一、我国加入WTO对广西养猪业的影响（论文文献综述）
张晓茜[1]（2021）在《PEDV感染的猪睾丸细胞miRNA-mRNA表达谱及miRNA影响PEDV复制的机制研究》文中提出自2010年,猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异毒株的出现给世界养猪业带来了巨大损失。猪流行性腹泻（PED）疫苗的问世,发挥了一定的预防作用。但临床上该变异毒株导致的仔猪死亡率仍居高不下,因此,通过不同思路研究PEDV变异毒株的致病机理、免疫机理及调控PEDV复制机理,对防控该病具有重要意义。本研究首先筛选出适用于PEDV变异毒株体外研究的细胞模型-猪睾丸细胞系（ST cells）。在此基础上,通过高通量测序技术,对PEDV变异毒株和其传代致弱毒株分别进行了small RNA和转录组测序及靶向关系分析,研究了PEDV强弱毒株在致病性和影响宿主免疫应答上的差异。研究发现,PEDV能影响miR-155-5P和miR-128在ST细胞中的表达,并且能分别通过靶向PEDV NSP2和宿主真核起始因子2α（e IF2α）,以及NSP13和宿主CBLB基因,抑制PEDV变异毒株YN15的复制。本研究还探索了宿主e IF2α、ATG5、ATG12和CBLB基因在YN15毒株感染ST细胞过程中的作用。主要研究内容如下:1.PEDV变异毒株体外感染细胞模型的筛选为了筛选PEDV变异毒株YN的体外感染细胞模型,本研究运用RT-q PCR、间接免疫荧光和Western Blot方法,比较分析了PEDV变异毒株YN15分别感染ST细胞、Vero细胞和IPEC-J2细胞后的病毒增殖情况。研究结果发现,YN15毒株能在ST细胞中稳定增殖,病毒滴度和病毒蛋白表达量均能达到较高水平。并且PEDV变异毒株的传代致弱株YN144在ST细胞中也能有效复制。倒置显微镜下观察,ST细胞感染PEDV变异毒株后病变明显,易于实验过程中随时观察病毒感染进度,而且其为猪源细胞系,具有完整的信号通路,因此选用ST细胞作为PEDV变异毒株体外复制机制研究的细胞模型。2.PEDV变异强弱毒株感染的猪睾丸细胞miRNA-mRNA表达谱分析自PEDV变异毒株出现后,基于经典毒株CV777的疫苗对其控制能力有限。本实验室分离出变异的PEDV YN1毒株,对其体外传代得到YN15强毒株和YN144致弱毒株。本实验室前期通过动物感染试验发现,YN15毒株可以造成仔猪严重的腹泻,而致弱株YN144却不致病,并可以诱导仔猪的先天免疫反应和中和抗体反应。为探究以上现象发生的原因,本研究采用高通量测序技术开展了对YN15毒株和YN144毒株分别感染ST细胞后small RNA和转录组的测序工作,分别获得了差异表达的miRNA和m RNA的表达谱。结果显示,在YN15与未感染细胞、YN144与未感染细胞、YN15与YN144感染细胞3个比较组中,分别有8039、8631和3310个显着性差异表达（DE）的m RNA（p-value<0.05）,以及36、36和22个DE miRNA,并分别用RT-q PCR和茎环RT-q PCR方法验证了测序结果的可靠性。运用miRanda预测了DE miRNA和DE m RNA的靶向关系,共发现了14140、15367和3771个显着性差异表达且呈负相关的miRNA-mRNA相互作用对。最后,使用Cytoscape软件构建了YN15毒株相对于YN144毒株感染ST细胞时,上调的miRNA与下调的m RNA,以及下调的miRNA与上调的m RNA的相互作用网络图。通过生物信息学分析发现,YN15毒株在黏着斑、细胞骨架调节、内吞和细菌入侵上皮细胞等信号通路优于YN144毒株,而YN144毒株在激活NF-κB、JAK-STAT、T细胞受体等免疫相关信号通路中优于YN15毒株。3.miR-155-5p对PEDV YN15毒株复制的影响对YN15毒株感染ST细胞后产生的DE miRNA-mRNA联合分析发现,内质网应激信号通路被激活,此现象提示细胞内质网应激可能与PEDV在ST细胞中的复制相关。研究发现,miR-155-5p可通过其种子序列靶向结合PEDV NSP2基因和宿主e IF2α基因的3’UTR,从而抑制YN15毒株在ST细胞中的复制,并且能够下调ATG5、ATG3等自噬相关基因的转录,下调其靶基因e IF2α的转录,上调MX1和MX2等先天性免疫和IL18、MAPK1等获得性免疫相关基因的转录;用e IF2α磷酸酶抑制剂（Sal003）孵育ST细胞,并接种YN15毒株发现,其能有效降低YN15的复制能力,促进NFKB1、MX2和MAPK1等宿主免疫相关基因的转录。4.miR-128对PEDV YN15毒株复制的影响通过对PEDV变异毒株感染ST细胞后DE miRNA-mRNA的联合分析发现,多个自噬相关基因被显着上调,此现象提示细胞自噬可能与PEDV在ST细胞中的复制相关。通过靶向序列分析发现,过表达miR-128可通过其种子序列靶向结合PEDV NSP13基因,抑制YN15毒株在ST细胞中的复制,并且下调ATG3、ATG5、ATG12等细胞自噬相关基因的转录,上调MX1、MX2等先天性免疫和IL18、MAPK1等获得性免疫相关基因的转录,抑制T细胞受体免疫抑制基因CBLB的转录。为了研究细胞自噬与YN15毒株在ST细胞中复制的关系,将ST细胞同时沉默ATG5和ATG12后,再感染YN15毒株,发现YN15毒株的复制能力显着下降,e IF2AK3等内质网应激相关蛋白、MX1、MX2和MAPK1等与宿主免疫相关基因的转录水平均下降。本研究还发现YN15毒株感染ST细胞后,细胞CBLB基因的转录水平显着上调,而此基因为一种T细胞受体抑制因子,能够抑制宿主的获得性免疫反应。分析发现,ST细胞CBLB基因的3’UTR能被miR-128种子序列靶向结合,抑制其转录。过表达CBLB蛋白能促进YN15毒株的复制,沉默CBLB基因能有效抑制YN15毒株的复制,且能上调NFKB1、IL18等免疫相关因子的表达。综上所述,本研究发现变异PEDV强弱毒株感染ST细胞后,miRNA和m RNA表达谱有显着性差异表达,绘制了miRNA-mRNA互作网络,揭示了miR-155-5p和miR-128抑制PEDV复制的分子机制,为抗PEDV药物分子设计提供了新线索。
丁小燕[2]（2021）在《猪流行性腹泻病毒变异毒株的分离鉴定及传代致弱研究》文中研究指明猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要临床特征的猪高度接触性肠道传染病。该病自1971年首次在英国暴发以来,相继在许多欧洲国家也都发生过暴发流行。20世纪80年代,中国、日本、韩国等一些亚洲国家也暴发了该病。在国内,由于PEDV和猪传染性胃肠炎（TGEV）二联灭活苗和二联活疫苗的广泛使用,使PED的流行得到了效控制。但2010年冬季以来,PEDV变异毒株的出现引起了我国10多个省份爆发仔猪腹泻,免疫过经典的PEDV疫苗的猪场也未能幸免,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。2013年美国首次报道了该病的流行,其分离株基因组序列与我国2010年流行的PEDV毒株同源性高达99.5%。针对PEDV的持续存在和流行,本研究对江苏某规模化养猪公司进行了四种腹泻病原监测及PEDV分子流行病学调查、PEDV的分离与鉴定,同时将PEDV分离毒株在Vero细胞上连续传代后对不同代次病毒的毒力和免疫原性进行了评价,研究结果为PED的防控提供依据。1 2015～2018年江苏某养猪场四种腹泻病原监测及PEDV分子流行病学调查PEDV、TGEV、猪δ冠状病毒（PDCoV）和轮状病毒（PoRV）是引起猪腹泻的常见病原,为了解江苏某规模化养猪公司四种腹泻病原的流行情况及不同PEDV毒株之间的遗传进化关系,本研究于2015～2018年采集临床腹泻猪群样品和健康猪群样品进行RT-PCR检测,挑选部分阳性样品进行PEDV S基因测序,与PEDV代表性的序列比对后构建系遗传进化树。监测结果表明,腹泻猪群样品的病原有PEDV、PDCoV和PoRV三种,816份临床腹泻样本总阳性率为51.35%,PEDV 阳性率为41.42%,产房仔猪PEDV阳性率高达61.94%。678份健康猪群样本中PEDV和PDCoV总阳性率为16.67%,PEDV 阳性率为10.91%。遗传进化结果表明测定的13株PEDV均属于变异毒株,其中4株属于GⅡ（a）亚群,8株属于GⅡ（b）亚群,1株属于S-INDEL亚群,与经典株CV777的氨基酸序列同源性仅为93.5%～95.1%。2猪流行性腹泻病毒JS2018株的分离鉴定将含PEDV的样品通过易感仔猪复壮后接种Vero细胞进行病毒分离,盲传5代后在接种的细胞中观察到明显的细胞病变,表现为感染细胞肿胀变圆,折光性增强,产生空泡和合胞体;RT-PCR鉴定结果为PEDV阳性,其他7种外源性病毒均为阴性;PEDV N蛋白单克隆抗体进行间接免疫荧光可以检测到特异性的绿色荧光;证实所分离的病毒为PEDV,将其命名为JS2018。分离毒在Vero细胞上的增殖曲线表明病毒接种后8 h开始增殖,40 h病毒增殖达到高峰。动物回归试验显示攻毒后3～5 d仔猪可以引起100%腹泻和死亡,表明该分离株为PEDV强毒株。S基因核苷酸序列分析结果表明分离毒属于GⅡ（b）亚群变异株。3猪流行性腹泻病毒JS2018株的传代致弱及免疫原性研究将PEDVJS2018株在Vero细胞上连续传代至120代,取P10、P40、P60、P90和P120病毒口服感染3～5日龄未喝初乳的健康仔猪进行致病性试验。结果表明P10和P40可以引起3～5日龄仔猪100%发病,P60可以引起3～5日龄仔猪50%发病,P90和P120攻毒组不引起3～5日龄仔猪发病,说明病毒在P90以后对仔猪的致病力已经明显下降。将PEDVJS2018株P40,P60,P90和P120病毒经肌肉和口服免疫后备猪后发现各免疫组猪只在免疫后均未出现腹泻、精神不振等临床症状。中和抗体检测结果表明在免疫后7d,所有免疫组猪只均产生了低水平的中和抗体,免疫后21 d,抗体水平明显上升,所有免疫猪的抗体均不低于1:37,同时口服免疫的各组猪只抗体明显高于肌肉免疫的各组,P120免疫组抗体略低于P90免疫组,说明PEDV JS2018传至P120的过程中免疫原性有所下降。以上结果表明,P90代的毒株可作为活疫苗候选株。
