分子力场 |
| §2.2 分子力学 |
| §2.2.1 一次导数求极值法 |
| §2.2.2 二次导数求极值法 |
| §2.3 分子动力学 |
| §2.3.1 基本理论 |
| §2.3.2 积分算法 |
| §2.3.3 积分步长的选取 |
| §2.3.4 周期性边界条件与长程静电力 |
| §2.3.5 平衡系统分子动力学模拟的系综 |
| §2.3.6 常规分子动力学计算流程 |
| §2.3.7 分子动力学模拟的初始条件 |
| §2.4 分子对接 |
| §2.5 结合自由能计算 |
| §2.5.1 自由能微扰和热力学积分方法的基本原理 |
| §2.5.2MM-PB/GBSA方法的基本原理 |
| 第3章 PTP1B变构调节机制的分子动力学模拟研究 |
| §3.1 引言 |
| §3.2 计算细节 |
| §3.2.1 分子动力学模拟 |
| §3.2.2 聚类分析 |
| §3.2.3 结合自由能及分解能分析 |
| §3.3 结果与讨论 |
| §3.3.1 不同体系的整体结构分析 |
| §3.3.2 聚类分析 |
| §3.3.3WPD loop在自然状态下会保持一种动态的构象 |
| §3.3.4 氢键网络分析 |
| §3.3.5不同的解离状态影响TCS401对PTP1B的结合能力 |
| §3.4 本章小结 |
| 第4章 SHP2变构调节机制的分子动力学模拟研究 |
| §4.1 引言 |
| §4.2 计算细节 |
| §4.2.1 模型准备 |
| §4.2.2 分子动力学模拟 |
| §4.2.3 结合自由能及分解能分析 |
| §4.2.4 主成分分析及FEL |
| §4.3 结果与讨论 |
| §4.3.1 整体结构分析 |
| §4.3.2 结合自由能及分解能分析 |
| §4.3.3 氢键网络分析 |
| §4.3.4 主成分分析及主成分投影图 |
| §4.3.5 相关性分析 |
| §4.3.6 ITIM和ITSM的结合改变了SHP2蛋白的FEL |
| §4.4 本章小结 |
| 第5章 不同EPIYA多肽变构激活SHP2机制的分子动力学模拟 |
| §5.1 引言 |
| §5.2 计算细节 |
| §5.2.1 模型准备 |
| §5.2.2 分子动力学模拟 |
| §5.2.3 结合自由能计算 |
| §5.2.4 主成分分析及FEL |
| §5.3 结果与讨论 |
| §5.3.1 整体结构分析 |
| §5.3.2 结合自由能及分解能分析 |
| §5.3.3 氢键分析 |
| §5.3.4 主成分分析及FEL |
| §5.3.5 主成分投影图 |
| §5.3.6 相关性分析 |
| §5.4 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介及攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9及其特异性纳米抗体的结构解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展 |
| 1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒概况 |
| 1.1.2 PRRSV基因组构成 |
| 1.1.3 PRRSV感染有关的细胞的受体及因子 |
| 1.1.4 PRRSV致病的分子机制 |
| 1.2 PRRSV Nsp9概述 |
| 1.3 PRRSV防控策略 |
| 1.3.1 PRRSV入侵阻断剂 |
| 1.3.2 PRRSV感染过程中宿主miRNAs的抗病毒作用 |
| 1.3.3 基于反义RNA的策略作为PRRSV特异性疗法 |
| 1.3.4 草药提取物和化合物抑制PRRSV |
| 1.3.5 抗PRRSV的纳米抗体 |
| 1.3.6 免疫刺激剂及其作为PRRSV疫苗佐剂的潜力 |
| 1.3.7 当前的挑战和未来的研究方向 |
| 1.4 X-射线小角散射概述 |
| 1.4.1 SAXS在结构分析中的应用 |
| 1.4.2 展望 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PRRSV Nsp9的生物学结构研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 Nsp9重组蛋白的表达纯化 |
| 2.2.2 Nsp9重组蛋白的晶体生长 |
| 2.2.3 Nsp9重组蛋白结构预测 |
| 2.2.4 Nsp9截短片段的扩增以及原核表达载体的构建 |
| 2.2.5 分析Nsp9截短蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.2.6 测量Nsp9重组蛋白的粒径大小 |
| 2.2.7 Nsp9 重组蛋白SAXS分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Nsp9重组蛋白的纯化 |
| 2.3.2 Nsp9重组蛋白预测的结构 |
| 2.3.3 Nsp9截短片段原核表达载体的构建以及表达 |
| 2.3.4 Nsp9重组蛋白DLS分析 |
| 2.3.5 Nsp9SAXS分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 Nsp9 特异的纳米抗体Nb6和Nb7的生物学结构研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、菌株和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 基因扩增及表达载体的构建 |
| 3.2.2 Nb6/Nb7重组蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 |
| 3.2.3 Nb6/Nb7重组蛋白在巴斯德毕氏酵母X-33中的克隆、表达和纯化 |
| 3.2.4 在酵母中表达的Nb6/Nb7重组蛋白的晶体生长 |
| 3.2.5 Nb7重组蛋白晶体数据收集与处理 |
| 3.2.6 解析Nb7重组蛋白的晶体结构 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 pMECS-Nb6/Nb7原核表达载体的构建 |
