本文主要研究内容
作者郑红青（2019）在《PEDV感染的猪小肠上皮细胞miRNA组学分析和miR-221-5p与miR-615对病毒复制的影响及机制》一文中研究指出：猪流行性腹泻病毒(Procine epidemic diaherra virus,PEDV)属于冠状病毒科α冠状病毒属,是一种单股正链RNA病毒,能够引起猪流行性腹泻(Procine epidemic diaherra,PED)。1971年PEDV发现于欧洲,1978年比利时分离到经典毒株CV777。2010年新出现的PEDV突变株引起仔猪急性水样腹泻,病死率高达80%~100%,给世界和我国养猪业造成了巨大的经济损失。microRNAs(miRNAs)是一类多功能的小RNA,一些miRNAs在病毒的感染过程中通过调控宿主的天然免疫而发挥抗病毒作用。本文分离鉴定了一株PEDV毒株,进行了PEDV感染猪小肠上皮细胞(swine intestinal epithelial cells,SIEC)的miRNAs组学分析,然后重点研究了miR-221-5p和miR-615对PEDV复制过程的影响及机制,获得了以下结果:1.PEDV区域流行毒株的分离鉴定和全基因序列的分析本研究从临床PEDV阳性病料中分离到了一株PEDV毒株,进行了全基因组测序和分析,结果显示,病毒基因组全长28063 nt,包括5’(300 nt)和3’(500 nt)的非翻译区;全基因组进化分析发现,该毒株属于G2流行毒株组,与近年分离的毒株亲缘关系最近;该毒株S基因没有出现插入和删除,ORF3基因也没有发生缺失。将分离鉴定的PEDV毒株命名为CH/HBTS/2017。2.PEDV感染的SIEC miRNAs组学分析(1)用疫苗毒株CV777和ORF3缺失的强毒株NW17感染SIEC后,应用高通量测序方法鉴定miRNAs的表达差异。结果显示,不同毒力的PEDV毒株感染SIEC后均改变了细胞miRNAs的表达谱。共鉴定了229个miRNAs成熟体和232个前体。表达分析表明,CV777 vs.Mock有102个差异miRNAs,NW17 vs.Mock组有97个差异miRNAs,其中有78个miRNAs在这两组差异基因中同时出现。(2)对差异的miRNAs进行靶基因预测,并将靶基因进行GO和KEEG分析,结果显示NF-κB、MAPK、TLR等信号通路参与了PEDV感染的过程,进一步分析发现NF-κB通路具有最高的富集分数。3.miR-221-5p通过靶向病毒基因组和激活NF-κB通路抑制病毒的复制(1)应用ViTa数据库预测靶向病毒基因组的miRNAs,发现miR-221-5p同时靶向30个PEDV毒株3’端最保守的区域。利用miR-221-5p模拟物,转染SIEC、Vero和Marc-145细胞后都可以抑制PEDV复制,并且在Marc-145细胞中的抑制作用最强。(2)发现miR-221-5p可以与病毒3’UTR靶标区域结合。与天然免疫缺陷的Vero细胞相比,miR-221-5p在Marc-145细胞中发挥更强的抑制PEDV复制的作用。上调IFN-α、IFN-β和干扰素刺激基因ISG15的表达。进一步研究发现,miR-221-5p主要通过影响NF-κB通路发挥作用,证明NF-κB的启动子被激活;确认p65的核转位增加,进一步探明p65的入核是由于IκB的减少所致。(3)用Targetscan程序进一步预测了miR-221-5p的靶基因,筛选了5个在NF-κB通路的靶基因,双荧光素酶报告基因试验显示,miR-221-5p可以与SOCS1和NFKBIA基因结合,并且下调了这两个蛋白的表达。通过对SOCS1和NF-κB的敲低和过表达发现,SOCS1和NFKBIA可以在PEDV感染时抑制NF-κB通路,进一步探明miR-221-5p通过下调这两个负调控因子来激活NF-κB通路。4.miR-615通过靶向IRAK1调控Ⅲ型干扰素(IFN-Ⅲ)的表达来促进病毒复制(1)高通量测序的数据显示,在PEDV感染的SIEC细胞中miR-615下调。过表达miR-615可以促进PEDV在SIEC细胞中的复制,而敲低miR-615可以抑制PEDV在SIEC细胞中的复制。(2)过表达miR-615,Ⅰ型干扰素和Ⅲ型干扰素都被下调,其中,IFN-λ1和IFN-λ3下调更明显。(3)用miRanda、RNAhybrid和PITA3个数据库的预测miR-615的靶基因发现,IRAK1是miR-615的靶基因。双荧光素酶报告基因试验证明miR-615可以结合IRAK1靶基因区域。敲低IRAK1后,IFN-λ1和IFN-λ3的表达下降;过表达IRAK1后,IFN-λ1和IFN-λ3转录水平表达上调。并且,miR-615可以下调IRAK1的蛋白水平。将miR-615与IRAK1共转染,结果显示,IRAK1逆转了miR-615转染引起的IFN-λ1和IFN-λ3的下调和病毒复制的增加。综上所述,分离到了一株PEDV毒株;PEDV感染SIEC的过程中改变了miRNAs的表达谱。miR-221-5p通过调控IκB和SOCS1蛋白激活了NF-κB通路,从而抑制PEDV复制;miR-615通过调控IRAK1抑制了NF-κB的激活,从而促进PEDV的复制,说明NF-κB通路在PEDV感染过程中起了重要作用。本研究揭示了miRNAs可以通过调控天然免疫通路来影响PEDV复制,为阐明PEDV致病机理提供了新的科学资料。
Abstract