雷从从[3]（2021）在《猪δ冠状病毒（PDCoV）快速检测方法及单克隆抗体的制备研究》文中研究表明猪δ冠状病毒病主要由猪德尔塔冠状病毒（PORCINE DELTACORONAVIRUS,PDCOV）引起的一种肠源性、接触性、传染性疾病。各个日龄阶段的猪均易感,主要侵害5～21日龄的哺乳仔猪,仔猪感染后出现腹泻、呕吐等急性临床症状,死亡率高达100%。PDCOV感染后的临床症状、病理变化及流行病学与猪流行性腹泻病毒（PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS,PEDV）极为相似,且常发生混合感染,通过临床症状难以进行确诊,必须借助实验室检测方法才可鉴别诊断。核衣壳蛋白（NUCLEOCAPSID,N）是PDCOV的结构蛋白,且具有高度保守性,机体感染PDCOV后针对N蛋白产生的抗体最早,持续时间长,产生的抗体量也最多,N蛋白是建立免疫学方法的首选抗原。基于特异性单克隆抗体的免疫分析方法在建立特异性强、灵敏度高、重复性好的诊断试剂盒的应用上发挥重要作用,被广泛应用于疾病诊断、食品安全检测等领域中,当前国内外尚未有可用于猪δ冠状病毒诊断的商用试剂。因此,建立PEDV、PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR鉴别检测方法、基于重组N蛋白（R N）建立间接ELISA检测方法及研制抗PDCOV N蛋白的单克隆抗体对于PDCOV的临床诊断和防控具有重要意义。本研究建立了PEDV、PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR检测方法;将转化N蛋白基因进行重组融合表达和纯化,建立了基于重组N蛋白（RN蛋白）的间接ELISA抗体检测方法;以PEG 2000为融合剂将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,通过建立的间接ELISA抗体检测方法经过4～5次筛选得到阳性克隆,制备抗PDCOV N蛋白的单克隆抗体并进行鉴定。试验结果如下:1.PEDV、PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR方法的建立根据GENE BANK中收录的已知PEDV和PDCOV基因序列,用MEG ALIGN对PEDV M基因和PDCOV N基因进行比对分析,设计两对引物和TAQMAN-MGB探针对,优化最佳引物、探针浓度及反应条件,建立PEDV和PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验及临床实验,结果显示:PGEM-PEDV标准曲线的循环阈值（CT）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.998,拷贝数（X）与CT值之间的线性关系表达式为CT=﹣3.374 LGX+35.47;PGEM-PDCOV标准曲线的循环阈值（CT）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.998,拷贝数（X）与CT值之间的线性关系表达式为CT=﹣3.543 LGX+35.5。该方法对PEDV和PDCOV检出的灵敏度均可达101COPIES/μL,表明灵敏度高;该方法可特异性的检测出PEDV、PDCOV阳性样品,而对TGEV、SADS、PRO V阳性样品及PEDV、PDCOV阴性样品无特异性扩增反应,表明特异性强;该方法组内、组间重复性变异系数均小于1.5%,表明重复性好;用建立的该方法对临床90份小肠组织样品进行检测,结果显示:16份为PEDV阳性,15份为PDCOV阳性,PEDV和PDCOV双阳性为6份,而普通PCR检测出13份PEDV阳性,12份PDCOV阳性,PEDV和PDCOV双阳性为4份,表明建立的FQ-PCR方法检出率较普通PCR高。因此,本研究建立的PEDV和PDCOV二重TAQMANMGB FQ-PCR检测方法可为以上两种疫病的快速检测诊断提供方法。2.PDCOV N基因的重组表达及基于RN蛋白间接ELISA检测方法的建立本研究将PDCOV N基因扩增并克隆到PET 32A（+）载体上,经过诱导表达、纯化得到RN蛋白。优化最佳包被条件、血清稀释度、封闭条件、二抗稀释度,建立基于R N蛋白的间接ELISA检测方法,经过特异性、敏感性、重复性及临床血清样品检测,结果显示:本研究成功扩增了长度1029BP N基因,表达的RN蛋白约为60K D,WESTERN BLOT结果表明该RN蛋白具有良好反应原性。RN蛋白最佳包被浓度为2μG/M L;血清最佳稀释度为1:100,作用时间1 H;羊抗猪HRP-IG G最适稀释度为1:5000,作用时间为30 MIN;TMB最佳显色时间为10 MIN。该方法可检出PDCOV阳性血清样品,而与TGEV、PRO V、SADS、PEDV阳性血清样品及PDCOV阴性血清样品无反应,表明特异性强;用建立的间接ELISA检测方法检出的5份阳性样品最高稀释倍数与中和实验基本相同,表明该方法敏感性好。批内、批间变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。选取临床92份血清样品与中和实验结果做比较,两者符合率为93.3%。因此,本研究通过重组表达PDCOV N蛋白建立基于RN蛋白的间接ELISA血清学检测方法,为PDCOV监测及临床诊断提供了灵敏、特异且高效的工具。3.PDCOV N蛋白单克隆抗体的制备本研究用灭活并纯化的PDCOV细胞培养毒为抗原免疫纯系BALB/C小鼠,通过杂交瘤细胞技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,用有限稀释法进行亚克隆并用建立的间接ELISA检测方法进行筛选,同时鉴定单抗亚型,最终筛选出1株亚型为IGG且能稳定分泌抗PDCOV N蛋白单抗的杂交瘤细胞株1A4。将杂交瘤细胞扩大培养,收集腹水后对其进行纯化,经过稳定性、特异性、阻断性检测,结果显示:1A4单抗特异性好,可特异性与PDCOV抗原反应,而与PRO V、PEDV、SVA、SADS、TGEV等抗原均不发生交叉反应;稳定性好,经过7次连续传代后,其效价依然可达到1:128000;有一定的阻断性,能够被PDCOV诱导的特异性阳性血清有效阻断。制备的抗PDCOV N蛋白的单克隆抗体,为进一步建立基于RN蛋白单抗的阻断ELISA及应用于临床快速检测的胶体金检测试纸条等方法奠定了基础。
李金凤[4]（2020）在《广西地区猪圆环病毒2型流行病学调查及分离株致病性研究》文中认为猪圆环病毒（porcine circovirus,PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）,圆环病毒属（Circovirus）成员,是目前已知最小的动物DNA病毒之一。目前PCV主要包括三种病毒,PCV1、PCV2和PCV3。PCV2可分为6个基因亚型PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e和PCV2f。PCV2是猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的主要病原,单独感染PCV2的猪通常以亚临床感染为主,但会引起机体的免疫抑制,在与其他病毒共感染的情况下会加重临床疾病的发生。PCV2虽为DNA病毒,但其变异速率很高,近些年来PCV2的流行毒株呈现由PCV2b演化为PCV2d的趋势。为了解广西地区猪群中PCV2的流行情况和基因特性,本研究收集了2017-2019年广西壮族自治区6个地区42个猪场495份临床样品,通过PCR方法对PCV2进行检测,PCV2的总阳性率为39.6%（196/495）,2017、2018和2019年的阳性率分别为35.56%（48/135）,40.00%（66/165）和42.05%（82/195）,表明PCV2在广西地区的感染率呈逐年上升趋势。为了解PCV2的基因特性,对PCV2阳性的部分临床样本进行了ORF2和全基因组序列的扩增,共得到44个ORF2序列和18个全基因组序列。相似性分析表明,本研究获得的毒株全基因组序列的相似性为94.1%-99.9%。Cap蛋白氨基酸比对表明,共存在14个氨基酸变异位点,这些变异位点大部分在Cap蛋白的抗原表位上。遗传进化分析表明,本研究获得的PCV2毒株分别属于PCV2a,PCV2b和PCV2d亚型,其中有4个属于PCV2a,15个属于PCV2b,25个属于PCV2d,表明PCV2d毒株为目前广西地区主要的流行毒株。为明确当前流行毒株的致病性,对广西地区的当前流行毒株PCV2d进行分离鉴定,通过动物回归试验进行致病性研究。结果表明,分离的流行株PCV2d-AG43对猪体有明显的致病性,攻毒后临床症状主要表现为背毛粗糙和食欲下降。攻毒28天后产生了明显的体重下降,临床解剖肉眼可见病变主要表现为淋巴结出血和肿大。攻毒后产生明显的病毒血症,14天最高,随后下降。攻毒后28天各组织脏器中（心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、腹股沟和颌下淋巴结）均能检测到PCV2,其中肺脏,颌下淋巴结和腹股沟淋巴结中病毒较高,可达106拷贝数/克。组织病理学观察肺脏主要表现为肺泡壁增厚,炎性细胞浸润;腹股沟淋巴结表现为淋巴细胞减少。这些结果表明本研究分离的广西地区PCV2d流行株具有很强的致病性,如果不及时防控,可能给养猪业造成经济损失。PCV2在猪群中具有很高的阳性率,除了猪之间的传播,是否还有其它可能的传播途径（包括蚊等媒介）需要进一步研究。本研究采集了云南省思茅地区猪场中94只蚊子样品,通过PCR方法对蚊子中PCV2的阳性率进行检测,蚊子中PCV2总阳性率为15.96%（15/94）。为了研究蚊子中PCV2的基因特性,对ORF2序列进行扩增和测序,共获得14条序列,相似性分析表明蚊子中ORF2基因的核苷酸相似性为89.5%-99.9%,对应的氨基酸相似性为86.2%-99.6%。氨基酸比对表明,蚊子中PCV2 Cap蛋白共存在32个氨基酸变异位点。遗传进化分析表明,蚊子中PCV2存在PCV2a、PCV2b和PCV2d 3种亚型,其中PCV2d为主要的基因型,这与当前猪群中PCV2的流行趋势相符。这些结果表明蚊子可能作为PCV2的机械性传播载体,在PCV2的传播中发挥作用,猪场应改善环境,加强蚊子的消除。
张静[5]（2019）在《猪圆环病毒3型巢式PCR检测方法的建立及应用》文中提出猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是一种新的圆环病毒,可引起猪的皮炎和肾病综合征、繁殖障碍及多系统炎症等,最初于2016年在美国被发现,随后在韩国、巴西、意大利、波兰等国家陆续报道。近两年来,PCV3已在我国多个省市被发现且感染范围越来越广泛,对养猪业构成的潜在威胁已不容忽视。然而,针对PCV3的研究尚处于起步阶段,要了解该病毒在猪群中的感染与传播情况,及时监测和分析是首要的步骤。因此,建立准确而快速的检测方法将有助于有效控制PCV3的传播,特别是将该方法用于临床病例的监测及种猪贸易检验检疫。本研究通过PCV3巢式PCR检测方法的建立和应用,旨在为监测安徽地区猪群中PCV3的感染情况,进而为深入开展PCV3的流行病学等研究提供技术支撑。1、PCV3巢式PCR检测方法的建立本研究根据GenBank中登录的PCV3全基因序列（登录号:MF084994）设计内、外2对巢式PCR特异性引物,并通过以下试验建立PCV3巢式PCR检测方法:（1）设置 54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃和 60℃7 组不同的退火温度进行退火温度的筛选以及通过对第一轮PCR扩增产物按100倍、50倍、10倍3个稀释倍数进行稀释作为第二轮PCR模板进行PCR反应条件的优化试验。（2）利用建立的该方法对PCV3与猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）5种常见病毒的检测进行特异性试验。（3）利用建立的该方法与普通PCR方法同时对（10-10～10-1）不同稀释度标准质粒的检测进行灵敏性试验。（4）通过对10-8、10-9、10-10拷贝/uL浓度标准质粒的批间和批内检测对建立的该方法进行重复性试验。（5）利用建立的该方法与商品化PCV3实时荧光PCR检测试剂盒同步检测临床收集的血清样品,使用Kappa分析比较两种方法的检测结果进行符合率验证。结果显示:（1）58℃为本研究建立的PCV3巢式PCR的最佳退火温度,当一扩产物作50倍稀释进行二扩获得的扩增结果最好。（2）除PCV3扩增出预期的目的条带外,PCV2、CSFV、PRV、PRRSV、PEDV 5种病毒均无目的条带出现。（3）该方法的最低检测限为1.74×10拷贝/μL,较普通PCR的灵敏度高105倍。（4）10-8和10-9拷贝/uL的标准品模板平行样品均有目的条带的出现,但模板浓度为10-10拷贝/uL时,3份平行样品均无目的条带;10-8、10-9拷贝/uL的标准品模板3次试验均出现目的条带,但模板浓度为10-10拷贝/uL时3次均无目的条带。（5）本研究建立的巢式PCR方法与商品化PCV3实时荧光PCR检测试剂盒同步检测78份血清样品,PCV3的阳性率分别为30.77%和33.33%,两种方法检测结果的Kappa分析系数为0.94,一致性较好。2、PCV3巢式PCR检测方法的应用应用本研究建立的PCV3巢式PCR检测方法对源自安徽15个地市528份不同临床样品进行PCV3的检测。并通过SPSS 22.0软件对不同样品来源、不同临床症状、不同生长阶段以及不同类型样品中PCV3的阳性率进行数据处理,采用卡方检验进行数据分析。结果显示:安徽15个地市528份临床样品中PCV3总阳性检出率为20.45%,其中12个地市均存在PCV3的感染现象。在临床表现为呼吸道疾病、繁殖障碍、神经症状、腹泻、高热、急性死亡、消瘦的猪群中均检出PCV3,阳性检出率在5.00%～44.44%之间,无显着性差异;不同生长阶段的猪（哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、母猪、死胎）均存在PCV3感染,阳性检出率分别为14.52%、19.35%、25.42%、29.69%、24.24%,差异不显着;PCV3在病料组织混样、血清及粪便中的检出率分别为18.72%、33.33%、12.50%,其中血清样品的阳性检出率显着高于组织混样;PCV3在猪的脑、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结中的检出率分别为21.21%、23.33%、26.67%、20.18%、31.25%、47.83%,其中PCV3在淋巴结中的检出率显着高于脾脏。综上结果表明:（1）本研究建立的PCV3巢式PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可用于临床样品的检测。（2）安徽大部分地区均存在PCV3感染;PCV3与猪呼吸道疾病、繁殖障碍、神经症状、腹泻、高热、急性死亡等疾病的发生存在一定的关联;各生长阶段的猪均可感染PCV3;血清样品中PCV3的阳性检出率高于组织混样;PCV3可分布于不同的组织器官中,淋巴结的阳性检出率最高。
