本文主要研究内容
作者李旺（2019）在《小麦内质网氧化还原酶的分子改造与毕赤酵母重组高效表达》一文中研究指出：小麦内质网氧化还原酶（wEro1）具有显著提高面粉加工品质的能力,有望成为提高面粉筋力的新型生物改良剂。但其用于工业生产应用,仍有一定的局限性。受催化效率、表达量、稳定性等限制,生产成本相对较高。本文以wEro1为研究对象,在对野生型wEro1的基本性质进行探讨的基础上,通过理性设计对其进行分子改造,最终获得了活性得到提升的正向突变体。同时,利用毕赤酵母表达系统表达了野生型wEro1,经优化后实现了wEro1的异源高效表达。主要研究内容:（1）wEro1基本性质的测定。大肠杆菌重组wEro1的比酶活为201.35±14.37 U/mg;最适反应pH为7.5,最适反应温度为35℃;在低温和中性条件下稳定性较好;Cu2+等金属离子对wEro1表现出明显的抑制作用;SDS、Tween-20和Triton X-100对wEro1的活性都表现出一定的抑制作用。（2）wEro1的分子改造。以序列同源性分析和同源建模结构为指导,通过理性设计,选择了处于活性位点或活性调控相关的9个半胱氨酸残基进行定点突变,应用重叠延伸PCR技术实现了9个半胱氨酸残基的定点突变,进一步构建了重组突变型wero1基因的原核表达载体。（3）正向突变体的筛选。在大肠杆菌表达体系中,成功可溶表达了8个突变型重组wEro1,筛选得到了5个活性得到提升的正向突变体,分别是:C105A（wEro1的第105位半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基）、C124A、C149A、C220A和C229A,其中,活性增加最为明显的是C220A和C105A,分别增加了119.64%和101.74%的活性。（4）wEro1在毕赤酵母中的高效表达。成功构建了wEro1的真核表达载体pPICZαA-wero1,并实现了其在毕赤酵母GS115中的表达。通过单因素试验和正交试验优化了表达条件,优化后其表达量可达53.24?2.11 U/mL。等体积发酵液下,毕赤酵母表达系统表达量是大肠杆菌表达系统表达量的14.7倍,实现了wEro1的高效表达。
Abstract
xiao mai nei zhi wang yang hua hai yuan mei （wEro1）ju you xian zhe di gao mian fen jia gong pin zhi de neng li ,you wang cheng wei di gao mian fen jin li de xin xing sheng wu gai liang ji 。dan ji yong yu gong ye sheng chan ying yong ,reng you yi ding de ju xian xing 。shou cui hua xiao lv 、biao da liang 、wen ding xing deng xian zhi ,sheng chan cheng ben xiang dui jiao gao 。ben wen yi wEro1wei yan jiu dui xiang ,zai dui ye sheng xing wEro1de ji ben xing zhi jin hang tan tao de ji chu shang ,tong guo li xing she ji dui ji jin hang fen zi gai zao ,zui zhong huo de le huo xing de dao di sheng de zheng xiang tu bian ti 。tong shi ,li yong bi chi jiao mu biao da ji tong biao da le ye sheng xing wEro1,jing you hua hou shi xian le wEro1de yi yuan gao xiao biao da 。zhu yao yan jiu nei rong :（1）wEro1ji ben xing zhi de ce ding 。da chang gan jun chong zu wEro1de bi mei huo wei 201.35±14.37 U/mg;zui kuo fan ying pHwei 7.5,zui kuo fan ying wen du wei 35℃;zai di wen he zhong xing tiao jian xia wen ding xing jiao hao ;Cu2+deng jin shu li zi dui wEro1biao xian chu ming xian de yi zhi zuo yong ;SDS、Tween-20he Triton X-100dui wEro1de huo xing dou biao xian chu yi ding de yi zhi zuo yong 。（2）wEro1de fen zi gai zao 。yi xu lie tong yuan xing fen xi he tong yuan jian mo jie gou wei zhi dao ,tong guo li xing she ji ,shua ze le chu yu huo xing wei dian huo huo xing diao kong xiang guan de 9ge ban guang an suan can ji jin hang ding dian tu bian ,ying yong chong die yan shen PCRji shu shi xian le 9ge ban guang an suan can ji de ding dian tu bian ,jin yi bu gou jian le chong zu tu bian xing wero1ji yin de yuan he biao da zai ti 。（3）zheng xiang tu bian ti de shai shua 。zai da chang gan jun biao da ti ji zhong ,cheng gong ke rong biao da le 8ge tu bian xing chong zu wEro1,shai shua de dao le 5ge huo xing de dao di sheng de zheng xiang tu bian ti ,fen bie shi :C105A（wEro1de di 105wei ban guang an suan can ji tu bian wei bing an suan can ji ）、C124A、C149A、C220Ahe C229A,ji zhong ,huo xing zeng jia zui wei ming xian de shi C220Ahe C105A,fen bie zeng jia le 119.64%he 101.74%de huo xing 。（4）wEro1zai bi chi jiao mu zhong de gao xiao biao da 。cheng gong gou jian le wEro1de zhen he biao da zai ti pPICZαA-wero1,bing shi xian le ji zai bi chi jiao mu GS115zhong de biao da 。tong guo chan yin su shi yan he zheng jiao shi yan you hua le biao da tiao jian ,you hua hou ji biao da liang ke da 53.24?2.11 U/mL。deng ti ji fa jiao ye xia ,bi chi jiao mu biao da ji tong biao da liang shi da chang gan jun biao da ji tong biao da liang de 14.7bei ,shi xian le wEro1de gao xiao biao da 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自华南理工大学的李旺，发表于刊物华南理工大学2019-10-23论文，是一篇关于小麦内质网氧化还原酶论文,酶活性论文,分子改造论文,高效表达论文,华南理工大学2019-10-23论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自华南理工大学2019-10-23论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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