导读:本文包含了敲除效率论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:Dicer,小菜蛾,CRISPR,Cas9,RNAi
敲除效率论文文献综述
于慧慧[1]（2019）在《Dicer敲除对小菜蛾生长发育及RNAi效率的影响》一文中研究指出Dicer是一种在进化上高度保守的核糖核酸内切酶,属于RNase III家族的成员,可以特异识别并切割双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)。在大部分昆虫中,Dicer分为两个同源基因Dicer-1(Dcr-1)和Dicer-2(Dcr-2),二者分别作用在RNAi的miRNA途径和siRNA途径,同时Dcr-1可以参与生物体的生长发育调控。目前,小菜蛾上的Dicer还未有具体研究。因此,本实验利用CRISPR/Cas9技术分别敲除小菜蛾Dcr-1(PxDcr-1)和Dcr-2(PxDcr-2)基因,分析其对小菜蛾的影响,明确其功能。本实验通过PCR扩增拼接获得PxDcr-1和PxDcr-2两个基因,PxDcr-1的ORF为7524bp,编码2507个氨基酸,PxDcr-2的ORF为5085bp,编码1694个氨基酸,二者结构域基本相同,都含有解螺旋结构域、Dicer二聚体结构域、N端结构域、PAZ结构域以及两个RNaseⅢ结构域。但是PxDcr-2相比PxDcr-1缺少Dicer-PBD(partner-binding domain of the endo-ribonuclease Dicer)和dsRBD结构域(double-stranded RNA binding domain),这种结构上的差异可能导致二者功能上的不同。应用CRISPR/Cas9技术分别敲除PxDcr-1和PxDcr-2基因,获得基因敲除品系。PxDcr-1敲除获得两个突变品系,其中一个突变品系在PAM结构(NGG)后一个碱基处插入5个碱基的同时缺失一个碱基,表示为GGTAT-,另一个突变品系在PAM结构后缺失两个碱基,表示为--;PxDcr-2敲除同样获得两个突变品系,基因类型均表现在PAM结构后插入5个碱基,分别为AACGA和GATCC。这些突变品系从基因层面分析显示均可以使蛋白质翻译提前终止。与野生型小菜蛾相比,PxDcr-1敲除品系的小菜蛾不仅具有高死亡率、低羽化率、低产卵量、低孵化率等特征,而且卵巢相对细小,卵巢管干瘪,成熟卵量少;但PxDcr-2敲除品系小菜蛾具有正常的生长发育和繁殖能力。实验选取了Pxyellow和Pxwhite两个标靶基因,合成对应dsRNA后分别注射野生型品系和PxDcr-2敲除品系小菜蛾进行RNAi实验,结果显示野生型品系相应靶标基因表达量与对照组相比出现显着下降,成功实现RNAi现象;而PxDcr-2敲除品系各时期的靶标基因表达量与对照组相比均未出现显着差异,这说明敲除PxDcr-2后小菜蛾RNAi效果明显降低。本实验获得了PxDcr-1和PxDcr-2的敲除品系,这为以后的相关研究提供了实验材料,同时研究结果表明PxDcr-1参与调控了小菜蛾的生殖和发育,PxDcr-2则在RNAi通路中发挥着重要作用。(本文来源于《福建农林大学》期刊2019-04-01）