温树波[6]（2018）在《广西壮族自治区PRRSV、PCV3病原学检测及IFITM抑制PRRSV复制作用的研究》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）引起的一种高度接触性传染病。PRRSV属于动脉炎病毒科,是一种单股正链RNA病毒,基因组全长为15kb左右,可编码至少10个开放阅读框。PRRSV有两种基因型,分别为基因1型和基因2型。我国目前普遍流行的高致病性PRRSV毒株大部分属于Lineage8（JXA1、HuN4等）。Lineage1,也被称作是NADC30-like株,于2013年开始在我国境内流行,并再次引起了PRRS疫情。Lineage1和Lineage8均属于基因2型。猪2型圆环病毒（Porcine Circovirus 2,PCV2）是一种单股负链DNA病毒,属于环状病毒科,是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原体。PCV2单独感染很少引起临床症状,常见与PRRSV发生混合感染。PRRSV和PCV2混合感染,与两种病毒单独感染相比能够加重疾病,产生许多种明显的临床症状。PCV3是一种新型环状病毒,其基因组也是单股负链环状DNA,最早于2015年在美国被发现,随后陆续在多个国家被报道。PCV3被认为与猪皮炎和肾病综合征相关（Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome,PDNS）,临床上多见其与PCV2发生混合感染。PRRSV与PCV2混合感染增加了PRRSV防控难度,而新发现的PCV3如果同时与两种病毒发生混合感染,无疑将使PRRSV防控工作变得更加复杂。如今新型PRRSV毒株不断出现,与包括环状病毒在内的其他病毒混合感染的情况也普遍存在。现有的PRRSV防控手段远远不能满足需求。同时,新批准上市的疫苗在使用中不断出现安全性和有效性的问题。因此,对其他PRRSV防控手段的探索具有重要意义。研究目的:本研究主要调查广西壮族自治区南宁、钦州、防城港、柳州、玉林等地区样品的PRRSV感染情况、遗传进化特点、与PCV2、PCV3的混合感染情况。并研究猪干扰素诱导跨膜蛋白（interferon induced transmembrane protein,IFITM）分子对PRRSV体外感染在转录水平上的应答反应及其对PRRSV复制的影响,为当地PRRS防控提供一定的理论基础和技术支撑。研究内容:1、检测广西壮族自治区南宁、钦州、防城港、柳州、玉林等地7个大型养猪场和3个屠宰场猪肺脏组织样品中的PRRSV感染情况,挑选4份阳性样品进行全基因序列扩增并测序,通过绘制进化树及氨基酸序列比对分析当地PRRSV的遗传进化特点,分离并检测GXBB16-1的致病性;2、建立并评价一种PCV3荧光定量检测方法。利用该方法和传统的RT-PCR检测方法分别检测上述样品中新发PCV3感染情况,并调查当地PRRSV、PCV2、PCV3混合感染情况以及PCV3的遗传进化特点;3、用本研究分离的PRRSV GXBB16-1接种原代猪肺泡巨噬细胞（Porcine Alveolar Macrophages,PAM）和猪外周血淋巴细胞（Peripheral Blood Lymph Cells,PBMC）,研究猪IFITM分子对体外PRRSV感染在转录水平上的应答情况。构建Marc145-IFITMs稳定表达细胞系,并以之为细胞模型,研究IFITM对PRRSV复制的影响。研究方法:1、本研究利用RT-PCR方法检测广西壮族自治区部分地区猪肺脏组织样品中PRRSV感染情况,并选择4份阳性样品,扩增PRRSV全基因序列。研究PRRSV的遗传进化及氨基酸变异特征,分离并鉴定PRRSV GXBB16-1。鉴定正确后将其接种PRRSV阴性仔猪,通过观察仔猪在接种病毒后的临床症状、体温及肺部病理变化来确定分离株的致病性。2、建立一种PCV3荧光定量检测方法,检测其灵敏性、特异性和重复性。利用该方法检测来自广西壮族自治区的155份猪肺脏组织样品中PCV3感染情况。选择3份样品扩增全基因序列。根据扩增得到的全基因序列绘制遗传进化树,并比对核苷酸、氨基酸序列,进而分析广西地区的PCV3基因特点。3、分离4周龄PRRSV血清学阴性仔猪的原代PAM和PBMC。用本研究分离的PRRSV GXBB16-1体外感染PAM和PBMC,分别在不同时间点收集细胞样品,提取RNA、反转录后利用qPCR检测细胞内IFITM基因转录水平变化。利用第三代慢病毒包装系统包装含有目的基因的慢病毒,用其感染Marc145细胞,然后用嘌呤霉素筛选稳定表达目的基因的细胞系。用RT-PCR和Western Blot对获得的稳定表达细胞系进行鉴定,检测外源目的基因的转录情况和蛋白表达情况。用GXBB16-1感染构建的Marc145-IFITM稳定表达细胞系,用qPCR、Western Blot和IFA检测病毒在稳定表达细胞系中的复制情况。研究结果:1、广西部分地区猪场肺脏组织样品PRRSV感染率为37.28%（63/169）。所选4份阳性样品中3株PRRSV属于PRRSV JXA1-like亚型,且与Hanvet1.vn和JXA1衍生疫苗株氨基酸同源性最高,GXBB17-1 ORF5基因与NADC30-like亲缘关系更近。分离到的GXBB16-1能够引起仔猪明显的临床症状和肺部病理损伤。2、分别用本实验建立的qPCR和传统RT-PCR检测方法检测来自广西自治区的猪肺脏组织样品中PCV3,阳性率分别为36.13%（56/155）和32.26%（50/155）。选取3份阳性样品PCR扩增获得全长序列,分别命名为PCV3-China/GX2016-1、PCV3-China/GX2016-2及PCV3-China/GX2016-3。首次在PCV3-China/GX2016-1的1155nt处发现一个“G”缺失。遗传进化分析和氨基酸序列比对发现本研究鉴定的3株PCV3均属24A+27R分支。3、GXBB16-1能够很好地感染原代PAM和PBMC,并能够显着上调两种细胞中猪IFITM分子的转录水平。成功包装了含有目的基因的慢病毒,用其感染Marc145细胞,在4.5μg/ml嘌呤霉素浓度下筛选获得稳定表达猪IFITM基因的Marc145细胞系。qPCR、western blot和IFA检测到IFITM3能够显着抑制PRRSV病毒复制,siRNA敲低IFITM3在Marc145-IFITM3稳定表达细胞系中的表达可降低这种抑制作用。结论:综上所述,本研究明确了广西部分地区PRRSV感染情况,并分析了部分毒株的遗传进化特点,发现检测到的毒株主要为PRRSV JXA1-like亚型,但是有部分抗原表位的氨基酸位点发生突变。此外GXBB16-1出现疫苗株毒力反强的现象。广西地区还存在PRRSV、PCV2和PCV3混合感染的情况,给PRRSV防控带来了一定的难度。通过对IFITM与PRRSV互相作用的研究发现,IFITM在PRRSV感染中参与机体免疫应答,且IFITM3能够在转录水平和蛋白表达水平上抑制PRRSV复制。以上研究可为广西地区PRRS防控提供一定的理论基础。
韦丽丽[7]（2016）在《广西PRRSV地方流行毒株分子流行病学调查及不同猪群中PRRSV抗体检测分析》文中指出猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）作为一种高度接触性传染病,其病毒高度的变异是猪繁殖与呼吸综合征免疫防控失败的主要制约因素。结构蛋白ORF5和非结构蛋白Nsp2基因是进行PRRSV分子流行病学研究和病毒遗传变异分析的靶基因,对研究蓝耳病毒的ORF5和Nsp2基因有着十分重要的意义。本研究对2012-2015年问送检的样品进行检测分析,通过对ORF5和Nsp2基因序列测定和分析,以及不同猪群中PRRSV抗体水平检测分析,进一步了解广西近年来PRRSV的流行趋势及变异情况,为该病的综合防控提供基础数据和理论依据。（1）本研究通过RT-PCR方法,对疑似感染PRRSV样品进行病原检查分析,共检测到91份阳性样品,阳性率为18.13%。对所获阳性样品进行PRRSV特异性片段扩增,获得18条Nsp2基因序列和48条ORF5基因序列。Nsp2基因序列分析结果显示：18个Nsp2基因与NCBI所收录的部分参考毒株相应核苷酸序列及其推导氨基酸同源性为51.9～99.1%和30.4～98.7%。所获Nsp2推导氨基酸与JXA1株的同源性最高。48个ORF5基因NCBI部分参考毒株相应核苷酸及推导氨基酸的同源性为61.8～99.7%和52.7-99.0%。以ORF5基因为主,结合Nsp2基因进行遗传进化分析,结果表明广西流行的PRRSV毒株分属于美洲型的2个亚群,主要是以JXA1为代表的Ⅳ亚群以及少数以HB-1（sh）/2002株为代表的Ⅲ亚群。氨基酸序列分些结果表明,所获得的18个Nsp2基因中有15个存在与JXA1株一样位置的30个不连续氨基酸的缺失。与VR-2332毒株相比,ORF5编码的GP5蛋白中出现大量氨基酸的突变,特别是在B细胞表位的中和抗原表位（PNE）、T细胞表位以及潜在糖基化位点。与广西过去10年NCBI所收录部分参考毒株（89株）相比,自2012年以来,氨基酸位点突变率明显提高,主要集中在氨基酸位点R151K（18/48,突变率37.5%）；E170Q（14/48,突变率29.17%）；V185A（48/48,突变率100%）；Q196R/L（33/48,突变率68.75%）。而与之相比,参考毒株89株中发生突变的氨基酸R151→K151（2/89,突变率为2.24%）；E170Q（9/89,突变率10.11%）；V185A（63/89,突变率70.78%）；Q196R/L（7/89,突变率7.86%）。推测这些位点的突变将是今后广西流行毒株突变的一个趋势。且这些突变导致的蛋白内在结构变化、糖基位点的缺失可能会影响中和抗体产生的速度与数量。结合进化树分析结果,亲缘关系与NCDA30毒株最近的三个毒株GXBS120815. GXYL130617. GXYL 130624氨基酸位点151、170、189、191、192等突变方向与NADC30株的突变方向一致,表明广西存在NADC30-like毒株流行,推测可能与NADC30株来源于同一株,且特定位点突变方向可以作为参考毒株是否与NCDA30毒株源于同一毒株的参考性指标。