| 3.3.2 Nb6/Nb7重组蛋白在大肠杆菌中周质中的表达及纯化 |
| 3.3.3 pPICZαA-Nb6/Nb7重组表达载体的构建 |
| 3.3.4 Nb6/Nb7重组蛋白在酵母中的表达分析 |
| 3.3.5 Nb6/Nb7重组蛋白的纯化 |
| 3.3.6 Nb6/Nb7重组蛋白结晶及条件优化 |
| 3.3.7 Nb7重组蛋白的晶体数据收集、处理及结构解析 |
| 3.3.8 Nb7重组蛋白晶体结构 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Nsp9 上影响PRRSV复制关键氨基酸位点分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂耗材 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 BLI分析Nsp9重组蛋白与Nb6之间的亲和力大小 |
| 4.2.2 Nsp9-Nb6复合物的纯化 |
| 4.2.3 测量Nsp9-Nb6复合物的粒径大小 |
| 4.2.4 Nsp9-Nb6复合物蛋白晶体生长条件筛选 |
| 4.2.5 Nsp9-Nb6 复合物SAXS分析 |
| 4.2.6 Nb6突变体蛋白的表达和纯化 |
| 4.2.7 Nsp9突变体蛋白的表达和纯化 |
| 4.2.8 Nb6突变体蛋白与Nsp9之间的亲和力测定 |
| 4.2.9 Nsp9突变体蛋白与Nb6之间的亲和力测定 |
| 4.2.10 突变病毒的构建及鉴定 |
| 4.2.11 突变病毒的拯救 |
| 4.2.12 拯救病毒的鉴定 |
| 4.2.13 重组病毒的病毒滴度测定 |
| 4.2.14 重组病毒的增殖特性分析 |
| 4.2.15 Nsp9上的氨基酸替换对病毒RNA相对水平的影响 |
| 4.2.16 Nsp9上的氨基酸替换对病毒负链基因组RNA水平的影响 |
| 4.2.17 Nsp9上的氨基酸替换对病毒感染水平的影响 |
| 4.2.18 对PRRSV Nsp9中氨基酸残基561-689进行序列比对 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Nb6和Nsp9之间亲和力的测定 |
| 4.3.2 Nb6与Nsp9复合物的纯化 |
| 4.3.3 DLS检测分析 |
| 4.3.4 Nsp9-Nb6复合物SAXS分析 |
| 4.3.5 Nsp9-Nb6复合物相互作用位点分析 |
| 4.3.6 突变质粒的构建 |
| 4.3.7 突变病毒的拯救 |
| 4.3.8 拯救病毒的核酸检测 |
| 4.3.9 Nsp9上参与病毒复制的关键氨基酸位点鉴定 |
| 4.3.10 病毒感染能力检测 |
| 4.3.11 I588、L643在Nsp9的保守性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 细胞凋亡与肿瘤治疗 |
| 1.2.2 可变剪接与肿瘤治疗 |
| 1.2.3 凋亡因子Mcl-1可变剪接与肿瘤 |
| 1.2.4 空间阻滞寡核苷酸应用现状 |
| 1.2.5 小结 |
| 1.3 主要研究内容与研究方案 |
| 1.4 研究意义 |
| 第二章 Mcl-1可变剪接与胃癌的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验仪器和设备 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 实验对象 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Mcl-1表达与胃癌的相关性 |
| 2.3.2 Mcl-1 可变剪接异构体mRNA在胃癌组织中的表达 |
| 2.3.3 Mcl-1S和 Mcl-1L mRNA表达与胃癌临床进展的相关性 |
| 2.3.4 胃癌组织Mcl-1L与 Mcl-1S表达的蛋白水平验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验仪器和设备 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 实验对象 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌细胞株 Mcl-1L 及 Mcl-1S 基础表达 |
| 3.3.2 空间阻滞寡合苷酸(SBOs)转染效率评价 |
| 3.3.3 SBOs 对 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 3.3.4 SBOs对胃癌细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.3.5 SBOs对胃癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导凋亡的体内实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验仪器和设备 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 研究对象 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 SBOs对裸鼠的毒性反应 |
| 4.3.2 SBOs 治疗对移植瘤体 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 4.3.3 SBOs 治疗对移植瘤体细胞凋亡的诱导作用 |
| 4.3.4 SBOs 对移植瘤增殖生长的抑制作用 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）靶向肿瘤凋亡相关靶标的先导化合物发现及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 靶向细胞凋亡相关靶标蛋白及药物研发进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 细胞凋亡的两种基本途径 |
| 1.1.1.1 外部途径:死亡受体途径 |
| 1.1.1.2 内部途径:线粒体途径 |
| 1.1.1.3 细胞凋亡的生物学意义 |
| 1.1.2 细胞凋亡与肿瘤发生发展的关系 |