zhu liu hang xing fu xie bing du (Procine epidemic diaherra virus,PEDV)shu yu guan zhuang bing du ke αguan zhuang bing du shu ,shi yi chong chan gu zheng lian RNAbing du ,neng gou yin qi zhu liu hang xing fu xie (Procine epidemic diaherra,PED)。1971nian PEDVfa xian yu ou zhou ,1978nian bi li shi fen li dao jing dian du zhu CV777。2010nian xin chu xian de PEDVtu bian zhu yin qi zai zhu ji xing shui yang fu xie ,bing si lv gao da 80%~100%,gei shi jie he wo guo yang zhu ye zao cheng le ju da de jing ji sun shi 。microRNAs(miRNAs)shi yi lei duo gong neng de xiao RNA,yi xie miRNAszai bing du de gan ran guo cheng zhong tong guo diao kong su zhu de tian ran mian yi er fa hui kang bing du zuo yong 。ben wen fen li jian ding le yi zhu PEDVdu zhu ,jin hang le PEDVgan ran zhu xiao chang shang pi xi bao (swine intestinal epithelial cells,SIEC)de miRNAszu xue fen xi ,ran hou chong dian yan jiu le miR-221-5phe miR-615dui PEDVfu zhi guo cheng de ying xiang ji ji zhi ,huo de le yi xia jie guo :1.PEDVou yu liu hang du zhu de fen li jian ding he quan ji yin xu lie de fen xi ben yan jiu cong lin chuang PEDVyang xing bing liao zhong fen li dao le yi zhu PEDVdu zhu ,jin hang le quan ji yin zu ce xu he fen xi ,jie guo xian shi ,bing du ji yin zu quan chang 28063 nt,bao gua 5’(300 nt)he 3’(500 nt)de fei fan yi ou ;quan ji yin zu jin hua fen xi fa xian ,gai du zhu shu yu G2liu hang du zhu zu ,yu jin nian fen li de du zhu qin yuan guan ji zui jin ;gai du zhu Sji yin mei you chu xian cha ru he shan chu ,ORF3ji yin ye mei you fa sheng que shi 。jiang fen li jian ding de PEDVdu zhu ming ming wei CH/HBTS/2017。2.PEDVgan ran de SIEC miRNAszu xue fen xi (1)yong yi miao du zhu CV777he ORF3que shi de jiang du zhu NW17gan ran SIEChou ,ying yong gao tong liang ce xu fang fa jian ding miRNAsde biao da cha yi 。jie guo xian shi ,bu tong du li de PEDVdu zhu gan ran SIEChou jun gai bian le xi bao miRNAsde biao da pu 。gong jian ding le 229ge miRNAscheng shou ti he 232ge qian ti 。biao da fen xi biao ming ,CV777 vs.Mockyou 102ge cha yi miRNAs,NW17 vs.Mockzu you 97ge cha yi miRNAs,ji zhong you 78ge miRNAszai zhe liang zu cha yi ji yin zhong tong shi chu xian 。(2)dui cha yi de miRNAsjin hang ba ji yin yu ce ,bing jiang ba ji yin jin hang GOhe KEEGfen xi ,jie guo xian shi NF-κB、MAPK、TLRdeng xin hao tong lu can yu le PEDVgan ran de guo cheng ,jin yi bu fen xi fa xian NF-κBtong lu ju you zui gao de fu ji fen shu 。3.miR-221-5ptong guo ba xiang bing du ji yin zu he ji huo NF-κBtong lu yi zhi bing du de fu zhi (1)ying yong ViTashu ju ku yu ce ba xiang bing du ji yin zu de miRNAs,fa xian miR-221-5ptong shi ba xiang 30ge PEDVdu zhu 3’duan zui bao shou de ou yu 。li yong miR-221-5pmo ni wu ,zhuai ran SIEC、Verohe Marc-145xi bao hou dou ke yi yi zhi PEDVfu zhi ,bing ju zai Marc-145xi bao zhong de yi zhi zuo yong zui jiang 。(2)fa xian miR-221-5pke yi yu bing du 3’UTRba biao ou yu jie ge 。yu tian ran mian yi que xian de Veroxi bao xiang bi ,miR-221-5pzai Marc-145xi bao zhong fa hui geng jiang de yi zhi PEDVfu zhi de zuo yong 。