（2）为研究免疫压力下PRRSV免疫情况,对广西某地区2014-201 5年春秋两季在养殖场、散养户、屠宰场等采集的2228份血清进行PRRSV抗体及部分样品病原检测。依据猪群养殖规模及来源分类,本研究获得PRRSV抗体阳性样品为1698份,阳性率为76.21%,S/P值>2.5的比例占8.66%；规模种猪场及500头以上的规模养殖场,阳性率最高达92.5%,S/P值>2.5的最低比例为2.03%。散养户抗体合格率最低,阳性率为51-31-68.42%,免疫效果最差,S/P值>2.5的比例高达16.28%。研究表明某地区种猪场及中大型规模养殖场猪群比较稳定,免疫效果最好,而散养户猪群免疫效果最差且不稳定,存在野毒感染的风险。依据猪群年龄、性别、用途分类,采集2228份的血清进行PRRSV抗体,结果获得PRRSV抗体阳性样品为1648份,阳性率为73.97%,S/P值>2.5比例为8.59%。猪群公猪的免疫效果最好,阳性率83.33-94.44%,S/P值在1.38～1.44,S/P位>2.5最高比例2.32%。保育猪抗体阳性率为66.07-70.05%,S/P值>2.5比例最低为13.53%。数据分析表明种猪群处于最稳定状态,不同群体之间抗体水平参差不齐,整体猪群虽较为稳定,但野毒感染风险较大。分析不同疫苗厂家免疫PRRSV抗体情况表明,不同厂家疫苗免疫效果差异显着,2014～2015年政府采购疫苗抗体阳性率分别为71.81～82.32%,73.15～88.55%,总阳性率为79.27%。非政府采购疫苗抗体阳性率分别为79.22%～89.91%,83.11～91.60%,总阳性率为83.17%。2014～2015年弱毒疫苗抗体阳性率85.4%,87.23%,灭活苗抗体阳性率73.33%,76.68%,PRRS弱毒疫苗免疫效果要优于灭活疫苗。此外,对广西某地区送检的55份样品中,获得11条ORF5基因序列,序列同源性及遗传进化分析表明,11株均为美洲型毒株,与JXA1株同源性最高,提示某地区主要以JXA1株为代表的高致病性蓝耳病的Ⅳ亚群,及仅少数分布于HB-1（sh）/2002为代表的Ⅲ亚群在流行,与整个广西地区流行的PRRS趋势一致。
官家明[8]（2014）在《美洲型及欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是一种高度接触传染性病毒,妊娠母猪以及仔猪被感染后各自表现为繁殖障碍以及严重呼吸道疾病,给养猪业造成巨大的经济损失。当前,PRRSVI临床流行毒株既有美洲型高致病性变异毒株、经典毒株,又有欧洲型毒株,并且流行毒株基因组仍在持续变异之中,给临床诊断造成极大的困难,亟需建立快速、特异的PRRSV鉴别检测方法。1.美洲型和欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用根据GenBank中发表的PRRSV美洲型经典株VR-2332株、变异株JXAl以及欧洲型LV株的基因组序列差异,利用Primer Express3.0软件包设计合成了3条TaqMan探针和2对特异性引物。经过反应条件的优化,建立了能同时检测PRRSV美洲型变异株、经典株以及欧洲型毒株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法线性关系好,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数都达到0.999以上；敏感性高,检测下限为2.68拷贝/μL,比普通RT-PCR敏感100倍；组内及组间变异系数均小于1.5%,具有较好的重复性；特异性强,只能特异的扩增PRRSV,而与猪的其他常见病毒无交叉反应。应用所建立多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法,对282份疑似PPRS临床样品进行检测,结果显示,共检测到101份PRRSV阳性,其中95份为变异毒株、6份为经典毒株、4份为变异毒株和经典毒株混合感染,未检测到欧洲型毒株。2.PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用针对PRRSV美洲型经典株、变异株以及弱毒活疫苗TJM-F92株的基因序列差异,利用Primer Express3.0软件包设计了3条TaqMan探针和2对特异性引物,经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PRRSV美洲型变异株、TJM-F92疫苗株及经典株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,与猪的其他常见病毒无交叉反应；经典株、变异株、TJM-F92疫苗株重组质粒标准品的检出下限均为2.68拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍；组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。此外,该方法对324份疑似PPRS临床样品进行检测,结果PRRSV阳性114份,其中美洲型变异株105份、经典株6份、TJM-F92疫苗株3份,变异株和经典株混合感染4份。3.CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用本研究根据猪瘟病毒（CSFV）以及PRRSV的基因序列差异,利用Primer Express3.0软件包设计了3条特异性TaqMan探针和3对特异性引物,对反应条件进行反复优化,建立了能同时检测并区分CSFV以及PRRSV美洲型毒株、欧洲型毒株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,与猪的其他常见病毒无交叉反应；检测下限为2.68拷贝/μL;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。应用该方法对253份临床疑似样品进行检测,结果病原阳性106份,其中20份为CSFV阳性,86份为美洲型PRRSV阳性,11份为CSFV和美洲型PRRSV混合感染,未检测到欧洲型PRRSV。综上所述,本研究成功建立了3种PRRSV的鉴别检测方法,一是同时检测并区分美洲型和欧洲型PRRSV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法,二是同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法,三是同时检测并区分CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法,为PRRSV的快速鉴别检测及流行病学调查提供了有效的技术平台。
吴海鹏[9]（2013）在《美国粮食战略对我国农业产业发展影响的研究》文中提出当今世界农业面临的最大问题是粮食危机。粮食危机造成大量的营养不良和饥饿人口。笔者在探究粮食危机出现的原因时,发现了其背后隐藏的美国粮食战略。让粮食成为控制世界的武器,美国早在20世纪初就开始实施基于这一目标的全球战略布局,但是我们对其知之甚少。通过查阅美国粮食战略各个时期的相关文献资料,笔者开始慢慢揭起它的神秘面纱。美国的粮食战略一直是它在世界范围内获得政治、经济利益的重要工具。美国的国内农业为这一战略已经在农业经济、农业企业和农业支持等方面作了全面准备。依靠强大的农业实力,美国在各个不同发展时期,采取了包括农业贸易全球化、世界饮食美国化、农业企业综合化、粮食能源化等不同的方法和手段,来推进全球粮食战略的实施,成功地将自己打造成世界农产品供应者、农业技术提供者、农业价格指导者以及农业发展控制者。当笔者把视线从美国本身移到世界各个国家上时,豁然发现,原来美国粮食战略早就已经取得了一些成效。日本粮食自给率持续下降,印度绿色革命并不成功,巴西和阿根廷农业产业失控,这些现象的背后都有美国粮食战略的实施。那中国呢?中国农业的情况如何?笔者将研究聚焦到美国粮食战略对中国农业的影响上。而在研究世界各国受美国粮食战略影响时的担忧在中国也出现了：中国居民的膳食结构正在发生着改变,对农产品的需求结构受到了美国化的引导；外商直接投资也正在对中国农业产业集聚和结构变化产生着显着作用；中国农业产业发展受美国粮食战略的影响而出现了严重问题!如何应对?在居民膳食结构方面可以回归传统膳食结构,对外商直接投资可以加强监管和引导。而在中国农业产业发展方面,笔者认为走自己特色的农业发展道路是最好的选择,并为城乡间农村地区以及传统农村地区分别构想了“城市群后花园”以及发展新型小农经济两种不同发展模式。总体来看,本文对一个新的农业经济研究领域——美国粮食战略,进行了探索研究。通过历史回顾、文献研究、理论探讨、案例分析和实证检验,笔者理顺了美国粮食战略体系,认清了其发展历程、实施手段、背后意图和已有成效,警示了中国农业产业面临的多种威胁,提出了相应对策建议。
莫乃国[10]（2011）在《南宁地区养猪业福利问题的调查研究》文中研究表明近年来,随着我国加入世贸组织,本认为有望增加出口的畜禽产品却连续受到国际市场的封杀和退货,给我国畜牧业造成了巨大的经济损失。究其原因,很大程度上是由于我国畜禽产品的安全质量存在问题。畜禽饲养过程中的饲养水平低下,达不到欧盟等发达地区实行的畜禽福利标准的要求,于是这些国家就利用我国这方面的劣势,对我国的畜产品出口实行“动物福利壁垒”政策,这是继限制我国农产品出口的“绿色环境壁垒’以后出现的新动向。所谓动物福利,简单地说就是让动物在无任何疾病、无行为异常、无心理紧张压抑和痛苦的康乐状态下生存和生长发育,它涵盖生理和心理两个方面。在生理福利方面,包括良好的健康、合理的饲养和安全的畜舍环境；在心理方面,包括安乐、无紧张恐惧和枯燥压抑等。本文从畜禽福利的研究入手,通过对广西南宁地区养猪业福利状况的调研,结果表明在南宁地区养猪业中存在许多关于猪的福利问题,并分析其产生的原因。并对猪各生长和生产阶段饲养、猪圈的环境卫生、生猪屠宰等方面的福利问题提出了相应的对策和建议,以期能为提高南宁地区养猪业猪的饲养过程的福利水平,改善猪肉产品的品质提供相应的参考依据。
二、我国加入WTO对广西养猪业的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、我国加入WTO对广西养猪业的影响（论文提纲范文）
（1）PEDV感染的猪睾丸细胞miRNA-mRNA表达谱及miRNA影响PEDV复制的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 前言 |
| 1.1 猪流行性腹泻(PED)概述 |
| 1.1.1 PEDV的病原学特点及理化性质 |
| 1.1.2 PEDV基因的结构和功能 |
| 1.1.3 PED流行病学特征 |
| 1.1.4 PED流行情况 |
| 1.1.5 PED临床症状和病理变化 |
| 1.1.6 PED的致病机理 |
| 1.1.7 PED的诊断、防控和治疗 |
| 1.2 miRNA概述 |
| 1.2.1 miRNA的生物合成 |
| 1.2.2 miRNA介导的mRNA降解过程 |
| 1.2.3 miRNA对病毒复制的影响 |
| 1.3 内质网应激概述 |
| 1.3.1 内质网应激分子机制 |
| 1.3.2 内质网应激与病毒复制 |
| 1.3.3 内质网应激与miRNA |
| 1.4 细胞自噬概述 |
| 1.4.1 细胞自噬的种类 |
| 1.4.2 细胞自噬的分子机制 |
| 1.4.3 细胞自噬与病毒复制 |
| 1.4.4 细胞自噬与miRNA |
| 1.5 立题依据 |
| 第二章 PEDV变异毒株体外感染细胞模型的筛选 |
| 2.1 研究目的及意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 细胞、毒株和抗体 |
| 2.2.2 主要实验试剂及试剂盒 |