许琼丹,王永泽,王金华,赵筱[2]（2019）在《大肠杆菌乙醇工程菌mglB基因的敲除对混合糖发酵木糖利用效率的影响》一文中研究指出为明晰葡萄糖非PTS转运系统相关基因对木糖利用效率的影响,探讨葡萄糖PTS和非PTS转运系统是否对木糖利用存在协同影响,以大肠杆菌工程菌SZ470和SZ470P为出发菌株,通过RED同源重组技术敲除葡萄糖转运基因mglB,构建mglB单缺陷菌SZ470M和ptsG/mglB双缺陷菌SZ470PM。比较四株菌的混合糖(3%葡萄糖+2%木糖)发酵情况以及木糖转运代谢相关基因的转录水平。实验结果表明,SZ470M相较于出发菌株SZ470,其发酵性能无明显变化;SZ470PM的木糖消耗速度为0.37 g/L,乙醇产量为23.25 g/L,转化率为82.6%,相比于出发菌株SZ470P分别提高了32%,9.8%和5.8%。基因转录水平的分析也表明菌株SZ470P和SZ470PM的木糖转运与代谢基因的转录水平上调。综上,ptsG和mglB基因的双敲除对木糖利用效率的提高有协同影响,为促进木质纤维素作为发酵原料时木糖的高效利用提供理论依据。(本文来源于《生物技术通报》期刊2019年06期）
李哲[3]（2018）在《截短gRNA降低牛MSTN基因敲除脱靶效率的研究》一文中研究指出肌肉生长抑制素(MSTN)又被称为GDF-8,是在1997年被发现的一种与骨骼肌生长发育相关的负调控因子,其活性的降低或丧失,会引起动物肌肉的过度发育,表现为双肌性状。CRISPR/Cas9技术是由gRNA指导Cas9内切酶特异性识别基因靶位点并且进行基因编辑的技术。CRISPR/Cas9技术拥有很多优势,但是也有脱靶的弊端。本实验所用的质粒CRISPR/Cas9-B,包含针对牛MSTN基因第二外显子而设计的gRNA,可以引导Cas9蛋白作用于AGAACCAGGAGAAGATGGACTGG位点。然而通过检索,我们发现除了牛2号染色体上的打靶位点,在4号染色体receptor-type tyrosine-protein phosphatase N2的5’端有17个碱基与gRNA匹配,1号染色体leukocyte immunoglobulin-like receptor的5’端有14个碱基与gRNA匹配,10号染色体kinectin isoform X7的5’端有16碱基与gRNA匹配,这些位点均为潜在脱靶点。为了检测脱靶效率,我们在这些位点两端分别设计引物用于PCR检测。为降低CRISPR/Cas9的脱靶效率,分别设计了截短1 bp、2 bp、3 bp和5 bp的gRNA,利用这些截短的gRNA构建CRISPR/Cas9质粒,分别命名为CRISPR/Cas9-19、CRISPR/Cas9-18、CRISPR/Cas9-17和CRISPR/Cas9-15。使用电转染的方法将这些质粒分别导入牛胎儿成纤维细胞中,利用流式细胞仪进行单细胞分离,并在96孔板内培养,以此获得基因敲除的细胞株。提取基因组,进行PCR扩增和电泳检测,将有目的条带的样品进行测序分析。最后比较截短1 bp、2 bp、3 bp、5 bp的g RNA所构建的CRISPR/Cas9质粒与CRISPR/Cas9-B质粒在打靶和脱靶位点的作用效率。结果显示,在MSTN打靶位点CRISPR/Cas-B、CRISPR/Cas9-19、CRISPR/Cas9-18、CRISPR/Cas9-17和CRISPR/Cas9-15引起基因突变的效率分别为62.16%、17.39%、7.69%、74.29%和3.85%;在4号染色体脱靶位点(2号引物)的作用效率分别为52.86%、0、0、8.82%和0;在1号染色体脱靶位点(9号引物)的效率分别为44.87%、51.72%、86.36%、0和50%;在10染色体脱靶位点(26号引物)的作用效率都为0。CRISPR/Cas9-17质粒在MSTN位点引起基因突变的效率比CRISPR/Cas9-B质粒的效率高,同时在叁个脱靶位点的作用效率有明显降低,并且在统计学上有极显着差异(P<0.01)。CRISPR/Cas9-17质粒达到了在不影响目的基因打靶效率的同时减小了脱靶现象的目的。本研究成功地在牛胎儿成纤维细胞敲除了牛MSTN基因,同时通过截短gRNA长度使CRISPR/Cas9技术的脱靶问题得以改善,使CRISPR/Cas9技术在牛羊育种领域能更好的发挥作用,为家畜和畜牧育种带来更大的机遇。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2018-04-25）