shang diao IFN-α、IFN-βhe gan rao su ci ji ji yin ISG15de biao da 。jin yi bu yan jiu fa xian ,miR-221-5pzhu yao tong guo ying xiang NF-κBtong lu fa hui zuo yong ,zheng ming NF-κBde qi dong zi bei ji huo ;que ren p65de he zhuai wei zeng jia ,jin yi bu tan ming p65de ru he shi you yu IκBde jian shao suo zhi 。(3)yong Targetscancheng xu jin yi bu yu ce le miR-221-5pde ba ji yin ,shai shua le 5ge zai NF-κBtong lu de ba ji yin ,shuang ying guang su mei bao gao ji yin shi yan xian shi ,miR-221-5pke yi yu SOCS1he NFKBIAji yin jie ge ,bing ju xia diao le zhe liang ge dan bai de biao da 。tong guo dui SOCS1he NF-κBde qiao di he guo biao da fa xian ,SOCS1he NFKBIAke yi zai PEDVgan ran shi yi zhi NF-κBtong lu ,jin yi bu tan ming miR-221-5ptong guo xia diao zhe liang ge fu diao kong yin zi lai ji huo NF-κBtong lu 。4.miR-615tong guo ba xiang IRAK1diao kong Ⅲxing gan rao su (IFN-Ⅲ)de biao da lai cu jin bing du fu zhi (1)gao tong liang ce xu de shu ju xian shi ,zai PEDVgan ran de SIECxi bao zhong miR-615xia diao 。guo biao da miR-615ke yi cu jin PEDVzai SIECxi bao zhong de fu zhi ,er qiao di miR-615ke yi yi zhi PEDVzai SIECxi bao zhong de fu zhi 。(2)guo biao da miR-615,Ⅰxing gan rao su he Ⅲxing gan rao su dou bei xia diao ,ji zhong ,IFN-λ1he IFN-λ3xia diao geng ming xian 。(3)yong miRanda、RNAhybridhe PITA3ge shu ju ku de yu ce miR-615de ba ji yin fa xian ,IRAK1shi miR-615de ba ji yin 。shuang ying guang su mei bao gao ji yin shi yan zheng ming miR-615ke yi jie ge IRAK1ba ji yin ou yu 。qiao di IRAK1hou ,IFN-λ1he IFN-λ3de biao da xia jiang ;guo biao da IRAK1hou ,IFN-λ1he IFN-λ3zhuai lu shui ping biao da shang diao 。bing ju ,miR-615ke yi xia diao IRAK1de dan bai shui ping 。jiang miR-615yu IRAK1gong zhuai ran ,jie guo xian shi ,IRAK1ni zhuai le miR-615zhuai ran yin qi de IFN-λ1he IFN-λ3de xia diao he bing du fu zhi de zeng jia 。zeng shang suo shu ,fen li dao le yi zhu PEDVdu zhu ;PEDVgan ran SIECde guo cheng zhong gai bian le miRNAsde biao da pu 。miR-221-5ptong guo diao kong IκBhe SOCS1dan bai ji huo le NF-κBtong lu ,cong er yi zhi PEDVfu zhi ;miR-615tong guo diao kong IRAK1yi zhi le NF-κBde ji huo ,cong er cu jin PEDVde fu zhi ,shui ming NF-κBtong lu zai PEDVgan ran guo cheng zhong qi le chong yao zuo yong 。ben yan jiu jie shi le miRNAske yi tong guo diao kong tian ran mian yi tong lu lai ying xiang PEDVfu zhi ,wei chan ming PEDVzhi bing ji li di gong le xin de ke xue zi liao 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西北农林科技大学的郑红青，发表于刊物西北农林科技大学2019-07-11论文，是一篇关于猪流行性腹泻病毒论文,核转录因子论文,西北农林科技大学2019-07-11论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西北农林科技大学2019-07-11论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。