| 1.2 调控肿瘤凋亡信号通路的重要靶标:BCL-2和IAP家族蛋白 |
| 1.2.1 BCL-2 家族蛋白的生物学功能及小分子抑制剂研究 |
| 1.2.1.1 BCL-2 家族蛋白的生物学功能 |
| 1.2.1.2 BCL-2 家族蛋白的小分子抑制剂研究进展 |
| 1.2.2 IAP家族蛋白的生物学功能及小分子抑制剂研究 |
| 1.2.2.1 IAP家族蛋白的生物学功能 |
| 1.2.2.2 靶向IAP家族蛋白的小分子抑制剂 |
| 1.3 调控肿瘤细胞凋亡的孤儿核受体:以Nur77 为例 |
| 1.3.1 Nur77 诱导细胞凋亡的具体机制 |
| 1.3.2 靶向Nur77 诱导凋亡的小分子 |
| 1.4 调控肿瘤细胞凋亡新思路:直接靶向活性氧含量变化相关蛋白 |
| 1.5 总结与展望 |
| 第二章 细胞凋亡抑制蛋白1的构象变化及天然产物抑制剂发现 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 野型cIAP1 蛋白和E447K突变型cIAP1 蛋白的分子动力学模拟 |
| 2.2.2 分子动力学模拟的轨迹分析 |
| 2.2.3 野型cIAP1及D303A突变型cIAP1 蛋白的质粒构建与表达纯化 |
| 2.2.4 非变性凝胶电泳实验 |
| 2.2.5 小分子诱导蛋白热迁移变化的高通量筛选 |
| 2.2.6 微量热泳动检测小分子与cIAP1 蛋白的结合强度 |
| 2.2.7 细胞增殖实验 |
| 2.2.8 高内涵细胞凋亡形态检测 |
| 2.2.9 流式细胞凋亡检测与分析 |
| 2.2.10 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 野型cIAP1 蛋白的分子动力学模拟分析 |
| 2.3.2 E447K突变型cIAP1 蛋白的分子动力学模拟 |
| 2.3.3 野型cIAP1及E447K突变型cIAP1 蛋白构象变化的机理分析 |
| 2.3.4 野型cIAP1及E447K突变型cIAP1 蛋白构象变化最显着区域的动态二级结构分析 |
| 2.3.5 新型D303A突变型cIAP1 蛋白的设计和非变性凝胶实验分析 |
| 2.3.6 靶向cIAP1 的天然产物小分子筛选 |
| 2.3.7 MST检测苗头天然产物小分子与cIAP1 的结合亲和力 |
| 2.3.8 细胞增殖抑制实验 |
| 2.3.9 流式细胞凋亡分析 |
| 2.3.10 凋亡的细胞核形态分析 |
| 2.3.11 细胞水平诱导cIAP1 降解及凋亡相关蛋白调控变化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 Nur77 蛋白的分子动力学模拟及天然产物小分子发现 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 Nur77 蛋白及复合物的分子动力学模拟 |
| 3.2.2 分子动力学模拟轨迹的数据分析及作图 |
| 3.2.3 Nur77 质粒构建、蛋白表达及纯化 |
| 3.2.4 小分子作用于Nur77 的蛋白热迁移实验 |
| 3.2.5 小分子作用于Nur77 的微量热泳动分析 |
| 3.2.6 小分子作用于Nur77 的表面等离子共振实验 |
| 3.2.7 细胞增殖实验 |
| 3.2.8 高内涵细胞凋亡形态检测 |
| 3.2.9 流式细胞仪细胞凋亡分析 |
| 3.2.10 线粒体膜电位检测和线粒体活性氧检测 |
| 3.2.11 转录组学样品准备及数据的采集分析 |
| 3.2.12 定量蛋白组学样品准备及分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Nur77 蛋白及复合物三组体系分子动力学轨迹RMSD分析 |
| 3.3.2 Nur77 蛋白及复合物三组体系分子动力学轨迹RMSF分析 |
| 3.3.3 Nur77 蛋白及复合物三组体系的DSSP分析 |
| 3.3.4 Nur77 蛋白及复合物三组分子动力学模拟体系的结构聚类分析 |
| 3.3.5 靶向Nur77 的天然产物小分子筛选 |
| 3.3.6 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I靶向Nur77 的表面等离子共振结合分析 |
| 3.3.7 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I作用于Nur77 的微量热泳动结合分析 |
| 3.3.8 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I常见肿瘤细胞系增殖抑制分析 |
| 3.3.9 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I细胞凋亡的流式分析 |
| 3.3.10 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I诱导细胞核形态变化分析 |
| 3.3.11 线粒体膜电位和线粒体活性氧检测与分析 |
| 3.3.12 转录组学差异表达基因及KEGG通路分析 |
| 3.3.13 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I的差异蛋白组学数据分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 活性氧调控关键蛋白过氧化物氧化还原酶1的先导化合物发现与机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.2.1 PRDX1 蛋白的表达纯化 |
| 4.2.2 新型PRDX1 抑制剂的共价虚拟筛选及活性确证 |
| 4.2.3 PRDX1 蛋白结晶条件的筛选与优化 |
| 4.2.4 PRDX1 复合物晶体结构解析 |
| 4.2.5 SPR和 MST实验检测小分子的结合强度检测 |
| 4.2.6 细胞增殖及细胞凋亡检测 |
| 4.2.7 流式分化检测 |
| 4.2.8 细胞活性氧检测 |
| 4.2.9 转录组学测序数据的采集与分析 |
| 4.2.10 细胞凋亡调控通路分析 |