| 2.2.3 主要培养基及溶液的配制 |
| 2.2.4 主要仪器设备 |
| 2.2.5 PEDV的增殖实验 |
| 2.2.6 病毒滴度(TCID_(50))的测定 |
| 2.2.7 病毒RNA的提取 |
| 2.2.8 PEDV M基因标准质粒的构建和重组质粒无内毒素提取 |
| 2.2.9 质粒转染 |
| 2.2.10 PEDV实时绝对荧光定量RT-PCR |
| 2.2.11 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.2.12 Western Blot试验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PEDV YN15毒株在不同细胞系上的增殖 |
| 2.3.2 PEDV YN15毒株感染的IFA鉴定 |
| 2.3.3 PEDV YN15毒株N蛋白在不同细胞系表达的Western Blot验证 |
| 2.3.4 PEDV YN144毒株感染ST细胞 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PEDV变异强弱毒株感染的猪睾丸细胞miRNA-mRNA表达谱分析 |
| 3.1 研究目的及意义 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 毒株、细胞和抗体 |
| 3.2.2 主要试剂和试剂盒 |
| 3.2.3 主要仪器和设备 |
| 3.2.4 PEDV变异强弱毒株的增殖实验 |
| 3.2.5 病毒滴度(TCID_(50))的测定 |
| 3.2.6 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 3.2.7 高通量测序样品的制备和细胞总RNA的提取 |
| 3.2.8 转录组和small RNA文库构建及高通量测序 |
| 3.2.9 高通量测序数据质量评估 |
| 3.2.10 测序序列与参考序列的比对 |
| 3.2.11 已知miRNA的校对和新miRNA的预测 |
| 3.2.12 RNA的表达水平分析 |
| 3.2.13 RNA的差异表达分析 |
| 3.2.14 GO和KEGG富集分析 |
| 3.2.15 mRNA的提取及实时相对荧光定量RT-PCR |
| 3.2.16 miRNA的提取及实时相对茎环荧光定量RT-PCR |
| 3.3 结果和分析 |
| 3.3.1 PEDV变异强弱毒株在ST细胞中的复制 |
| 3.3.2 RNA样品的制备和质检 |
| 3.3.3 转录组测序及生物信息学分析 |
| 3.3.4 转录组测序结果验证 |
| 3.3.5 Small RNA测序及生物信息学分析 |
| 3.3.6 显着性差异表达miRNA的靶基因预测及富集分析 |
| 3.3.7 Small RNA测序结果验证 |
| 3.3.8 DE miRNA和靶DE mRNA联合分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 PEDV变异强弱毒株的免疫差异 |
| 3.4.2 PEDV变异强弱毒株的致病性差异 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 miR-155-5p对PEDVYN15毒株复制的影响 |
| 4.1 研究目的与意义 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞、毒株、菌株与抗体 |
| 4.2.2 载体和miRNA |
| 4.2.3 主要试剂及溶液配制 |
| 4.2.4 主要仪器设备 |
| 4.2.5 PEDV增殖实验 |
| 4.2.6 病毒滴度(TCID_(50))的测定 |
| 4.2.7 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 4.2.8 细胞活力测定(MTT) |
| 4.2.9 双荧光素酶报告基因载体构建 |
| 4.2.10 重组质粒无内毒素提取 |
| 4.2.11 miRNA和质粒转染 |
| 4.2.12 双荧光素酶报告基因系统验证靶基因 |
| 4.2.13 Western Blot试验 |
| 4.2.14 细胞总RNA的提取和相对荧光定量RT-PCR |
| 4.2.15 病毒RNA的提取和实时相对荧光定量RT-PCR |
| 4.2.16 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 YN15 毒株感染影响ST细胞miR-155-5p的表达 |
| 4.3.2 miR-155-5p对YN15毒株复制的影响 |
| 4.3.3 miR-155-5p靶向结合PEDV NSP2基因 |
| 4.3.4 miR-155-5p靶向结合ST细胞的eIF2α基因 |
| 4.3.5 miR-155-5p靶向eIF2α基因影响内质网应激、细胞自噬和免疫 |
| 4.3.6 eIF2α对PEDV复制的影响 |
| 4.3.7 eIF2α磷酸化对细胞自噬和宿主免疫的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 miR-128对PEDV YN15毒株复制的影响 |
| 5.1 研究目的与意义 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞、毒株、菌株与抗体 |
| 5.2.2 载体、miRNA及siRNA |
| 5.2.3 主要试剂及溶液配制 |
| 5.2.4 主要仪器设备 |
| 5.2.5 PEDV增殖实验 |
| 5.2.6 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 5.2.7 双荧光素酶报告基因载体和CBLB过表达质粒的构建 |
| 5.2.8 重组质粒无内毒素提取 |
| 5.2.9 miRNA、siRNA与质粒转染 |
| 5.2.10 双荧光素酶报告基因系统验证靶基因 |
| 5.2.11 Western Blot试验 |
| 5.2.12 细胞总RNA的提取和相对荧光定量RT-PCR |
| 5.2.13 病毒RNA的提取和实时相对荧光定量RT-PCR |
| 5.2.14 统计学分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 YN15毒株感染影响ST细胞中miR-128的表达 |
| 5.3.2 miR-128影响PEDV复制 |
| 5.3.3 miR-128靶向结合PEDV NSP13基因 |
| 5.3.4 miR-128影响细胞自噬和宿主免疫反应 |
| 5.3.5 miR-128靶向免疫因子CBLB影响PEDV复制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者信息 |
| 致谢 |
（2）猪流行性腹泻病毒变异毒株的分离鉴定及传代致弱研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第1章 江苏某规模化养猪公司四种腹泻病原监测及猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 样品来源 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 样品的采集 |
| 1.2.2 样品的处理 |
| 1.2.3 样品中RNA的提取 |
| 1.2.4 RT-PCR检测 |
| 1.2.5 PEDV S基因的扩增 |
| 1.2.6 PEDV S基因的克隆与鉴定 |
| 1.2.7 PEDV S基因的核苷酸序列测定与分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 2015～2018年江苏某规模化养猪公司四种腹泻病原的检测结果 |
| 1.3.2 PEDV阳性样品中S基因的RT-PCR扩增 |
| 1.3.3 PEDV流行株S基因的测序结果分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 样品检测结果及病毒流行情况 |
| 1.4.2 PEDV S基因的测序结果分析 |
| 第2章 猪流行性腹泻病毒JS2018株的分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系、试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及耗材 |
| 2.1.4 相关溶液的配制 |
| 2.1.5 分子生物学分析软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的复壮 |
| 2.2.2 病毒的分离 |
| 2.2.3 分离病毒的鉴定 |
| 2.2.4 病毒TCID_(50)测定 |
| 2.2.5 病毒增殖曲线的绘制 |
| 2.2.6 分离病毒的S基因测序 |
| 2.2.7 分离病毒的猪体回归试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒的复壮 |
| 2.3.2 病毒的分离 |
| 2.3.3 病毒的鉴定 |
| 2.3.4 病毒增殖曲线的绘制 |
| 2.3.5 分离病毒的S基因测序 |
| 2.3.6 JS2018分离株的猪体回归试验 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 猪流行性腹泻病毒JS2018株的传代致弱及免疫原性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞系、试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 相关溶液的配制 |
| 3.1.5 分子生物学分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PEDV JS2018株的连续传代及蚀斑克隆 |
| 3.2.2 病毒TCID50测定 |
| 3.2.3 病毒RNA的提取 |
| 3.2.4 病毒基因组的反转录 |
| 3.2.5 病毒荧光定量PCR方法扩增 |
| 3.2.6 PEDV S、M、N和ORF3基因的克隆 |
| 3.2.7 PEDV S、M、N和ORF3基因的克隆与鉴定 |
| 3.2.8 PEDV S、M、N和ORF3基因的核苷酸序列测定与分析 |
| 3.2.9 病理切片制作 |
| 3.2.10 病理组织切片免疫组化染色 |
| 3.2.11 PEDV中和抗体测定 |
| 3.2.12 PEDV JS2018株不同代次对3～5日龄仔猪的致病性试验 |
| 3.2.13 PEDV JS2018株不同代次的免疫原性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PEDV JS2018株的连续传代 |
| 3.3.2 PEDV JS2018株的单克隆纯化 |
| 3.3.3 病毒TCID50测定 |
| 3.3.4 PEDV JS2018株不同代次的S、M、N和ORF3基因分析 |
| 3.3.5 PEDV JS2018株不同代次对3～5日龄仔猪的致病性试验 |
| 3.3.6 PEDV JS2018株不同代次的免疫原性评价 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 PEDV JS2018株不同代次S、M、N和ORF3基因分析 |
| 3.4.2 PEDV JS2018株的传代致弱评价 |
