导读:本文包含了溶细胞毒素论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:中华仙影海葵,溶细胞活性,活性组分,稳定性
溶细胞毒素论文文献综述
史文军,张朝晖,秦松,吴建平[1]（2013）在《中华仙影海葵溶细胞毒素的初步分离及稳定性研究》一文中研究指出目的初步分离中华仙影海葵溶细胞毒素(Cereus sinensis Verrill cytolytic toxins,CCT)并探讨其体外溶细胞活性及影响因素。方法采用冻融、匀浆、水浸和离心的方法获取海葵粗毒,通过硫酸铵盐析和Sephadex G-100凝胶色谱法将海葵粗毒60%~90%盐析段分为5个组分,检测5个组分溶细胞活性并收集活性较强的第1组分(CCT);测定其半数溶细胞分数(CU50)、最适孵育温度及最适pH,探讨EDTA和金属离子对溶细胞活性的影响。结果经硫酸铵盐析和分子筛处理后,中华仙影海葵溶细胞活性成分主要集中在第1组分(CCT),CCT溶细胞活性的CU50为7.76μg·mL-1、最适孵育温度为40℃、最适pH为8;体外实验表明EDTA和金属离子对CCT溶细胞活性有较大影响。结论通过硫酸铵盐析和凝胶色谱,初步分离得到中华仙影海葵溶细胞活性组分,并测得其主要性质参数,为后续纯化单一溶细胞活性成分打下基础。(本文来源于《中国海洋药物》期刊2013年05期）
郑晶,王明华[2]（2012）在《正交试验设计优化重组蛋白溶细胞毒素的表达》一文中研究指出目的:对创伤弧菌溶细胞毒素融合蛋白表达条件进行优化,从而获得高效稳定的溶细胞毒素(Vibrio vulnificus Hemolysin,VVH)原核表达系统。方法:质粒pGEX-4T-1-vvh转化E.coli BL21/DE3后,针对诱导过程中对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素:诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用统计学软件进行正交实验设计,对结果进行直观分析及方差分析。并对实验得出的最佳搭配诱导条件进行验证。结果:直观分析表明诱导时间的R值最大,其次为摇菌转速和诱导剂IPTG浓度,诱导温度的R值最小;方差分析表明诱导时间的P<0.05,而转速、温度及IPTG浓度的P均>0.05。结论:诱导时间为主要因素(其为4h,表达水平最高),其次为摇菌转速、诱导剂IPTG浓度和诱导温度。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数为250r/min、诱导时间4h、诱导温度30℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。在此诱导条件下,溶细胞毒素的表达量达到了55.31%。(本文来源于《海南医学院学报》期刊2012年06期）
孙佳春[3]（2011）在《创伤弧菌溶细胞毒素对人肺腺癌细胞株A549杀伤作用及初步机制的研究》一文中研究指出研究背景和目的创伤弧菌溶细胞毒素(vibrio vulnificus cytolysin,VVC)是由创伤弧菌结构基因vvhA编码的一种相对分子量(Mr)为50581的细胞外蛋白质。其作为创伤弧菌向胞外释放的唯一细胞毒素,由大多数致病菌株产生,具有水溶性,对热不稳定。近年来,创伤弧菌溶细胞毒素作为创伤弧菌致病中的关键性因子,越来越引起研究者的关注。在以往的研究中,本课题组利用基因工程技术成功构建了表达载体pET32a-(+)-vvhA,并对其表达、纯化和复性条件进行了优化,从而得到了获得了较高纯度和浓度的创伤弧菌溶细胞毒素。为创伤弧菌溶细胞毒素生物学活性的深入研究奠定基础,并发现创伤弧菌溶细胞毒素可独立发挥作用对机体肺组织造成损伤；在研究创伤弧菌致病机制过程中本课题组还发现创伤弧菌溶细胞毒素能够以诱导凋亡的方式杀伤人脐静脉内皮细胞株HU细胞。另据文献报道创伤弧菌溶细胞毒素对多种哺乳动物细胞有着极强的杀伤作用,其杀伤作用的方式包括引发细胞发生渗透性溶解和诱导细胞发生凋亡。那么其对肿瘤细胞是否具有杀伤作用?杀伤方式又如何?目前尚未见相关文献报道。