| 4.2.11 蛋白免疫印迹实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 新型PRDX1 抑制剂的发现及活性检测 |
| 4.3.2 PRDX1 蛋白结晶条件优化和复合物晶体结构解析 |
| 4.3.3 新型PRDX1 抑制剂的结合强度检测 |
| 4.3.4 小分子的细胞增殖抑制 |
| 4.3.5 NB4 细胞分化流式分析 |
| 4.3.6 细胞凋亡和活性氧检测 |
| 4.3.7 细胞凋亡通路和机制探索 |
| 4.3.8 小分子作用的转录组学数据分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 论文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 急性髓系白血病治疗研究进展 |
| 1.1.1 急性髓系白血病 |
| 1.1.2 AML治疗现状 |
| 1.1.3 AML的新型疗法 |
| 1.2 溶瘤腺病毒与AML治疗 |
| 1.2.1 溶瘤病毒 |
| 1.2.2 溶瘤腺病毒 |
| 1.2.3 溶瘤腺病毒治疗AML的限制 |
| 1.3 溶瘤腺病毒的改造策略 |
| 1.3.1 溶瘤腺病毒的肿瘤靶向策略 |
| 1.3.2 基于pIX的靶向性改造 |
| 1.3.3 TRAIL修饰溶瘤腺病毒 |
| 1.4 立题依据与论文设计 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 设计思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、仪器设备与常用试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 常用试剂及缓冲液配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 蛋白表达及纯化 |
| 2.2.3 SDS-PAGE |
| 2.2.4 Western Blot |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.6 MTT法检测腺病毒诱导的细胞死亡 |
| 2.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 重组腺病毒扩增 |
| 2.2.9 重组腺病毒纯化 |
| 2.2.10 腺病毒的体内注射后肿瘤靶向检测 |
| 2.2.11 溶瘤腺病毒体内抗肿瘤活性检测 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 急性髓系白血病细胞系及样本受体表达分析 |
| 3.1.1 不同急性髓系白血病细胞株相关受体表达 |
| 3.1.2 急性髓系白血病样本相关受体表达检测 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 sTRAIL与zipper融合表达质粒的构建及蛋白表达纯化 |
| 3.2.1 sTRAIL与zipper融合表达质粒的构建 |
| 3.2.2 重组z-sTRAIL蛋白的表达纯化 |
| 3.2.3 小结 |
| 3.3 重组溶瘤腺病毒的优化 |
| 3.3.1 重组溶瘤腺病毒的体外优化 |
| 3.3.2 优化后重组溶瘤腺病毒zA4性质评价 |
| 3.3.3 重组溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性分析 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 重组溶瘤腺病毒体外抗AML检测 |
| 3.4.1 重组溶瘤腺病毒对AML细胞系感染性差异分析 |
| 3.4.2 重组溶瘤腺病毒体外抗AML活性 |
| 3.4.3 小结 |
| 3.5 重组溶瘤腺病毒体内抗AML评价 |
| 3.5.1 重组溶瘤腺病毒体内靶向效果评价 |
| 3.5.2 重组溶瘤腺病毒皮下荷瘤模型抗AML活性 |
| 3.5.3 重组溶瘤腺病毒体内肝肾毒性检测 |
| 3.5.4 重组溶瘤腺病毒静脉荷瘤模型抗AML活性 |
| 3.5.5 小结 |
| 3.6 Rh2 联合重组溶瘤腺病毒体外抗肿瘤效果评价 |
| 3.6.1 MTT法检测Rh2联合sTRAIL对THP-1细胞体外杀伤评价 |
| 3.6.2 Rh2联合sTRAIL诱导细胞凋亡 |
| 3.6.3 MTT法检测Rh2联合zA4对THP-1细胞体外杀伤评价 |
| 3.6.4 MTT法检测Rh2联合zA4对原代AML细胞体外杀伤评价 |
| 3.6.5 小结 |
| 3.7 Rh2联合重组溶瘤腺病毒体内抗肿瘤效果评价 |
| 3.7.1 Rh2联合重组溶瘤腺病毒体内抗肿瘤效果评价 |
| 3.7.2 Rh2联合重组溶瘤腺病毒对AML细胞组织浸润能力的影响 |
| 3.8 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简历及攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）蜱唾液腺组织退化中的细胞自噬和细胞凋亡的联络机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蜱的概述 |
| 1.2 蜱唾液腺的生物学特性 |
| 1.2.1 蜱唾液腺的结构与功能 |
| 1.2.2 蜱唾液腺退化的现象 |
| 1.3 哺乳动物中的细胞程序化死亡 |
| 1.3.1 细胞自噬 |
| 1.3.2 细胞凋亡 |
| 1.3.3 细胞自噬和细胞凋亡的联络通路 |
| 1.4 节肢动物昆虫中的细胞程序化死亡 |
| 1.4.1 昆虫中的细胞自噬 |
| 1.4.2 昆虫中的细胞凋亡 |
| 1.4.3 昆虫中的细胞凋亡和细胞自噬的联络通路 |
| 1.5 蜱中细胞自噬和细胞凋亡的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 蜱唾液腺退化时期细胞自噬和凋亡水平的动态检测和转录组分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 镰形扇头蜱唾液腺的形态学及透射电镜(TEM)观察 |
| 2.3.2 TUNEL染色 |
| 2.3.3 蜱唾液腺的转录组测序及其差异分析 |