王芳权,范方军,李文奇,朱金燕,王军[4]（2016）在《利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻Pi21基因的效率分析》一文中研究指出利用CRISPR/Cas9技术,针对Pi21基因的两个靶位点(靶位1和靶位2),构建基因敲除载体,转化水稻品种南粳9108。经PCR鉴定,获得了28株T0代阳性转基因植株。对靶位点酶切检测发现,靶位1突变效率为78.57%,靶位2突变效率为92.86%;靶位1和靶位2同时突变的效率为78.57%,突变效率较高。通过对靶位点进行测序,发现靶位点突变类型较多,包括碱基缺失、碱基插入、碱基缺失后插入其他碱基和大片段DNA缺失等类型。对突变株系进行氨基酸预测,发现大部分株系都存在移码突变现象而使基因突变彻底,少数株系表现为部分氨基酸的缺失或变异。成功敲除了水稻Pi21基因,并对突变效率和类型进行了分析,为进一步验证Pi21基因功能、培育广谱抗稻瘟病的水稻新品系奠定了基础。(本文来源于《中国水稻科学》期刊2016年05期）
张峰华,王厚鹏,黄思雨,熊凤,朱作言[5]（2016）在《两种密码子优化的Cas9编码基因在斑马鱼胚胎中基因敲除效率的比较》一文中研究指出为在斑马鱼中获得特异且高效的基因敲除,多个实验室独立人工合成了序列彼此不一的Cas9 c DNA序列,并克隆入不同的体外转录载体。本文选取两种斑马鱼密码子优化的Cas9编码序列(z Cas9_bz和z Cas9_wc),对斑马鱼胚胎中的7个基因(外源egfp及内源chd、hbegfa、th、eef1a1b、tyr、tcf7l1a)分别进行敲除,通过PCR产物测序、克隆测序和表型分析比较了两种Cas9的敲除效率。结果发现,z Cas9_wc在各种情况下都显现出较高的敲除效率,而z Cas9_bz的效率相对较低。(本文来源于《遗传》期刊2016年02期）
王瑶,许杨,陈楠,徐欣怡,刘伟丰[6]（2015）在《在大肠杆菌中利用SCLM系统进行高效率λ-Red基因敲除/整合的新策略》一文中研究指出【目的】传统采用的λ-Red体系在大肠杆菌染色体上进行基因敲除/整合操作时存在操作繁琐、假阳性率高、多基因连续敲除/整合不稳定等问题。本研究基于上述问题建立一种便于基因构建、高筛选效率(100%)、具有统一技术步骤的λ-Red敲除/整合系统,为提高基因功能研究和代谢工程改造工作效率奠定基础。【方法】采用新的p SC101衍生复制起始位点消除假阳性;利用高拷贝数质粒和多克隆位点实现快速遗传构建操作;采用Cre/Lox P抗性消除位点便于多基因连续整合。选择一系列初级代谢重要基因靶点进行敲除/整合。【结果】构建了一套新型λ-Red质粒系统(SC101-Cre-Lox P-MCS,SCLM系统)。打靶片段经电转化受体细胞后在双抗性平板上筛选阳性克隆,基因敲除/整合的效率均可以达到100%。【结论】新建立的基因敲除与整合方法提高了基因重组效率,大幅度减少了相关操作的步骤,缩短了研究周期。该方法的建立为基因功能研究和构建新遗传特性的工程菌株提供了有力的工具。(本文来源于《微生物学通报》期刊2015年04期）