| 3.4.3 PEDV JS2018株的免疫原性评价 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）猪δ冠状病毒（PDCoV）快速检测方法及单克隆抗体的制备研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 猪δ冠状病毒病研究进展 |
| 1.1 猪δ冠状病毒(PDCoV)概述 |
| 1.1.1 冠状病毒分类 |
| 1.1.2 PDCoV病原特征及基因结构 |
| 1.1.3 PDCoV的分离培养 |
| 1.2 临床症状 |
| 1.3 病理变化 |
| 1.3.1 眼观病理变化 |
| 1.3.2 镜检病理变化 |
| 1.4 PDCoV在不同国家的流行情况 |
| 1.4.1 PDCoV在香港及中国大陆流行情况 |
| 1.4.2 PDCoV在美国的流行情况 |
| 1.4.3 PDCoV在韩国的流行情况 |
| 1.4.4 PDCoV在泰国的流行情况 |
| 1.5 猪δ冠状病毒的诊断方法 |
| 1.5.1 RT-PCR检测方法 |
| 1.5.2 荧光定量PCR检测方法 |
| 1.5.3 血清学检测 |
| 1.5.4 免疫荧光染色、免疫组织化和原位杂交 |
| 1.6 本研究目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 鉴别PEDV、PDCoV二重TaqManMGB FQ-PCR方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品及菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 常用溶液及其配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物及探针的设计与合成 |
| 2.2.2 PEDV、PDCoV标准品的制备 |
| 2.2.3 鉴别PEDV、PDCoV二重TaqManMGB FQ-PCR方法反应条件的优化 |
| 2.2.4 标准曲线的建立及敏感性实验 |
| 2.2.5 特异性试验 |
| 2.2.6 重复性试验 |
| 2.2.7 临床应用实验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PEDV、PDCoV阳性标准品的制备 |
| 2.3.2 重组阳性质粒拷贝数的计算 |
| 2.3.3 鉴别PEDV、PDCoV二重TaqManMGB FQ-PCR方法反应体系与反应条件的优化 |
| 2.3.4 标准曲线的建立、敏感性试验和判定标准的确立 |
| 2.3.5 特异性实验 |
| 2.3.6 重复性实验 |
| 2.3.7 临床应用实验 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 第三章 PDCoV N 蛋白重组表达及基于rN 蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒与血清样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 常用溶液及其配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PDCoV N基因扩增、克隆及鉴定· |
| 3.2.2 PDCoV N基因的重组表达、纯化和活性鉴定 |
| 3.2.3 基于rN蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PDCoV N基因的PCR扩增、克隆及鉴定 |
| 3.3.2 rN基因的诱导表达、纯化和活性鉴定 |
| 3.3.3 间接ELISA方法的优化 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 第四章 PDCoV N蛋白单克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验室常用的主要试剂 |
| 4.1.2 实验室常用的主要仪器 |
| 4.1.3 细胞、实验动物、血清 |
| 4.1.4 常用溶液及其配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫抗原的制备 |
| 4.2.2 免疫小鼠 |
| 4.2.3 免疫小鼠血清效价的检测 |
| 4.2.4 杂交瘤细胞株的制备 |
| 4.2.5 单克隆抗体特异性检测 |
| 4.2.6 单克隆抗体稳定性检测 |
| 4.2.7 腹水的制备及纯化 |
| 4.2.8 腹水的效价测定 |
| 4.2.9 腹水的特异性检测 |
| 4.2.10 腹水的稳定性检测 |
| 4.2.11 腹水阻断性检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PDCoV全病毒免疫小鼠血清效价检测结果 |
| 4.3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.3.3 单克隆抗体亚型的鉴定 |
| 4.3.4 单克隆抗体特异性检测 |
| 4.3.5 单克隆抗体稳定性检测 |
| 4.3.6 腹水纯化结果 |
| 4.3.7 腹水效价检测结果 |
| 4.3.8 腹水特异性检测 |
| 4.3.9 腹水稳定性检测 |
| 4.3.10 腹水阻断性检测 |
| 4.4 讨论与分析 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）广西地区猪圆环病毒2型流行病学调查及分离株致病性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 PCV病原 |
| 1.1 PCV病毒的起源 |
| 1.2 PCV的形态特征与理化特性 |
| 1.3 PCV的分子生物学 |
| 2 PCV2 的细胞培养特性 |
| 3 PCV2 流行病学 |
| 4 PCV2 相关疾病 |
| 5 诊断 |
| 6 PCV2 疫苗研究进展 |
| 7 研究目的和意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 广西地区2017-2019年猪场中猪圆环病毒2型的流行病学调查 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 广西PCV2d流行株的分离鉴定和致病性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 云南省思茅地区猪场中蚊子PCV2 流行病学调查 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）猪圆环病毒3型巢式PCR检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略语对照表 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验毒株 |
| 1.1.2 临床样品 |
| 1.1.3 试剂盒、培养基及主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要试剂及培养基配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 样品的处理 |
| 1.2.2 病毒核酸的提取 |
| 1.2.3 PCV3巢式PCR检测方法的建立 |
| 1.2.4 PCV3巢式PCR检测方法的应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCV3巢式PCR检测方法的建立 |
| 2.1.1 重组质粒标准品的制备 |
| 2.1.2 退火温度的优化 |
| 2.1.3 稀释比例的优化 |
| 2.1.4 特异性试验 |
| 2.1.5 灵敏性试验 |
| 2.1.6 重复性试验 |
| 2.1.7 符合率检测 |
| 2.2 PCV3巢式PCR检测方法的应用 |
| 2.2.1 不同地区PCV3的检测结果 |
| 2.2.2 不同临床症状PCV3的检测结果 |
| 2.2.3 不同生长阶段PCV3的检测结果 |
| 2.2.4 不同类型样品PCV3的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PCV3巢式PCR检测方法的建立 |
| 3.2 PCV3巢式PCR检测方法的应用 |
| 3.2.1 不同地区PCV3检测结果分析 |
| 3.2.2 不同临床症状PCV3检测结果分析 |
| 3.2.3 不同生长阶段PCV3检测结果分析 |
| 3.2.4 不同类型样品PCV3检测结果分析 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）广西壮族自治区PRRSV、PCV3病原学检测及IFITM抑制PRRSV复制作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 前言 第一章 广西壮族自治区PRRSV病原学检测 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞 |
| 1.1.2 病料采集 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 相关试剂配制 |
| 1.1.6 引物设计与合成 |
| 1.1.7 分子生物学软件 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 病料的采集与处理 |
| 1.2.2 组织样品总RNA提取 |
| 1.2.3 RNA反转录 |
| 1.2.4 PCR检测 |
| 1.2.5 PRRSVPCR扩增产物回收 |
| 1.2.6 pEASY-Bluntcloning载体的构建 |
| 1.2.7 PRRSV病毒的分离鉴定 |
| 1.2.8 PRRSV致病性分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 PRRSVRT-PCR检测结果 |
| 1.3.2 PRRSV主要基因片段遗传进化分析及氨基酸序列比对 |
| 1.3.3 PRRSV分离鉴定 |
| 1.3.4 GXBB16-1致病性检测 |
| 1.3.5 GXBB16-1全基因序列分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 第二章 广西壮族自治区PCV3病原学检测 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料采集 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 相关试剂配制 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病料的采集和处理 |
| 2.2.2 组织样品中基因组DNA提取 |
| 2.2.3 PCR检测DNA样品中的PCV |
| 2.2.4 pMD18T载体的构建 |
| 2.2.5 pMD18T载体转化Trans5α感受态细胞 |
| 2.2.6 质粒PCR、酶切鉴定 |
| 2.2.7 RealtimePCR反应 |
| 2.2.8 PCV3荧光定量检测方法的建立 |
| 2.2.9 PCV3全基因序列扩增测序 |
| 2.2.10 PCV3全基因序列生物信息学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCV3荧光定量检测方法的建立 |