| 2.3.4 RT-qPCR检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺的体外形态学观察 |
| 2.4.2 不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺的透射电镜观察 |
| 2.4.3 不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺的TUNEL染色 |
| 2.4.4 不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺的转录组差异分析 |
| 2.4.5 蜱唾液腺退化过程中大部分自噬相关基因的转录水平无显着变化 |
| 2.4.6 蜱唾液腺退化过程中细胞凋亡相关基因的转录水平显着升高 |
| 2.4.7 细胞自噬相关基因的转录高峰出现在细胞凋亡相关基因之前 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 蜱唾液腺中细胞自噬和细胞凋亡相关分子的初步鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺总RNA的提取 |
| 3.3.2 cDNA合成 |
| 3.3.3 自噬和凋亡相关基因的克隆与测序 |
| 3.3.4 细胞自噬和细胞凋亡基因的序列分析 |
| 3.3.5 自噬和凋亡相关基因的原核表达 |
| 3.3.6 重组蛋白的表达纯化 |
| 3.3.7 多克隆抗体的制备 |
| 3.3.8 Western blot鉴定多克隆抗体 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 细胞自噬和细胞凋亡基因的克隆 |
| 3.4.2 细胞自噬和细胞凋亡相关基因的序列分析 |
| 3.4.3 细胞自噬和细胞凋亡相关蛋白的表达纯化 |
| 3.4.4 多克隆抗体的鉴定 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 RHCASPASE-7、-8、-9 功能鉴定及其在蜱唾液腺退化中的作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 商品化试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 不同发育阶段不同吸血时间镰形扇头蜱唾液腺总RNA的提取 |
| 4.3.2 cDNA的合成 |
| 4.3.3 RT-qPCR |
| 4.3.4 dsRNA的合成 |
| 4.3.5 RNA干扰 |
| 4.3.6 Western blot检测 |
| 4.3.7 TUNEL染色 |
| 4.3.8 真核表达载体的构建 |
| 4.3.9 真核质粒的共转染 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 不同发育阶段、不同组织不同吸血时间RhCaspase-7、-8、-9 的转录水平的变化 |
| 4.4.2 不同吸血时间唾液腺中RhCaspase-7、-8、-9的蛋白水平的变化 |
| 4.4.3 RhCaspase-7、-8、-9的RNAi |
| 4.4.4 RhCaspase-7、-8、-9 之间的相互作用 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 RHATG5调控蜱唾液腺退化过程中细胞自噬向细胞凋亡的转化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 商品化试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 蜱唾液腺的体外培养和20E处理 |
| 5.3.2 TEM检测 |
| 5.3.3 RT-qPCR |
| 5.3.4 Rh ATG5与Calpain蛋白酶的相互作用及活性位点的鉴定 |
| 5.3.5 TUNEL染色 |
| 5.3.6 多克隆抗体的制备 |
| 5.3.7 Western blot检测 |
| 5.3.8 间接免疫荧光(IFAT)检测 |
| 5.3.9 唾液腺中Ca2+浓度检测 |
| 5.3.10 ds Rh ATG5 的合成 |
| 5.3.11 Rh ATG5的RNAi(体内和体外) |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 快速吸血期的唾液腺中RhATG5在发生剪切 |
| 5.4.2 快速吸血期唾液腺内Ca2+浓度显着升高 |
| 5.4.3 一定浓度Ca2+条件下Rh ATG5 可被Calpain剪切 |
| 5.4.4 20E可诱导蜱唾液腺的细胞程序化死亡 |
| 5.4.5 高浓度20E引起唾液腺中Ca2+浓度升高介导Rh ATG5 的剪切 |
| 5.4.6 抑制RhATG5的表达可减缓蜱唾液腺的退化 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 宿主自噬相关蛋白BECLIN-1 参与调节蜱唾液腺的退化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 实验动物 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 dsRNA的合成 |
| 6.3.2 RhATG6的RNAi |
| 6.3.3 蜱唾液腺的质谱检测 |
| 6.3.4 Western blot检测 |
| 6.3.5 IFAT检测 |
| 6.3.6 RT-qPCR检测 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 干扰RhATG6可一定程度上抑制蜱的吸血 |
| 6.4.2 唾液腺质谱中发现了宿主来源的Beclin-1 的特异性肽段 |
| 6.4.3 不同组织不同吸血时间宿主来源的Beclin-1 的western blot检测 |
| 6.4.4 不同吸血时间血淋巴宿主来源Beclin-1的IFA检测 |
| 6.4.5 不同吸血时间唾液腺中宿主来源Beclin-1的IFA检测 |
| 6.4.6 显微注射重组蛋白Beclin-1 可导致蜱唾液腺的细胞程序化死亡 |
| 6.4.7 宿主Beclin-1 可被RhCaspases剪切 |
