李晋1（通讯作者)徐尚福2白国辉1罗果1朱姜1
(1遵义医学院医学与生物学研究中心563000)
(2遵义医学院药理学教研室/基础药理省部共建教育部重点实验室563000)
【摘要】目的观察四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝脏细胞角蛋白8(Cytokerantin-8,CK8)表达的变化。方法雄性SD大鼠20只，随机分为空白对照组和肝纤维化组，肝纤维化组采用10%四氯化碳1ml/kg，2次/每周，共12周诱导大鼠肝纤维化模型，空白对照组给予等量生理盐水。第12周末收集大鼠的外周血和肝脏；外周血离心获得血清后检测肝功能指标ALT、AST；石蜡切片的HE染色观察大鼠肝脏的病理学改变；RealtimeRT-PCR检测肝纤维化大鼠肝脏组织中CK8的mRNA表达。结果四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠的外周血肝功能生化检测ALT和AST较空白对照组显著升高(P<0.05)；肝纤维化组大鼠肝脏HE染色可见明显纤维化改变；四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝脏组织中CK8mRNA的表达较空白对照组明显升高(P<0.05)。结论CK8在四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝脏中的表达升高。
【关键词】肝纤维化细胞角蛋白8大鼠
【中图分类号】R3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）20-0144-02
细胞角蛋白8又称角蛋白8(keratin-8,K8)，表达于单层、复层和假复层上皮，属碱性角蛋白(Ⅱ型角蛋白)。在正常肝脏中CK8与CK18以“肝细胞型”角蛋白成对表达。研究表明，CK8与多种肝脏疾病有关，如CK8在四氯化碳诱导的急性小鼠肝损伤时高表达[1]，但作者尚未见有关化学诱导肝纤维化形成后对细胞角蛋白CK8表达影响的报道。因此，本实验研究四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝脏中CK8的表达，为肝纤维化的机制研究提供数据积累。
1材料
1.1试剂与药品ALT和AST检测试剂盒购自南京建成生物技术有限公司(批号20120814)；四氯化碳购自阿拉丁化学试剂有限公司(批号20110513)，橄榄油购自国药集团化学试剂有限公司(批号20120125)，PCR试剂盒与引物购自TaKaRa公司(批号BK5906)。
1.2主要仪器RealtimeRT-PCR仪型号CFX-connect购自美国BIO-RAD公司，全自动生化仪型号AU-5421购自美国BeckmanCoulter公司，显微镜型号DM4000B购自德国Leica公司。
1.3实验动物SD大鼠20只，雄性，体重200±20g，SPF级，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心，合格证号：SCXK(渝)2012-0005。
2方法
2.1动物分组及模型诱导大鼠随机分为两组，正常对照组(control，10只)和肝纤维化组(hepaticfibrosis，10只)，肝纤维化组大鼠每周2次给予10%四氯化碳1m/kg皮下注射，空白对照组给予等量生理盐水，共12周，收集大鼠外周血和肝组织备用。
2.2肝功能检测按说明书采用谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)测定试剂盒测定血清中的ALT、AST含量。
2.3肝脏病理学检测相同部位肝脏组织常规石蜡包埋切片。苏木素染色，伊红染色(H.E.)，显微镜观察。
2.4肝脏总RNA提取50mg肝脏于1mlRNAisoPlus液中匀浆，200μl三氯甲烷萃取后取上清液，加等量异丙醇沉淀。所得RNA用现配75%乙醇洗涤后，50μlDEPC处理后的水稀释。总RNA采用紫外分光光度计法检测RNA浓度及质量，以A260/A280的比值在1.8-2.0之间认为所提RNA质量良好，并统一RNA浓度备用。
2.5RealtimeRT-PCR检测大鼠肝脏CK8mRNA的表达总RNA采用RT-PCR两部法进行扩增目的片段。采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，然后采用SYBRGreen法进行RealtimeRT-PCR，CK8的特异性引物有宝生物(大连)有限公司设计合成。引物序列(5-3排列)如下，CK8上游：acgagatcaacttcctccgg，下游：atctcctcatactgggcacg；β-actin上游：ggagattactgccctggctccta，下游：gactcatcgtactcctgcttgctg。结果采用相对定量法进行分析[2]。
2.6数据统计所有数据以x-±S表示，组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05认为具有统计学差异。
3结果
3.1大鼠肝功能与肝脏形态学结果正常大鼠肝脏形态正常，肝小叶结构完整，排列有序。四氯化碳诱导的肝纤维化模型组多数肝细胞发生脂肪变性，肝小叶失去正常结构，胶原纤维增生，并形成假小叶，另可见汇管区及中央静脉周围大量炎性细胞侵润。肝功能结果显示ALT和AST显著升高(P<0.01)。
图1四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型肝功能和病理学改变。(x-±S，n=10，与空白对照组比较，**P<0.01)
3.2大鼠肝脏CK8mRNA表达表2可见四氯化碳诱导12周后，肝纤维化形成过程中，RealtimeRT-PCR检测肝纤维化大鼠肝组织中CK8mRNA表达明显升高(P<0.01)。
4讨论
肝纤维化是许多慢性肝病共同的病理过程，是肝组织对各种慢性肝损伤的修复反应。肝纤维化病变发生、发展机制非常复杂，涉及到氧化损伤、营养代谢、炎症反应、免疫因素等多方面因素。深入研究肝纤维化的发病机制，可能会为肝纤维化的治疗提供新的靶点。细胞角蛋白(cytokeratin,CK)属于细胞骨架蛋白家族，是上皮细胞表达的中间丝蛋白之一，对维持上皮细胞形态发挥重要作用[3]，分为碱性细胞角蛋白(Ⅱ型细胞角蛋白，CK1-9)和酸性角蛋白(Ⅰ型细胞角蛋白，CK10-20)两个亚家族，CK8蛋白属于Ⅱ型细胞角蛋白。有研究显示，CK8在一些肝脏疾病中发生改变。葛文松等利用蛋白质组学方法检测发现在乙型肝炎病毒相关性肝纤维化的肝脏组织中，CK8表达增高[1]。周思朗等[4]在对肝癌干细胞生物学行为研究中发现CK18阳性的肝癌细胞成瘤能力高于阴性的肝癌细胞。本研究通过RealtimeRT-PCR方法对正常对照组和肝纤维化组肝组织中CK8进行检测，发现肝纤维化组CK8mRNA表达明显高于正常对照组，表明四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的肝脏组织中CK8表达增高，说明CK8可能参与肝纤维化的形成。
参考文献
[1]赵四海,楚雍烈,刘恩岐.角蛋白8在四氯化碳诱导的小鼠肝损伤中的表达[J].浙江大学学报(医学版),2010,39(1):37-42.
[2]Shang-FuXu,Li-MeiYu,Zhen-HaiFan,etal.ImprovementofginsenosideRg1onhematopoieticfunctionincyclophosphamide-inducedmyelosuppressionmice[J].EuropeanJournalofPharmacology,2012,695:7-12.
[3]AslamMB,SahasrabudheN.Cytokeratin(CK7andCK20)switchinginthenaturalhistoryofpulmonarysmallcellcarcinoma:aninterestingbutunpublishedphenomenon[J].JClinPathol,2011,64(4):367-368.
[4]周思朗,李鹏,曹漫明,等.大鼠肝癌干细胞生物学行为研究[J].中华肝脏病杂志,2006,14(5):364-366.