| 2.3.2 广西地区PCV3基因全长测序及遗传进化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 第三章 猪IFITM抗PRRSV作用研究 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 质粒 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.1.6 引物设计与合成 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)的分离 |
| 3.2.2 猪原代外周血淋巴细胞(PBMC)的分离 |
| 3.2.3 接毒 |
| 3.2.4 接种PRRSV的PAM、PBMC细胞中IFITM基因表达变化 |
| 3.2.5 猪IFITM慢病毒包装 |
| 3.2.6 Marc145嘌呤霉素敏感性实验 |
| 3.2.7 慢病毒感染构建Marc145-IFITM稳定表达细胞系 |
| 3.2.8 荧光定量PCR分析IFITM抑制PRRSV复制作用 |
| 3.2.9 间接免疫荧光分析IFITM抑制PRRSV复制作用 |
| 3.2.10 Westernblot分析IFITM抑制PRRSV复制作用 |
| 3.2.11 siRNA转染 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 荧光定量PCR引物扩增产物的特异性判断 |
| 3.3.2 感染GXBB16-1后的PAM细胞IFITM基因转录水平显着上调 |
| 3.3.3 感染GXBB16-1后的PBMC细胞IFITM基因转录水平显着上调 |
| 3.3.4 猪IFITM分子氨基酸序列比对 |
| 3.3.5 Marc145细胞对嘌呤霉素敏感性检测 |
| 3.3.6 Marc145-IFITMs细胞系构建及鉴定 |
| 3.3.7 IFITM在Marc145细胞中稳定表达对PRRSV复制的影响 |
| 3.3.8 SiRNA干扰效率检测 |
| 3.3.9 敲低IFITM3的表达对病毒复制的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 第四章 结论与展望 参考文献 作者在学期间取得的学术成果 主要简历 致谢 |
（7）广西PRRSV地方流行毒株分子流行病学调查及不同猪群中PRRSV抗体检测分析（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 缩略词表 第一章 综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征简介 |
| 1.2 PRRSV的病原学研究 |
| 1.2.1 病毒属性 |
| 1.2.2 病毒生物学特性 |
| 1.3 PRRSV基因结构 |
| 1.3.1 基因组结构 |
| 1.3.2 各基因组编码的蛋白及功能 |
| 1.4 我国PRRS流行情况 |
| 1.5 基因的多样性和变异性 |
| 1.6 PRRS抗体的概述 |
| 1.6.1 天然免疫 |
| 1.6.2 体液免疫 |
| 1.6.3 细胞免疫 |
| 1.7 PRRSV诊断方法 |
| 1.7.1 血清学诊断方法 |
| 1.7.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 1.9 技术路线 第二章 2012～2015年广西地区PRRSV分子流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂及菌株 |
| 2.1.3 常用试剂的配制 |
| 2.1.4 引物设计 |
| 2.1.5 生物学软件 |
| 2.1.6 国内外参考序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料等样品处理 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 PRRSV RT-PCR的检测 |
| 2.2.4 Nsp2基因及ORF5基因扩增、测序与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PRRSV流行毒株RT-PCR检测结果 |
| 2.3.2 PRRSV特异片段Nsp2及ORF5基因的扩增结果 |
| 2.3.3 流行毒株Nsp2基因序列分析 |
| 2.3.4 流行毒株ORF5基因序列分析 |
| 2.3.5 本研究流行毒株与广西2004～2015年部分毒株对比分析 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.4.1 广西PRRSV的流行情况 |
| 2.4.2 Nsp2基因变异分析 |
| 2.4.3 ORF5基因变异分析 第三章 猪群中PRRSV抗体检测分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要实验设备 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.1.3 猪群的选定 |
| 3.1.4 生物学软件 |
| 3.1.5 引物设计 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 血清样品及组织病料的采集 |
| 3.2.2 猪群血清PRRSV抗体检测 |
| 3.2.3 病料样品处理 |
| 3.2.4 样品病毒RNA的提取 |
| 3.2.5 PRRSV RT-PCR的检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 猪群血清PRRSV抗体检测结果分析 |
| 3.3.2 不同疫苗厂家猪群血清PRRSV抗体检测结果分析 |
| 3.3.3 血清及病料样品的RT-PCR检测 |
| 3.3.4 ORF5基因的扩增 |
| 3.3.5 ORF5基因序列分析 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 3.4.1 不同猪群中抗体水平分析 |
| 3.4.2 不同疫苗厂家所产生抗体水平分析 |
| 3.4.3 猪群中分子病原学分析 |
| 3.4.4 PRRS防控 第四章 全文结论 参考文献 致谢 攻读学位期间发表论文情况 |
（8）美洲型及欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 第一章 综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征综述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 基因组结构与功能 |
| 1.1.3 基因多样性及变异性 |
| 1.1.4 PRRSV的致病性特点 |
| 1.1.5 PRRSV检测技术及其研究进展 |
| 1.2 猪瘟概述 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 病毒基因组结构 |
| 1.2.3 CSFV检测方法 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 1.4 技术路线 第二章 同时检测美洲型、欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2.2 重组质粒标准品的构建 |
| 2.2.3 TaqMan荧光定量PCR条件最优化 |
| 2.2.4 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的制作 |
| 2.2.5 TaqMan荧光定量PCR特异性试验 |
| 2.2.6 TaqMan荧光定量PCR敏感性试验 |
| 2.2.7 TaqMan荧光定量PCR重复性试验 |
| 2.2.8 多重TaqMan荧光定量PCR的应用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组质粒标准品的制备 |
| 2.3.2 TaqMan荧光定量PCR最佳反应条件确定 |
| 2.3.3 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.3.4 TaqMan荧光定量PCR特异性分析 |
| 2.3.5 TaqMan荧光定量PCR敏感性分析 |
| 2.3.6 TaqMan荧光定量PCR重复性分析 |
| 2.3.7 多重TaqMan荧光定量PCR的应用 |
| 2.4 讨论 第三章 同时检测PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物和探针的设计 |
| 3.2.2 重组质粒标准品的构建 |
| 3.2.3 TaqMan荧光定量PCR条件最优化 |
| 3.2.4 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的制作 |
| 3.2.5 TaqMan荧光定量PCR特异性试验 |
| 3.2.6 TaqMan荧光定量PCR敏感性试验 |
| 3.2.7 TaqMan荧光定量PCR重复性试验 |
| 3.2.8 多重TaqMan荧光定量PCR的应用 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒标准品的制备 |
| 3.3.2 TaqMan荧光定量PCR最佳反应条件确定 |
| 3.3.3 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.3.4 TaqMan荧光定量PCR特异性分析 |
| 3.3.5 TaqMan荧光定量PCR敏感性分析 |
| 3.3.6 TaqMan荧光定量PCR重复性分析 |
| 3.3.7 多重TaqMan荧光定量PCR的应用 |
| 3.4 讨论 第四章 同时检测美洲型、欧洲型PRRSV以及CSFV多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病毒 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 主要实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 引物和探针的设计 |
| 4.2.2 重组质粒标准品的构建 |
| 4.2.3 TaqMan荧光定量PCR条件最优化 |
| 4.2.4 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的制作 |
| 4.2.5 TaqMan荧光定量PCR特异性试验 |
| 4.2.6 TaqMan荧光定量PCR敏感性试验 |
| 4.2.7 TaqMan荧光定量PCR重复性试验 |
| 4.2.8 多重TaqMan荧光定量PCR的应用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组质粒标准品的制备 |
| 4.3.2 TaqMan荧光定量PCR最佳反应条件确定 |
| 4.3.3 TaqMan荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 4.3.4 TaqMan荧光定量PCR特异性分析 |
| 4.3.5 TaqMan荧光定量PCR敏感性分析 |
| 4.3.6 TaqMan荧光定量PCR重复性分析 |
| 4.3.7 多重TaqMan荧光定量PCR的应用 |
| 4.4 讨论 第五章 结论 参考文献 致谢 攻读硕士学位期间发表的论文及专利情况 |
（9）美国粮食战略对我国农业产业发展影响的研究（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| Abstract |
| 第1章 导论 |
| 1.1 研究背景和意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究的意义 |