| 6.4.8 宿主来源的Beclin-1 可与Rh BCL-2 结合 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）MDM2/MDMX-p53通路在肿瘤及其微环境中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肿瘤与微环境 |
| 1.1.1 肿瘤现状 |
| 1.1.2 肿瘤微环境的定义 |
| 1.1.3 肿瘤微环境中的免疫与炎症 |
| 1.1.4 肿瘤治疗 |
| 1.2 p53与肿瘤 |
| 1.2.1 p53概述 |
| 1.2.2 p53的功能 |
| 1.2.3 p53突变与肿瘤 |
| 1.2.4 靶向p53的肿瘤治疗 |
| 1.3 MDM2/MDMX异二聚体 |
| 1.3.1 MDM2 |
| 1.3.2 MDMX |
| 1.3.3 MDM2/MDMX对 p53 的调控 |
| 1.3.4 MDMX磷酸化修饰对p53的调控 |
| 1.4 本课题的研究目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和材料 |
| 2.2 主要仪器列表 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因工程小鼠饲养、繁育与管理 |
| 2.3.2 小鼠基因型鉴定 |
| 2.3.3 皮下注射成瘤处理 |
| 2.3.4 细胞培养、复苏与冻存 |
| 2.3.5 细胞辐照处理 |
| 2.3.6 小鼠胚胎成纤维细胞MEF体外分离 |
| 2.3.7 骨髓来源巨噬细胞BMDM体外分离 |
| 2.3.8 组织固定、包埋与切片 |
| 2.3.9 病理切片HE染色 |
| 2.3.10 免疫组织荧光染色 |
| 2.3.11 肿瘤组织单细胞悬液制备 |
| 2.3.12 免疫细胞流式检测 |
| 2.3.13 质粒克隆、转化与转染 |
| 2.3.14 细胞克隆形成试验 |
| 2.3.15 细胞和组织中RNA提取 |
| 2.3.16 实时荧光定量PCR |
| 2.3.17 蛋白质免疫印迹 |
| 2.3.18 数据统计与分析 |
| 第3章 MDM2/MDMX异二聚体在成体中对p53 的调控 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 构建CreER Mdmx~(C462A)小鼠 |
| 3.2.2 CreER Mdmx~(C462A/C462A)小鼠基因型鉴定 |
| 3.2.3 Tamoxifen诱导CreER Mdmx~(C462A/C462A)的表达 |
| 3.2.4 Mdmx~(C462A)小鼠的主要脏器未出现明显病理变化 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 p53以转录非依赖的方式抑制肿瘤的发生发展 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 CreER Mdmx~(WT/C462A) MEF细胞的基因型鉴定 |
| 4.2.2 保留p53水平抑制MEF细胞的生长,但是没有转录激活下游靶基因 |
| 4.2.3 保留p53水平抑制淋巴瘤的发生,但是没有转录激活下游靶基因 |
| 4.2.4 构建多种p53不同功能突变的质粒 |
| 4.2.5 仅p53~(R175H)突变不影响肿瘤细胞的生长 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 MDMX磷酸化介导的p53调控肿瘤免疫微环境 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 构建Mdmx~(S314A)突变小鼠模型 |
| 5.2.2 体外分离骨髓来源巨噬细胞并诱导极化 |
| 5.2.3 p38抑制剂预处理促进骨髓来源巨噬细胞M1型极化 |
| 5.2.4 Mdmx-S314A突变促进骨髓来源巨噬细胞M1 型极化 |
| 5.2.5 Mdmx~(S314A)小鼠抑制肿瘤生长 |
| 5.2.6 Mdmx-S314A阻断肿瘤生长导致的p53 下调 |
| 5.2.7 Mdmx-S314A介导的p53 上调促进肿瘤微环境中免疫细胞浸润 |
| 5.2.8 Mdmx-S314A介导的p53 上调促进肿瘤微环境中M1 型极化 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（9）脊椎动物肿瘤坏死因子受体超家族成员进化分析和七鳃鳗tnfr10-like功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本篇论文常用词汇缩写表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 七鳃鳗介绍 |
| 1.2 肿瘤坏死因子受体介绍 |
| 1.2.1 肿瘤坏死因子受体结构和功能特点 |
| 1.2.2 肿瘤坏死因子受体在免疫系统和疾病中的研究 |
| 1.3 七鳃鳗肿瘤坏死因子受体研究的重要意义 |
| 第2章 七鳃鳗肿瘤坏死因子受体超家族成员的进化分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 七鳃鳗TNFRs成员的搜索 |
| 2.2.2 进化树构建、序列基序分析、蛋白质结构域分析 |
| 2.2.3 Genomicus在线网站分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 七鳃鳗TNFRs成员的鉴定及蛋白质基序和结构域分析 |
| 2.3.2 脊椎动物中tnfrs基因同线性比较 |
| 2.3.3 脊椎动物中tnfrs基因结构分析 |
| 2.4 小结 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 七鳃鳗肿瘤坏死因子受体超家族成员的组织分布及免疫功能 |
| 3.1 实验材料和实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 提取总RNA、反转为cDNA |
| 3.2.3 实时定量PCR |
| 3.2.4 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 七鳃鳗TNFRs成员的组织分布 |