基于创伤弧菌溶细胞毒素对多种哺乳动物细胞的杀伤作用及本课题组的前期研究基础,我们进行了本项研究,旨在探讨创伤弧菌溶细胞毒素对人肺腺癌细胞株A549的杀伤作用及初步的分子机制。本研究首先利用本课题组前期构建的表达载体pET32a-(+)-vvhA,在最佳诱导条件下获得足量、高纯度的创伤弧菌溶细胞毒素,在此基础上探讨创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549生物学特性的影响,并重点探讨了创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞的杀伤作用,确定了创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞杀伤作用的剂量范围、时间范围、作用方式以及关键因素,初步阐明了创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞杀伤作用的分子机制,为进一步揭示创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞杀伤作用机制奠定了基础。方法1.创伤弧菌溶细胞毒素的表达、纯化和鉴定重组大肠杆菌pET-32a-whA/E.coliBL21(DE3)'恢复培养,小量表达；挑取转化重组的单菌落进行PCR扩增并琼脂糖电泳验证目的基因存在。挑选单菌落并以最佳诱导条件进行诱导培养,离心收集细菌,超声破菌,离心后上清液经过His-Bind亲和层析方法纯化重组创伤弧菌溶细胞毒素(rVVC)并行SDS-PAGE电泳及Western-blot验证。纯化后的蛋白以透析法进行复性和浓缩。采用BCA (bicinchoninic acid)法进行蛋白定量,绘制标准曲线,计算出蛋白浓度。2.创伤弧菌溶细胞毒素对人肺腺癌细胞株A549以及人永生化支气管上皮细胞株HBE的灭杀作用2.1创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外增殖能力的影响和灭杀作用；(1)利用MTT法检测创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外增殖能力的影响；(2)台盼蓝染色检测伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外灭杀作用；(3)平板克隆形成实验检测伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外克隆形成能力的影响；(4)利用细胞爬片,常规HE染色观察创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株形态结构的影响；利用透射电镜观察创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株超微结构的影响；(5)利用生物体视学的原理和方法对经创伤弧菌溶细胞毒素处理前后的A549细胞的面积、周长、长轴、短轴,细胞核的面积、周长、长轴和短轴进行测量,并计算细胞及细胞核的形状因子PE、AR、RFF、FII以及细胞的胞浆面积、核浆比；为研究创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞重要细胞器(线粒体)的超微形态结构的影响,对经创伤弧菌溶细胞毒素处理前后的A549细胞的线粒体超微形态结构进行了体视学研究,透射电镜下(6200倍)测量处理前后A549细胞线粒体的面积、周长、长轴、短轴,计算线粒体的体积密度、表面积密度、数密度、平均体积和平均表面积。2.2创伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外增殖能力的影响和灭杀作用；(1)利用MTT法检测创伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外增殖能力的影响；(2)台盼蓝染色检测伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外灭杀作用；(3)平板克隆形成实验检测伤弧茵溶细胞毒素对HBE细胞株体外克隆形成能力的影响；3.