本文主要研究内容
作者冯鹏程（2019）在《西洋参Pq-PPT-6,20-O-UGT和Pq-PPT-6-O-UGT糖基转移酶基因的克隆与功能分析》一文中研究指出：西洋参为五加科多年生草本植物,是世界公认的滋补、药食两用植物。西洋参的有效成分为人参皂苷,在强身益智,明目,安精神,止惊悸,延年益寿等方面有着重要的作用。2,3-氧化角鲨烯作为人参皂苷生物合成的中心,分为甲羟戊酸途径和始于丙酮酸的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)的上游途径,以及环化、羟基化、糖基化等修饰过程的下游途径。人参属的药理学活性因人参皂苷的种类和含量的不同而异。糖基化是人参皂苷合成的最后一步,也是赋予人参皂苷特异性、多样性的关键一步。近年来许多学者对人参皂苷合成的葡萄糖基转移酶基因做了许多研究,但西洋参相关葡萄糖基转移酶的研究还不够充分。本文以实验室保存的西洋参愈伤组织为材料,用RT-PCR方法成功的获得三个催化人参皂苷合成的UDP-葡萄糖基转移酶基因序列,并将三个基因与真核表达载体pAUR123连接,转化到酿酒酵母中,通过超声波破碎后,用SDS-PAGE蛋白电泳检测基因表达情况,再用HPLC检测酶促反应产物确定糖基转移酶的功能,最后对发酵温度、时间、摇瓶转速三个条件进行优化培养,具体的研究成果如下:1、糖基转移酶基因的获得。以有质感、生长旺盛的西洋参愈伤组织为材料,用宝生物的全RNA提取试剂盒获取西洋参的总RNA。用RTaseM-MLV酶催化反转录出西洋参的cDNA,以人参中PgUGT100、PgUGT101、PgUGT102和PgUGT103为模板设计简并引物,以cDNA为模板成功克隆出三条序列,经测序后分别确定三条序列均为1428bp,翻译475个氨基酸,编码蛋白质大小均约为53KDa,对他们的氨基酸序列进行序列比对和同源建模后确定得到目的序列,并命名为序列一、序列二和序列三。2、糖基转移酶的异源表达载体构建。将葡萄糖基转移酶基因序列一、序列二和序列三与pAUR123连接,构建了pAUR123-序列一、pAUR123-序列二和pAUR123-序列三三个重组载体,之后转化到INVSc1酿酒酵母中,经菌落PCR和双酶切鉴定后,成功构建Y-pAUR123-序列一、Y-pAUR123-序列二和Y-pAUR123-序列三三个酵母工程菌。3、糖基转移酶表达情况分析。对构建的三个工程菌分别进行发酵培养,用SDS-PAGE蛋白电泳检测工程菌中目的蛋白表达情况,在蛋白电泳图中三个目的蛋白的特征性条带都在53KDa,结果表明三条序列在三个酿酒酵母工程菌中都成功表达。4、将三个重组酵母菌种破碎后的蛋白液作为粗酶液,添加人参皂苷和UDPG后做酶促反应。用液相色谱分析酶促反应产物,序列一可以催化原人参三醇生成F1,再催化F1生成Rg1,因此将序列一命名为Pq-PPT-6,20-O-UGT,并将核酸序列提交到GenBank获得检索号:MK641514,序列二可以催化原人参三醇生成Rh1,因此将序列二命名为Pq-PPT-6-O-UGT,并将核酸序列提交到GenBank获得检索号:MK641515,序列三未检测到催化活性,因此将序列三命名为Pq-PPT-20-O-UGT,并将核酸序列提交到GenBank获得检索号:MK641516。5、工程菌发酵条件优化。从发酵温度、培养时间、摇瓶转速三个方面对工程菌Y-pAUR123-Pq-PPT-6,20-O-UGT和Y-pAUR123-Pq-PPT-6-O-UGT进行优化培养,确定了适宜发酵温度为30℃,适宜发酵时间为38h,适宜摇瓶转速为270rpm。
Abstract
xi xiang can wei wu jia ke duo nian sheng cao ben zhi wu ,shi shi jie gong ren de zi bu 、yao shi liang yong zhi wu 。xi xiang can de you xiao cheng fen wei ren can zao gan ,zai jiang shen yi zhi ,ming mu ,an jing shen ,zhi jing ji ,yan nian yi shou deng fang mian you zhao chong yao de zuo yong 。2,3-yang hua jiao sha xi zuo wei ren can zao gan sheng wu ge cheng de zhong xin ,fen wei jia qiang wu suan tu jing he shi yu bing tong suan de 2-jia ji -D-chi xian tang chun -4-lin suan (MEP)de shang you tu jing ,yi ji huan hua 、qiang ji hua 、tang ji hua deng xiu shi guo cheng de xia you tu jing 。ren can shu de yao li xue huo xing yin ren can zao gan de chong lei he han liang de bu tong er yi 。tang ji hua shi ren can zao gan ge cheng de zui hou yi bu ,ye shi fu yu ren can zao gan te yi xing 、duo yang xing de guan jian yi bu 。jin nian lai hu duo xue zhe dui ren can zao gan ge cheng de pu tao tang ji zhuai yi mei ji yin zuo le hu duo yan jiu ,dan xi xiang can xiang guan pu tao tang ji zhuai yi mei de yan jiu hai bu gou chong fen 。ben wen yi shi yan shi bao cun de xi xiang can yu shang zu zhi wei cai liao ,yong RT-PCRfang fa cheng gong de huo de san ge cui hua ren can zao gan ge cheng de UDP-pu tao tang ji zhuai yi mei ji yin xu lie ,bing jiang san ge ji yin yu zhen he biao da zai ti pAUR123lian jie ,zhuai hua dao niang jiu jiao mu zhong ,tong guo chao sheng bo po sui hou ,yong SDS-PAGEdan bai dian yong jian ce ji yin biao da qing kuang ,zai yong HPLCjian ce mei cu fan ying chan wu que ding tang ji zhuai yi mei de gong neng ,zui hou dui fa jiao wen du 、shi jian 、yao ping zhuai su san ge tiao jian jin hang you hua pei yang ,ju ti de yan jiu cheng guo ru xia :1、tang ji zhuai yi mei ji yin de huo de 。