| 3.3.2 七鳃鳗TNFRs成员的免疫功能 |
| 3.4 小结 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 L-tnfr10-like分子克隆、载体构建、蛋白纯化及抗体制备 |
| 4.1 实验材料和实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 载体构建 |
| 4.2.2 蛋白纯化 |
| 4.2.3 皮下免疫新西兰兔 |
| 4.2.4 ELISA检测 |
| 4.2.5 多克隆抗体纯化 |
| 4.2.6 免疫印迹检测抗体特异性 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 构建真核表达载体和原核表达载体 |
| 4.3.2 pET-32a-L-tnfr10-like蛋白诱导表达和纯化 |
| 4.3.3 L-TNFR10-like多克隆抗体效价检测 |
| 4.3.4 兔多抗L-TNFR10-like抗体纯化及特异性检测 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 L-tnfr10-like组织分布、亚细胞定位及其功能研究 |
| 5.1 实验材料和实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 转录组数据查找 |
| 5.2.2 免疫组化检测 |
| 5.2.3 免疫荧光检测 |
| 5.2.4 超高分辨率显微镜检测 |
| 5.2.5 Real-time PCR检测 |
| 5.2.6 Western blot检测 |
| 5.2.7 细胞活力检测 |
| 5.2.8 双荧光素酶检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 L-tnfr10-like在七鳃鳗不同组织中的表达含量 |
| 5.3.2 L-TNFR10-like在七鳃鳗肠组织和鳃组织中的分布 |
| 5.3.3 L-TNFR10-like在七鳃鳗细胞中的定位 |
| 5.3.4 L-TNFR10-like在哺乳动物细胞中的定位 |
| 5.3.5 L-tnfr10-like在转录水平上应答病原菌的变化情况 |
| 5.3.6 L-TNFR10-like在蛋白水平上应答病原菌的变化情况 |
| 5.3.7 HEK-293T细胞过表达p EGFP-N1-L-tnfr10-like对细胞活力的影响 |
| 5.3.8 HEK-293T细胞过表达p EGFP-N1-L-tnfr10-like对 NF-κB通路的激活 |
| 5.4 小结 |
| 5.5 讨论 |
| 全文总结 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 A 进化树分析七鳃鳗TNFRs成员 |
| 附录 B 本篇文章使用的蛋白质序列号 |
| 附录 C Ensembl和 Genomicus网站检索的蛋白质序列号 |
| 附录 D L-tnfr10-like基因测序图谱及序列信息 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（10）Akkermansia muciniphila源蛋白酶Amuc-1434对Muc2的降解及其抑制结直肠癌LS174T细胞增殖的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 AKKERMANSIA MUCINIPHILA的基本特性和生物学功能 |
| 1.1.1 Akkermansia muciniphila在肠道中的分布及特征 |
| 1.1.2 Akkermansia muciniphila在宿主健康中的作用 |
| 1.1.3 Akkermansia muciniphila与免疫系统 |
| 1.2 分泌型黏蛋白MUC2 |
| 1.2.1 Muc2 结构、功能与肠道内稳态 |
| 1.2.2 Muc2 与肠道相关疾病 |
| 1.3 结直肠癌(CRC) |
| 1.3.1 CRC简介 |
| 1.3.2 CRC与 TRAIL相关的凋亡途径 |
| 1.3.3 ROS与 CRC |
| 1.4 立题依据和研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 重组蛋白AMUC-1434 的纯化、活性鉴定、酶学性质及其活性位点的初步探究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验用品 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验溶液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组质粒的转化 |
| 2.3.2 重组蛋白的诱导表达及表达条件优化 |
| 2.3.3 重组蛋白的纯化 |
| 2.3.4 纯化蛋白浓度的测定 |
| 2.3.5 Western blot鉴定纯化蛋白 |
| 2.3.6 纯化蛋白活性的测定 |
| 2.3.7 重组蛋白Amuc-1434 动力学反应的测定 |
| 2.3.8 重组蛋白Amuc-1434 浓度对酶促反应速率影响的研究 |
| 2.3.9 重组蛋白Amuc-1434 最适反应pH和温度的测定 |
| 2.3.10 重组蛋白Amuc-1434 温度稳定性的测定 |
| 2.3.11 抑制剂对重组蛋白Amuc-1434 活性影响的研究 |
| 2.3.12 金属离子对重组蛋白Amuc-1434 活性影响的研究 |
| 2.3.13 点突变对重组蛋白Amuc-1434 活性影响的研究 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 重组蛋白Amuc-1434 诱导条件的优化 |
| 2.4.2 重组蛋白Amuc-1434 的纯化及Western blot鉴定 |
| 2.4.3 重组蛋白Amuc-1434 的活性测定 |
| 2.4.4 重组蛋白Amuc-1434 动力学检测 |
| 2.4.5 重组蛋白Amuc-1434 浓度与酶促反应速率的关系 |
| 2.4.6 重组蛋白Amuc-1434 的最适pH值 |