创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株杀伤作用的机制利用二硝基苯肼比色法检测创伤弧菌溶细胞毒素作用不同时间后A549细胞培基中乳酸脱氢酶活性的变化；利用Hochest333258荧光染色及透射电镜观察A549细胞凋亡变化；流式细胞仪检测不同浓度创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株凋亡率的影响：琼脂糖凝胶电泳观察A549细胞凋亡DNA Ladder的产生；利用Westen Blot检测创伤弧菌溶细胞毒素对A549 Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。结果1.创伤弧菌溶细胞毒素的表达、纯化、鉴定创伤弧菌溶细胞毒素小量表达成功,在凝胶上70KD的位置可见相应的蛋白条带(创伤弧菌溶细胞毒素分子量约为50KD,载体蛋白约为20KD)；挑取单菌落培养,进行质粒提取,并以其为模板进行PCR扩增whA基因,琼脂糖电泳获得相应大小目的条带(whA:1356bp)。SDS-PAGE电泳显示阳性克隆重组大肠杆菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21 (DE3)经IPTG诱导培养,能表达融合蛋白rVVC,在凝胶上70KD的位置可见相应蛋白条带。rVVC经透析复性、浓缩后,BCA法测定蛋白浓度为1.163mg/ml。Western-blot免疫印迹实验结果表明表达产物rVVC能与抗6×His组氨酸单克隆抗体特异结合。2.创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549以及人永生化支气管上皮细胞株HBE的灭杀作用2.1创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外增殖能力的影响和灭杀作用(1)MTT法检测创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外增殖能力的影响MTT法对不同浓度创伤弧菌溶细胞毒素处理过的A549细胞生长曲线以及吸光率的测定,5μg/ml组、10μg/ml组、15μg/ml组、20μg/ml组、25μg/ml、30μg/ ml组细胞24h增殖抑制率分别为：(30.96±2.94)%,(36.53±4.49)%,(45.97±4.21)%,(57.67±4.91)%,(61.72±5.75)%,(71.06±8.05)%；48h增殖抑制率分别为：(36.76±2.93)%,(40.59±5.12)%,(60.857.32)%,(66.32±6.46)%,(72.95±8.49)%,(79.65±8.28)%；72h增殖抑制率分别为：(39.14±3.89)%,(43.04±4.77)%,(61.01±5.52)%,(68.06±5.65)%,(75.68±8.16)%,(82.55±8.25)%。析因分析结果表明：不同浓度的rVVC对细胞增殖的影响差异有统计学意义(F=67.142, P=0.000); rVVC处理不同的时间对A549细胞增殖的影响差异也有统计学意义(F=16.203,P=0.000)；不同时间及不同浓度组间不存在交互效应(F=0.356,P=0.957)；说明：rVVC抑制A549细胞的增殖与作用时间和作用浓度有关。(2)台盼蓝染色检测伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外灭杀作用台盼蓝拒染法检测不同浓度创伤弧菌溶细胞毒素处理后的7组A549细胞的即刻、24 h和48 h灭杀率,即刻灭杀率分别为0.00%、1.44%、2.91%、2.57%、3.35%、5.59%、5.73%,不同处理组的即刻灭杀率差异有统计学意义(F=7.023,P=0.003)；24 h细胞灭杀率分别为0.01%、21.74%、31.26%、41.31%、43.44%、51.67%、62.98%不同处理组的24h灭杀率差异有统计学意义(F=33.525,=0.000)；48 h灭杀率分别为0.08%、31.05%、50.99%、56.90%、64.99%、55.77%、56.89%不同处理组的48h灭杀率差异有统计学意义(F=25.136P=0.000)。