全韬[7]（2014）在《CRISPR/Cas9技术用于细胞系基因敲除效率的研究》一文中研究指出目的:探讨CRISPR/Cas9技术在构建基因沉默稳定细胞系的效率。方法:构建表达p53基因sg RNA的CRISPR/Cas9系统载体p X260-p53,转染293T细胞,经嘌呤霉素筛选后,提取细胞系基因组进行测序。结果:CRISPR/Cas9系统载体p X260-p53能敲除细胞中的p53基因,敲除效率为29.41%。结论:成功构建敲除p53基因的CRISPR/Cas9系统载体p X260-p53并检测其敲除效率,为构建基因沉默稳定细胞系提供了新思路。(本文来源于《生物技术世界》期刊2014年12期）
李湘萍,黄时海,石德顺,李宁[8]（2007）在《转染方法对肌肉生长抑制素基因敲除载体转染效率的影响》一文中研究指出本研究主要探讨转染方法对不同细胞系的转染效果。实验采用电穿孔和脂质体转染方法,将线性化的绵羊肌肉生长抑制素基因(myostatin)药物正负筛选(PNS)打靶载体pLoxp-1.4K-4.3K DNA导入体外培养的绵羊胎儿和成年绵羊耳部成纤维细胞中,而后采用G418和GANC进行药物抗性细胞克隆筛选和培养。结果发现,脂质体法对myostatin基因敲除载体的转染效果明显优于电击法,但电穿孔法对细胞类型的依赖性较小;采用与载体基因型相同的细胞系,两种转染方法的转染效率均略高于对照成年绵羊成纤维细胞系。(本文来源于《广西农业生物科学》期刊2007年S1期）
敲除效率论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为明晰葡萄糖非PTS转运系统相关基因对木糖利用效率的影响,探讨葡萄糖PTS和非PTS转运系统是否对木糖利用存在协同影响,以大肠杆菌工程菌SZ470和SZ470P为出发菌株,通过RED同源重组技术敲除葡萄糖转运基因mglB,构建mglB单缺陷菌SZ470M和ptsG/mglB双缺陷菌SZ470PM。比较四株菌的混合糖(3%葡萄糖+2%木糖)发酵情况以及木糖转运代谢相关基因的转录水平。实验结果表明,SZ470M相较于出发菌株SZ470,其发酵性能无明显变化;SZ470PM的木糖消耗速度为0.37 g/L,乙醇产量为23.25 g/L,转化率为82.6%,相比于出发菌株SZ470P分别提高了32%,9.8%和5.8%。基因转录水平的分析也表明菌株SZ470P和SZ470PM的木糖转运与代谢基因的转录水平上调。综上,ptsG和mglB基因的双敲除对木糖利用效率的提高有协同影响,为促进木质纤维素作为发酵原料时木糖的高效利用提供理论依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
敲除效率论文参考文献
[1].于慧慧.Dicer敲除对小菜蛾生长发育及RNAi效率的影响[D].福建农林大学.2019
[2].许琼丹,王永泽,王金华,赵筱.大肠杆菌乙醇工程菌mglB基因的敲除对混合糖发酵木糖利用效率的影响[J].生物技术通报.2019
[3].李哲.截短gRNA降低牛MSTN基因敲除脱靶效率的研究[D].内蒙古大学.2018
[4].王芳权,范方军,李文奇,朱金燕,王军.利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻Pi21基因的效率分析[J].中国水稻科学.2016
[5].张峰华,王厚鹏,黄思雨,熊凤,朱作言.两种密码子优化的Cas9编码基因在斑马鱼胚胎中基因敲除效率的比较[J].遗传.2016
[6].王瑶,许杨,陈楠,徐欣怡,刘伟丰.在大肠杆菌中利用SCLM系统进行高效率λ-Red基因敲除/整合的新策略[J].微生物学通报.2015
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[8].李湘萍,黄时海,石德顺,李宁.转染方法对肌肉生长抑制素基因敲除载体转染效率的影响[J].广西农业生物科学.2007