| 1.2 研究思路、内容安排与分析方法 |
| 1.2.1 研究思路 |
| 1.2.2 技术路线 |
| 1.2.3 主要内容 |
| 1.2.4 分析方法 |
| 1.3 研究的创新与不足之处 |
| 1.3.1 研究的创新之处 |
| 1.3.2 研究的难点和不足 |
| 1.4 相关概念的界定与说明 |
| 注释 |
| 第2章 国内外相关文献综述 |
| 2.1 相关理论 |
| 2.1.1 价格传导理论 |
| 2.1.2 垄断优势理论 |
| 2.1.3 农业产业化理论 |
| 2.1.4 其他相关理论 |
| 2.2 国内外相关研究 |
| 2.2.1 世界粮食危机的国内外相关研究 |
| 2.2.2 美国粮食战略的国内外相关研究 |
| 2.2.3 农业融资困难的国内外相关研究 |
| 2.2.4 有关农业投资中外来资本——外商直接投资(FDI)的研究 |
| 2.2.5 工商业资本投资农业的相关研究 |
| 2.2.6 农业利用外来资本的环境、投向及方式相关研究 |
| 2.2.7 农业产业化与外来资本的相关研究 |
| 2.3 国内外研究现状评述 |
| 2.3.1 理论研究上的局限性 |
| 2.3.2 研究视角上的局限性 |
| 2.3.3 研究内容上的局限性 |
| 2.3.4 研究对象上的局限性 |
| 注释 |
| 第3章 当前世界农业面临的主要问题——粮食危机 |
| 3.1 对最近两次粮食危机的回顾 |
| 3.1.1 1970s的世界粮食危机 |
| 3.1.2 2008年的世界粮食危机 |
| 3.1.3 两次世界粮食危机的共同点 |
| 3.2 已有的全球粮食危机原因分析 |
| 3.2.1 已有的几种原因分析 |
| 3.2.2 对已有原因分析的小结 |
| 3.3 全球粮食危机发生的根源 |
| 3.3.1 危机之后进入粮食高价时代 |
| 3.3.2 危机的受益者并非发展中国家农业生产者 |
| 3.3.3 危机的产生缘于粮食属性多样化 |
| 3.3.4 危机的根源——美国全球粮食战略 |
| 3.4 本章小结 |
| 注释 |
| 第4章 美国的全球粮食战略 |
| 4.1 美国全球粮食战略的发展历程 |
| 4.1.1 马歇尔计划时期(1910s-1954年) |
| 4.1.2 PL480法案时期(1954年-1970s) |
| 4.1.3 世界银行结构调整计划时期(1970s-1980s) |
| 4.1.4 世界贸易组织时期(1980s至今) |
| 4.1.5 对美国全球粮食战略的小结 |
| 4.2 美国全球粮食战略的驱动因素 |
| 4.2.1 美国先进农业经济是基础 |
| 4.2.2 美国农业综合企业是推手 |
| 4.2.3 美国农业支持政策是保障 |
| 4.3 美国全球粮食战略的实施途径 |
| 4.3.1 推动农贸“全球化” |
| 4.3.2 推广膳食“美国化” |
| 4.3.3 推进农企“综合化” |
| 4.3.4 推行粮食“能源化” |
| 4.4 本章小结 |
| 注释 |
| 第5章 美国粮食战略实施对他国农业的影响分析 |
| 5.1 美国粮食战略对日本农业的影响 |
| 5.1.1 农业小国化的日本 |
| 5.1.2 日本农业面临的主要问题 |
| 5.1.3 日本农业对于美国粮食战略的重要性 |
| 5.1.4 美国粮食战略影响日本农业的主要方式 |
| 5.1.5 日本如何应对美国粮食战略 |
| 5.2 绿色革命对印度农业的影响 |
| 5.2.1 绿色革命的概念 |
| 5.2.2 已经爆发两次的绿色革命 |
| 5.2.3 绿色革命对印度农业的影响 |
| 5.2.4 美国粮食战略推动下的绿色革命 |
| 5.2.5 对绿色革命的简要评述 |
| 5.3 美国粮食战略下的巴西、阿根廷农业 |
| 5.3.1 巴西农业 |
| 5.3.2 阿根廷农业 |
| 5.3.3 美国、巴西、阿根廷三国的世界农业地位 |
| 5.3.4 美国粮食战略对两国农业的控制途径 |
| 5.4 本章小结 |
| 注释 |
| 第6章 美国粮食战略对中国居民膳食结构的影响分析 |
| 6.1 中国膳食结构的改变 |
| 6.1.1 中国居民传统膳食结构 |
| 6.1.2 中国居民膳食结构变化趋势 |
| 6.1.3 中国居民膳食结构变化的重要特点——美式快餐化 |
| 6.2 中国膳食结构改变的一个重要原因——美国粮食战略 |
| 6.2.1 影响中国居民膳食结构变化的各种因素 |
| 6.2.2 美国粮食战略是影响中国居民膳食结构改变的重要原因 |
| 6.2.3 美国粮食战略在其他国家居民膳食的影响 |
| 6.3 美国粮食战略改变中国居民膳食结构的途径 |
| 6.3.1 将美式餐饮概念引入中国 |
| 6.3.2 农业技术推广 |
| 6.3.3 利用全球化联结中国内外粮食价格 |
| 6.4 中国居民膳食结构改变带来的问题 |
| 6.4.1 膳食结构改变带来的健康问题 |
| 6.4.2 膳食结构改变带来的经济问题 |
| 6.4.3 膳食结构改变带来的文化问题 |
| 6.5 应对美国粮食战略带来的膳食结构改变 |
| 6.5.1 第一阶段：建立本地食物系统 |
| 6.5.2 第二阶段：回归传统膳食结构 |
| 6.6 本章小结 |
| 注释 |
| 第7章 美国粮食战略视角下关于中国农业FDI的影响研究 |
| 7.1 中国农业利用FDI的发展历程 |
| 7.1.1 起步阶段(1980s-1990s初) |
| 7.1.2 稳步发展阶段(1990s-2000s初) |
| 7.1.3 快速发展阶段(2000s至今) |
| 7.2 我国农业利用FDI的现状与特征 |
| 7.2.1 我国农业利用FDI的来源分析 |
| 7.2.2 我国农业利用FDI的区域分析 |
| 7.2.3 我国农业利用FDI的主要特征 |
| 7.3 FDI对我国农业产业发展的作用机制 |
| 7.3.1 资本积累效应 |
| 7.3.2 技术转移效应 |
| 7.3.3 产业结构效应 |
| 7.3.4 贸易效应 |
| 7.3.5 就业效应 |
| 7.3.6 制度变迁效应 |
| 7.4 FDI影响我国农业产业的实证分析 |
| 7.4.1 我国主要农业产业区位商和集中系数的测算 |
| 7.4.2 农业产业集聚与地区间FDI的实证分析 |
| 7.4.3 FDI与农业产业结构改变的实证分析 |
| 7.5 美国粮食战略视角下我国农业利用FDI存在的问题 |
| 7.5.1 我国农业利用FDI缺乏绝对优势 |
| 7.5.2 我国农业利用FDI缺乏区位优势 |
| 7.6 政策建议和相关措施 |
| 7.6.1 合理引导外商对农业的投资流向 |
| 7.6.2 提升农业自身的竞争优势 |
| 7.6.3 完善法律和政策制度 |
| 7.6.4 健全市场和价格体系 |
| 7.6.5 关注农业潜在生态问题 |
| 7.7 本章小结 |
| 注释 |
| 第8章 应对美国粮食战略须走中国特色农业道路 |
| 8.1 中国目前农业“美国式产业化”存在的问题 |
| 8.1.1 去农民化的问题 |
| 8.1.2 生产成本的问题 |
| 8.1.3 中国农业产业应多样化发展 |
| 8.2 “城市群后花园”农业发展模式——以长三角地区为例 |
| 8.2.1 “城市群后花园”模式基于现实问题 |
| 8.2.2 “城市群后花园”构想的提出 |
| 8.2.3 “城市群后花园”构想的实现路径 |
| 8.2.4 实现“城市群后花园”构想的意义 |
| 8.3 农业地区发展新型小农经济 |
| 8.3.1 新型小农经济是解决世界粮食危机的关键 |
| 8.3.2 新型小农经济在其他国家的发展经验 |
| 8.3.3 中国的小农经济 |
| 8.3.4 新型小农经济持续发展离不开支持 |
| 8.4 本章小结 |
| 注释 |
| 第9章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）南宁地区养猪业福利问题的调查研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1. 畜禽福利概述 |
| 1.1 动物福利的来由与演化 |
| 1.2 畜禽福利的概念及其含义 |
| 1.3 国内外动物福利的发展现状 |
| 1.4 动物福利的相关法规 |
| 1.5 研究畜禽福利的意义 |
| 1.6 动物福利提出的必然性与紧迫性 |
| 2. 猪的福利概述 |
| 2.1 猪只的基本福利 |
| 2.2 生产管理措施对猪的福利的影响 |
| 2.3 猪的屠宰福利问题 |
| 第一章 南宁地区养猪业猪的福利中存在问题及原因分析 |
| 1. 南宁地区猪的饲养环境福利问题 |
| 1.1 猪只饲养密度过高 |
| 1.2 猪舍环境过于单调 |
| 1.3 猪舍地板设计不合理 |
| 1.4 猪舍小气候环境稳定性差 |
| 1.5 饲养环境问题降低了猪肉质量和安全 |
| 1.6 其他福利问题 |
| 2. 猪各生长与生产阶段的福利问题 |
| 2.1 仔猪的福利问题 |
| 2.2 生产育肥猪的福利问题 |
| 2.3 繁殖母猪的福利问题 |
| 2.4 公猪的福利问题 |
| 3. 猪的运输和屠宰福利问题 |
| 3.1 猪的运输福利问题 |
| 3.2 屠宰前福利问题 |
| 第二章 南宁地区养猪业猪的福利发展的对策思考 |
| 1. 加强猪的环境福利 |
| 1.1 饲养环境的福利 |
| 1.2 制定合理的饲养密度 |
| 1.3 利用先进设备,增强环境调控能力 |
| 1.4 设置福利性设施,增加环境富集度 |
| 1.5 改善地板状况,提高地板舒适度 |
| 1.6 改进养殖工艺,改进栏舍设计 |
| 1.7 落实各项生物安全措施 |
| 1.8 加强疫病监测防控 |
| 1.9 加强饲养管理 |
| 2. 加强对猪各生长与生产阶段的饲养管理 |
| 2.1 仔猪 |
| 2.2 育肥猪 |
| 2.3 母猪 |
| 2.4 公猪 |
| 3. 保证生猪在运输和屠宰时的福利 |
| 3.1 生猪在运输时的福利 |
| 3.2 生猪在屠宰前的福利 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、我国加入WTO对广西养猪业的影响（论文参考文献）
- [1]PEDV感染的猪睾丸细胞miRNA-mRNA表达谱及miRNA影响PEDV复制的机制研究[D]. 张晓茜. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]猪流行性腹泻病毒变异毒株的分离鉴定及传代致弱研究[D]. 丁小燕. 扬州大学, 2021(02)
- [3]猪δ冠状病毒（PDCoV）快速检测方法及单克隆抗体的制备研究[D]. 雷从从. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]广西地区猪圆环病毒2型流行病学调查及分离株致病性研究[D]. 李金凤. 吉林大学, 2020(08)
- [5]猪圆环病毒3型巢式PCR检测方法的建立及应用[D]. 张静. 安徽农业大学, 2019(05)
- [6]广西壮族自治区PRRSV、PCV3病原学检测及IFITM抑制PRRSV复制作用的研究[D]. 温树波. 军事科学院, 2018(12)
- [7]广西PRRSV地方流行毒株分子流行病学调查及不同猪群中PRRSV抗体检测分析[D]. 韦丽丽. 广西大学, 2016(02)
- [8]美洲型及欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用[D]. 官家明. 广西大学, 2014(02)
- [9]美国粮食战略对我国农业产业发展影响的研究[D]. 吴海鹏. 复旦大学, 2013(03)
- [10]南宁地区养猪业福利问题的调查研究[D]. 莫乃国. 广西大学, 2011(06)