(3)平板克隆形成实验检测伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外克隆形成能力的影响平板克隆形成实验中对照组克隆形成率为68.40%,实验组为44.20%,比Control组下降35.38%,两组细胞克隆形成率差异具有统计学意义(x2=178.526,p=0.000)。(4)创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株形态结构及超微结构的影响HE染色倒置显微镜观察空白对照组细胞,生长状态良好,胞浆丰富淡染,胞核近似于圆形或卵圆形,核仁清晰；而实验组A549细胞形态发生明显改变：细胞生长稀疏,胞浆稀少深染,细胞核变得细长,部分细胞胞核固缩；电镜观察空白对照组细胞：体积较大,形态近似于圆形或椭圆形,胞浆丰富,可见线粒体等细胞器,并可见明显的核分裂,而实验组A549细胞表面微绒毛变少,胞质深,核染色质凝聚,有的细胞,大部分核染色质凝聚呈一个或数个块状,占据核中部；有的细胞核染色质完全凝聚、占满整个核区,有的细胞和染色质凝集,形成明显的凋亡小体；部分细胞肿胀坏死,胞浆溶解,仅见胞核。(5)创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株形态结构及超微结构影响的体视学研究空白组和10μg/ml创伤弧菌溶细胞毒素(VVC)攻击组A549细胞的参数值分别为：空白对照组：细胞核的面积(μm2),为(157.807±45.611)；细胞核周长(μm),为(55.381±10.833)；细胞面积(μm2),为(363.209±119.538)；细胞周长(μm),为(104.317±21.988)；胞浆面积(μm2),为(204.873±108.116)；核浆比为(1.0476±0.7029)。10μg/ml创伤弧菌溶细胞毒素(VVC)攻击组细胞核的面积(μm2),为(102.390±31.962)；细胞核周长(μm)为(49.764±9.003)；细胞面积(μm2)为(219.910±70.00)；为细胞周长(μm),为(89.622±22.025)；胞浆面积(μm2),为(117.528±50.988)；核浆比为(1.5103±4.6697)。空白组和10μg/ml创伤弧菌溶细胞毒素(VVC)攻击组细胞透射电镜6200倍观察线粒体的参数值分别为：空白对照组：体积密度为(0.1635±0.0762)、表面积密度(μm2/3)为(0.1334±0.0526)、平均体积(μm3)为(2.8332±1.2543)、数密度(μm-3)为(0.0599±0.0216)、平均表面积(μm3)为(2.2755±0.6560)10μg/ml创伤弧菌溶细胞毒素(VVC)攻击组：体积密度为(0.1010±0.1837)、表面积密度(μm2/3)为(0.8941±1.4719)、平均体积(μm3)为(1.0498±2.4099)、数密度(μm-3)为(0.3949±0.3338)、平均表面积(μm3)为(6.1017±19.9348)。2.2创伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外增殖能力的影响和灭杀作用(1)MTT法检测创伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外增殖能力的影响MTT法对不同浓度创伤弧菌溶细胞毒素处理过的HBE细胞生长曲线以及吸光率的测定,0.625μg/ml组、1.25μg/ml组、2.5μg/ml组、5μg/ml、10μg/ml组细胞24h增殖抑制率分别为：(14.80±2.55)%,(23.65±1.27)%,(26.38±2.12)%,(40.99±3.19)%,(48.90±7.77)%；48h增殖抑制率分别为：(24.66±1.46)%,(42.05±6.66)%,(45.45±8.80)%,(59.87±5.08)%,(70.84±10.72)%：72h增殖抑制率分别为：(34.14±3.84)%,(49.30±8.39)%,(55.18±3.99)%,(72.08±6.22)%；(77.77±7.04)%。