| 2.4.7 重组蛋白Amuc-1434 的最适反应温度和热稳定性 |
| 2.4.8 几种蛋白酶抑制剂对重组蛋白Amuc-1434 活性的影响 |
| 2.4.9 金属离子对重组蛋白Amuc-1434 活性的影响 |
| 2.4.10 突变的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG的纯化 |
| 2.4.11 突变的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG活性测定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 重组蛋白AMUC-1434 多克隆抗体的制备、对 MUC2 的降解及其在肠道中表达位置的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验用品 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 实验溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 抗原的处理 |
| 3.3.2 抗血清的制备 |
| 3.3.3 抗血清效价检测 |
| 3.3.4 抗血清特异性检测 |
| 3.3.5 HPLC检测抗血清纯度 |
| 3.3.6 细胞培养 |
| 3.3.7 贴壁细胞总蛋白的提取 |
| 3.3.8 Dot-blot检测蛋白间相互作用 |
| 3.3.9 Sandwich ELISA免疫分析 |
| 3.3.10 Western blot实验 |
| 3.3.11 细胞黏附实验 |
| 3.3.12 Muc2 降解实验 |
| 3.3.13 免疫荧光实验 |
| 3.3.14 组织切片的制作 |
| 3.3.15 免疫组化实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 重组蛋白Amuc-1434 抗体效价的评估 |
| 3.4.2 重组蛋白Amuc-1434 抗体特异性和纯度的检测 |
| 3.4.3 重组蛋白Amuc-1434与Muc2 的相互作用 |
| 3.4.4 重组蛋白Amuc-1434对Muc2 表达细胞的黏附作用 |
| 3.4.5 重组蛋白Amuc-1434 降解Muc2 |
| 3.4.6 蛋白Amuc-1434在BALB/c小鼠肠道中的表达位置 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 重组蛋白AMUC-1434 对结直肠癌细胞LS174T增殖的抑制作用及机制的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验用品 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验溶液 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 MTT |
| 4.3.3 细胞周期实验 |
| 4.3.4 细胞凋亡实验 |
| 4.3.5 ROS水平检测 |
| 4.3.6 线粒体膜电位检测 |
| 4.3.7 细胞凋亡相关蛋白表达水平的检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 重组蛋白Amuc-1434 抑制LS174T细胞增殖 |
| 4.4.2 重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞周期的影响 |
| 4.4.3 重组蛋白Amuc-1434 诱导LS174T细胞凋亡 |
| 4.4.4 重组蛋白Amuc-1434 增加LS174T细胞内ROS含量 |
| 4.4.5 重组蛋白Amuc-1434 引起LS174T细胞线粒体膜电位下降 |
| 4.4.6 重组蛋白Amuc-1434 影响LS174T细胞凋亡相关蛋白的表达 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
四、Cloning and identifying of a novel protein binding with death domain of the death receptor 4（论文参考文献）
- [1]甜瓜CmBAG6-2基因在其果实发育中功能的初步分析[D]. 王丽娟. 内蒙古大学, 2021
- [2]蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B和SHP2变构调节机制的分子动力学模拟研究[D]. 王泉. 吉林大学, 2021(01)
- [3]猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9及其特异性纳米抗体的结构解析[D]. 王妍. 西北农林科技大学, 2020
- [4]空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究[D]. 李永红. 兰州大学, 2020(04)
- [5]靶向肿瘤凋亡相关靶标的先导化合物发现及作用机制研究[D]. 徐珩. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2020(07)
- [6]TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究[D]. 王子璇. 吉林大学, 2020(08)
- [7]蜱唾液腺组织退化中的细胞自噬和细胞凋亡的联络机制研究[D]. 王亚楠. 中国农业科学院, 2020
- [8]MDM2/MDMX-p53通路在肿瘤及其微环境中的功能研究[D]. 王兵. 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所), 2020(01)
- [9]脊椎动物肿瘤坏死因子受体超家族成员进化分析和七鳃鳗tnfr10-like功能初探[D]. 朱医高. 辽宁师范大学, 2020(02)
- [10]Akkermansia muciniphila源蛋白酶Amuc-1434对Muc2的降解及其抑制结直肠癌LS174T细胞增殖的研究[D]. 孟鑫. 吉林大学, 2020(08)