广州市明美光电技术有限公司暨广东省显微成像工程技术研究中心，广东广州510663
摘要：光片荧光显微成像技术因其独特的优点，受到广泛关注。从光片荧光显微镜基础入手，介绍成像原理、发展历史、研究现状及应用展望。
关键词：显微成像，荧光成像；光片照明
引言
显微成像技术是现代生物医学研究的重要技术手段之一，显微荧光成像技术因其特异性标记及高灵敏度高对比度的成像，而受到广泛地应用。光片荧光显微镜一种特殊的荧光显微镜，其显著提高了传统荧光显微镜的三维成像速度，降低了光漂白以及光毒性，使得科学家们能够长时间地观察生理状况下组织细胞的生命活动，对生命科学的研究具有重要意义。
1.光片显微镜的历史
显微镜是一种古老的光学仪器，历经几百年发展，形成了多个分支，广泛地应用生命科学的各个领。荧光显微镜是利用物质荧光特性进行观察的光学显微镜，具有检出能力高、能进行多重着色观察的特点，广泛地应用于生物医学领域。长期以来，传统荧光显微镜受限于阿贝衍射极限，分辨率都不能突破200nm；其次，激发光的光漂白及光毒性无法实现样本的长时间观察；再者，常用于活细胞研究的共聚焦荧光显微镜的成像速度太慢；无法满足生物医学研究快速成像、高分辨的要求。
薄片光的概念最早是在1903年提出的，然而直到1993年Voie才用薄片光的原理开发了正交面荧光光学切片显微镜)，样品由薄片光扫瞄成像。二十一世纪以来，光片照明显微镜发展非常迅速，由于采用面探测的成像方式，光片照明系统能够快速获得高分辨率的三位层析结构成像，和共聚焦相比，对整体标本的光毒性小，光漂白低，适合长时称活体成像。2004年Stelzer发明了选择薄片光显微镜,SPIM可以三维高分辩率高穿透深度成像。2008年Stelzer改进了SPIM，改进版的SPIM可以对斑马鱼胚胎进行24小时成像并追逐胚胎发育过程中的细胞位移和分裂。2014年，光片荧光显微镜被NatureMehtods列入十大新技术之列，深刻改变了生物医学观察方式。
2.成像原理及结构
光片荧光显微成像技术，LSFM或者selectiveplane叫uminationmicroscopy，SPIM）通过对光片激荧光的宽场成像，该技术综合了成像速度和空间分辨率的优势，极小的光损伤和光漂白，广泛应用于生物样品的长时间动态活体多维成像。主要由照明系统、荧光收集系统、机械结构系统、软件系统等4大部分组成，结构如图1所示。
图1光片荧光显微镜原理
光片荧光显微镜的照明系统，是研究工作的重心。相对于传统荧光显微镜的照明光路与成像光路采用同一组物镜，光片荧光显微镜中，照明光路和成像光路是相互垂直的，采用不同的物镜，且照明光束通过柱面镜或高斯光束的模式产生一层光束薄片从样品的侧面照射样品，如图2所示。光片荧光显微镜此片状照明方式,激发面积较大且为荧光探测器感光面，成像速度较快；同时，光片尽可能将照明限制在探测器聚焦平面，只有焦面附近的荧光物质才会被激发，减少了非焦面荧光信号的干扰，提高了成像层切能力和纵向分辨率；减少了无效曝光，降低光毒性。
图2光片照明
荧光收集系统，主要包含探测物镜、滤色片系统、荧光探测器三大部分。荧光信号收集系统中的物镜与照明光片所在的平面垂直，用于收集样品发射的荧光信号。探测器可以收集到被激发的薄层区域的所有荧光信号，减少成像时间。滤色片系统，装载不同类型的滤色片，用于快速切换以便高速地获取不同样品的荧光信号。荧光探测期，用于收集荧光信号，通常为高灵敏度的制冷CCD或者SCMOS相机。
光片荧光显微镜的机械结构较为复杂，多处采用电动控制，尤其是载物台，不仅用于固定样品，并可以实现样品三位移动以及平面内的转动，以满足三维成像的需要。光片荧光显微镜的整个系统采用电动控制，同时长时间的连续拍照，要求软件系统功能足够强大。
3.研究现状
光片显微镜以较低的光毒性和高时空分辨率的特点，在生物医学成像中优势突出。但其两个物镜垂直的方式，无法使用高数值孔径物镜，从而限制了显微镜空间分辨率的进一步提高。近年来，领域科研人员一直在探索有效扩展视场的方法，来解决光片厚度与宽度（视场）的相互制约问题；随着超分辨率成像技术的飞速发展，应用到提高显微镜的横向分辨率。
软件系统处理能力，是另一个重要研究内容。一方面，光片显微镜以很高的时空分辨率对大生物样品进行长时间的连续成像，产生巨大的图像数据，面对大量的三维时序图像，快速的图像处理能力已经成为一个迫切的需要。另外，光片荧光显微镜向自动化、智能化方向发展，进一步要求系统具有更高的运算能力。
4.应用展望
光片荧光显微镜，以其较低的光毒性和光漂白、高时空分辨，能够实现大样品快、快速扫描、深度成像、高分辨率3D动态图像输出的特点，弥补传统荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜的缺点，广泛应用于细胞生物学、发育生物学、神经科学等领域。
参考文献
[1]杨豫龙,宗伟建.光片荧光显微成像[J].光学学报，2017,37(3):0318007.
[2]徐豪,张运海.基于波前相位调制的宽视场光片显微镜研究[J].光学学报，2016,36(8):0818001.