析因分析结果表明,不同浓度的rVVC对细胞增殖的影响差异有统计学意义(F=58.810, P=0.000); rVVC处理不同的时间对HBE细胞增殖的影响差异也有统计学意义(F=68.299,P=0.000)；不同时间及不同浓度组间不存在交互效应(F=0.570,P=0.794)。研究结果说明rVVC以时间和剂量依赖的方式抑制HBE细胞增殖。(2)台盼蓝染色实验检测伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外灭杀作用台盼蓝拒染法检测不同浓度创伤弧菌溶细胞毒素处理后的6组HBE细胞的即刻灭杀率、24h和48h灭杀率,即刻灭杀率分别为0.00%、1.30%、1.64%、2.16%、2.61%、4.86%,不同处理组的即刻灭杀率差异有统计学意义(F=14.932,P=0.003)；24h细胞灭杀率分别为0.00%、12.39%、19.42%、27.69%、40.85%、52.65%,不同处理组的24h灭杀率差异有统计学意义(F=98.395,P=0.000)；48h灭杀率分别为0.1%、22.03%、47.96%、55.31%、63.52%、77.48%,不同处理组的48h灭杀率差异有统计学意义(F=52.615,P=0.000)。(3)平板克隆形成实验检测检测伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外克隆形成能力的影响平板克隆形成实验中对照组克隆形成率为47.40%,实验组为29.10%,比Control组下降38.60%,两组细胞克隆形成率差异具有统计学意义(x2=106.745,p=0.000)；3.创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株杀伤作用的机制二硝基苯肼比色法检测10μg/ml rVVC处理不同时间的A549细胞培基中乳酸脱氢酶活性无明显变化,各组见乳酸脱氢酶活性分别为：Oh组：155.60±5.35U/L；0.5h组151.6-3.52 U/L；2h组156.68±7.70 U/L；4h组159.51±4.23 U/L；8h组157.83±2.23 U/L。Hoechest 333258荧光染色观察A549细胞核,空白对照组A549细胞胞核呈均匀的蓝色荧光,加入10μg/ml rVVC 24h后,出现凋亡细胞,凋亡细胞呈圆形或椭圆形的高亮蓝色荧光,可见明显的染色质凝集；透射电镜观察发现10μg/ml rVVC处理24h后,细胞呈现明显的凋亡形态改变如异染色质增多、染色质边集、凋亡小体形成等；流式细胞仪测定不同浓度rVVC对A549细胞凋亡的影响,随着创伤弧菌溶细胞毒素浓度的增加细胞凋亡率逐渐上升；琼脂糖凝胶电泳图中可见典型的DNA-Ladder条带形成；Western blot分析表明Bcl-2蛋白表达水平轻微下降,而Bax蛋白表达去明显上升,从而导致二者比率明显下降。结论1.创伤弧菌溶细胞毒素具有灭杀人肺腺癌细胞株A549和人永生化支气管上皮细胞株HBE的作用,其灭杀效果与作用时间和作用浓度有关；对A549细胞24小时半数致死剂量IC50为8.540μg/ml,并且用接近ICs0的创伤弧菌溶细胞毒素作用A549细胞,12小时即可产生杀伤作用,在48小时内随着作用时间的延长杀伤作用逐渐增强,48小时达到杀伤峰值,可维持至120小时左右。创伤弧菌溶细胞毒素可以影响人肺腺癌细胞株A549的形态结构；创伤弧菌溶细胞毒素可以损伤人肺腺癌细胞株A549线粒体的超微结构,使A549细胞株的能量代谢的结构基础受到损伤；2.创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株的杀伤作用主要是诱导细胞发生凋亡,其机制与A549细胞的线粒体损伤,细胞能量代谢的结构基础受到损伤有关,与Bcl-2蛋白表达增加和Bax蛋白表达下降有关。本研究的创新之处1.