yi you zhi gan 、sheng chang wang cheng de xi xiang can yu shang zu zhi wei cai liao ,yong bao sheng wu de quan RNAdi qu shi ji he huo qu xi xiang can de zong RNA。yong RTaseM-MLVmei cui hua fan zhuai lu chu xi xiang can de cDNA,yi ren can zhong PgUGT100、PgUGT101、PgUGT102he PgUGT103wei mo ban she ji jian bing yin wu ,yi cDNAwei mo ban cheng gong ke long chu san tiao xu lie ,jing ce xu hou fen bie que ding san tiao xu lie jun wei 1428bp,fan yi 475ge an ji suan ,bian ma dan bai zhi da xiao jun yao wei 53KDa,dui ta men de an ji suan xu lie jin hang xu lie bi dui he tong yuan jian mo hou que ding de dao mu de xu lie ,bing ming ming wei xu lie yi 、xu lie er he xu lie san 。2、tang ji zhuai yi mei de yi yuan biao da zai ti gou jian 。jiang pu tao tang ji zhuai yi mei ji yin xu lie yi 、xu lie er he xu lie san yu pAUR123lian jie ,gou jian le pAUR123-xu lie yi 、pAUR123-xu lie er he pAUR123-xu lie san san ge chong zu zai ti ,zhi hou zhuai hua dao INVSc1niang jiu jiao mu zhong ,jing jun la PCRhe shuang mei qie jian ding hou ,cheng gong gou jian Y-pAUR123-xu lie yi 、Y-pAUR123-xu lie er he Y-pAUR123-xu lie san san ge jiao mu gong cheng jun 。3、tang ji zhuai yi mei biao da qing kuang fen xi 。dui gou jian de san ge gong cheng jun fen bie jin hang fa jiao pei yang ,yong SDS-PAGEdan bai dian yong jian ce gong cheng jun zhong mu de dan bai biao da qing kuang ,zai dan bai dian yong tu zhong san ge mu de dan bai de te zheng xing tiao dai dou zai 53KDa,jie guo biao ming san tiao xu lie zai san ge niang jiu jiao mu gong cheng jun zhong dou cheng gong biao da 。4、jiang san ge chong zu jiao mu jun chong po sui hou de dan bai ye zuo wei cu mei ye ,tian jia ren can zao gan he UDPGhou zuo mei cu fan ying 。yong ye xiang se pu fen xi mei cu fan ying chan wu ,xu lie yi ke yi cui hua yuan ren can san chun sheng cheng F1,zai cui hua F1sheng cheng Rg1,yin ci jiang xu lie yi ming ming wei Pq-PPT-6,20-O-UGT,bing jiang he suan xu lie di jiao dao GenBankhuo de jian suo hao :MK641514,xu lie er ke yi cui hua yuan ren can san chun sheng cheng Rh1,yin ci jiang xu lie er ming ming wei Pq-PPT-6-O-UGT,bing jiang he suan xu lie di jiao dao GenBankhuo de jian suo hao :MK641515,xu lie san wei jian ce dao cui hua huo xing ,yin ci jiang xu lie san ming ming wei Pq-PPT-20-O-UGT,bing jiang he suan xu lie di jiao dao GenBankhuo de jian suo hao :MK641516。5、gong cheng jun fa jiao tiao jian you hua 。cong fa jiao wen du 、pei yang shi jian 、yao ping zhuai su san ge fang mian dui gong cheng jun Y-pAUR123-Pq-PPT-6,20-O-UGThe Y-pAUR123-Pq-PPT-6-O-UGTjin hang you hua pei yang ,que ding le kuo yi fa jiao wen du wei 30℃,kuo yi fa jiao shi jian wei 38h,kuo yi yao ping zhuai su wei 270rpm。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自吉林大学的冯鹏程，发表于刊物吉林大学2019-06-25论文，是一篇关于西洋参论文,糖基转移酶论文,基因克隆论文,人参皂苷论文,功能分析论文,吉林大学2019-06-25论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自吉林大学2019-06-25论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：西洋参论文; 糖基转移酶论文; 基因克隆论文; 人参皂苷论文; 功能分析论文; 吉林大学2019-06-25论文;