首次证明了创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549具有明显的杀伤作用。2.首次利用生物体视学的原理和方法对创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549形态结构及超微结构的损伤进行了分析,从定量角度及超微结构水平揭示了创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549杀伤作用的机制。3.首次证实创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549的杀伤作用主要是损伤线粒体并诱导细胞凋亡来实现的,其机制与损伤A549细胞的线粒体,使细胞的能量代谢的结构基础受到影响,并促使Bcl-2蛋白表达增加和Bax蛋白表达减少。(本文来源于《南方医科大学》期刊2011-05-01）
欧刚卫[4]（2009）在《霍乱弧菌蛋白酶PrtV对霍乱弧菌溶细胞毒素引起人肠上皮细胞炎性反应的修饰》一文中研究指出目的研究霍乱弧菌分泌的蛋白酶PrtV(Vibrio cholerae protease,PrtV)对霍乱弧菌溶细胞毒素(Vibrio cholera cytolysin,VCC)引起人肠上皮细胞炎性反应的修饰作用。方法用VCC或PrtV处理后的VCC刺激人单层肠上皮T84细胞体外模型上层腔面,分析细胞受刺激后通透性和细胞活性改变以及细胞因子白细胞介素-8(interlukine-8,IL-8)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因表达。结果VCC可引起极性的肠道T84细胞的炎性反应,表现为通透性增加和IL-8以及TNF-α基因表达增加。纯VCC蛋白在浓度为160ng/ml时引起肠上皮细胞炎性反应,而高浓度的VCC则导致肠上皮细胞损伤。VCC经PrtV处理后对肠上皮细胞炎性作用明显消失。结论结果表明VCC在低浓度时引起肠道上皮的局部免疫防御反应,而高浓度的VCC则直接导致肠道上皮细胞损伤。此外,PrtV可以介导由VCC引起的肠上皮细胞炎性反应的修饰作用。(本文来源于《遵义医学院学报》期刊2009年02期）
王贵明[5]（2009）在《创伤弧菌消杀抗性及其菌体抗原、溶细胞毒素蛋白抗原主动免疫的动物实验研究》一文中研究指出研究背景和目的创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是弧菌属第5群细菌,根据其生化特性、流行病学模式以及宿主范围将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个亚型,其中Ⅰ型Vv是导致人群创伤感染及原发性败血症的病原体。原发性创伤弧菌感染发病率呈逐年递增的趋势。目前世界上大部分沿海国家都有创伤弧菌感染的病例报告。我国国内1990年报道首例,随后沿海各地区每年都有散发病例报道,其病死率一直居高不下。对本病的认识不足,发病早期未能正确诊断,或误诊为药物超敏反应而使用大剂量激素,是造成高病死率的主要原因。创伤弧菌的感染途径有二:一是经口感染,二是通过皮肤伤口侵入。创伤弧菌感染一旦出现败血症,其死亡率高达50%以上。那么,我们能否采取措施避免接触到创伤弧菌呢?在不可避免接触到创伤弧菌的情况下,我们能否通过机体主动免疫的方法避免其感染乃至致病呢?为此,我们设计了本课题,试图通过体外及主动免疫动物实验来回答上述问题。方法1.创伤弧菌的生化特性及抗性研究:1.1取新鲜培养的创伤弧菌接种于弧菌属生化鉴定管及生化条培养24h后,目测或上机读取鉴定结果。1.2紫外线抗性:创伤弧菌ATCC27562、大肠杆菌ATCC25922悬液及平板在强度值达90μW/cm~2的紫外线照射不同时间后,培养并定量测试照射前后的活菌浓度,统计杀菌率,绘制照射前后灭活曲线(t-Δlg)。1.3 3种消毒剂抗性:戊二醛、过氧乙酸及乙醇以无菌去离子水1:2等比系列稀释至1:256后作用于创伤弧菌,培养24h观察细菌生长情况,确定其对创伤弧菌的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC);20g/L戊二醛、5g/L过氧乙酸及75%乙醇作用于创伤弧菌10s、20s、30s、60s、90s及120s,培养24h后观察细菌生长情况,确定其对创伤弧菌的最快杀菌时效。2.创伤弧菌主动免疫预防的动物实验研究2.1创伤弧菌溶细胞毒素的提取、纯化及鉴定重组大肠杆菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3)恢复培养,行蓝白斑筛选,挑取白色菌斑进行PCR扩增并琼脂糖电泳验证目的基因存在。挑选阳性克隆并以最佳诱导条件进行诱导培养,离心收集细菌,超声破菌,离心后上清液经过His-Bind亲和层析方法纯化重组创伤弧菌溶细胞毒素(rVVC)并行SDS-PAGE电泳及Western-blot验证。纯化后的蛋白以透析法进行复性和浓缩。采用BCA(bicinchoninicacid)法进行蛋白定量,绘制标准曲线,计算出蛋白浓度。2.2创伤弧菌主动免疫预防的动物实验研究(1)实验动物及分组:SPF级BALB/c小鼠54只,雌雄不拘,随机分为创伤弧菌菌体抗原组(简称菌体抗原组)、溶细胞毒素蛋白抗原组(简称蛋白抗原组)、生理盐水对照组(简称对照组)各18只。(2)抗原制备:创伤弧菌菌体抗原,新鲜培养的创伤弧菌以0.3%甲醛灭活24h,无菌试验合格后4℃保存;创伤弧菌溶细胞毒素蛋白抗原,rVVC与完全弗氏佐剂/不完全弗氏佐剂等体积乳化制成。(3)免疫方案:小鼠皮下多点注射,创伤弧菌菌体抗原组小鼠接种菌体抗原:1×10~8个/只/次;溶细胞毒素蛋白抗原组小鼠接种蛋白抗原50μg/只/次;生理盐水对照组小鼠接种生理盐水:0.2ml/只/次,0d、首次免疫14d后每10d加强一次。(4)小鼠免疫学指标:免疫接种3-6次后,每组3只小鼠取外周血行流式细胞术检测小鼠外周血中淋巴细胞亚群比例;每组6只小鼠,取脾及胸腺,称重,MTT法检测脾淋巴细胞转化率;血清凝集试验及间接ELISA法检测特异性抗体及IgG效价。(5)创伤弧菌攻击试验:3组小鼠按上述方法免疫接种6次后,12只/组,75%酒精棉球消毒右下腹皮肤后腹腔注射新鲜培养创伤弧菌ATCC27562悬液,0.5ml/只,细菌浓度约为10~7-10~8cfu/ml。监测所有小鼠一般情况,包括呼吸、精神状态、毛发、体温等。小鼠死亡后立即解剖,存活小鼠于注射活菌后48h或10d断椎法处死,取其主要脏器及组织固定、石蜡包埋后按常规方法制片、HE染色,光镜下观察其病理变化。同时取心脏内血液或血凝块进行Vv分离培养及生化鉴定。结果1.创伤弧菌抗性实验1.1创伤弧菌ATCC27562生化特性符合创伤弧菌的生化鉴别特征,生化条鉴定结果:创伤弧菌%id=99.9(机读结果显示为“非常好的鉴定结果”)。1.2创伤弧菌紫外线抗性研究创伤弧菌ATCC27562在强度值达90μW/cm~2的紫外线照射,15min后定性培养为阴性,定量检测1min平均灭活对数值(LIV)悬液法为4.37±0.13、平板法为5.10±0.19,平均杀菌率悬液法为(99.99±0.01)%、平板法为(99.99±0.05)%,照射15min后无菌存活。1.3创伤弧菌对3种消毒剂抗性研究戊二醛对创伤弧菌的MIC为0.31g/L,MBC为10.00g/L;过氧乙酸对创伤弧菌的MIC为0.04g/L,MBC为0.31g/L;乙醇对创伤弧菌的MIC为4.69%,MBC为37.50%。20g/L戊二醛作用10s、5g/L过氧乙酸作用10s、75%乙醇作用60s均能有效杀灭创伤弧菌。2.创伤弧菌主动免疫预防动物实验2.1创伤弧菌溶细胞毒素的表达、提取、纯化及鉴定蓝白斑筛选LB平板上长有白色及蓝色的单克隆细菌斑,其中白色菌落为带重组质粒的细菌,即阳性克隆。挑取白色菌斑培养,进行质粒提取,并以其为模板进行PCR扩增vvhA基因,琼脂糖电泳获得相应大小目的条带(vvhA:1356bp)。SDS-PAGE电泳显示阳性克隆重组大肠杆菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导培养,能表达融合蛋白rVVC,在凝胶上70KD的位置可见相应蛋白条带。rVVC经透析复性、浓缩后,BCA法测定蛋白浓度为2.542mg/ml。Western-blot免疫印迹实验结果表明表达产物rVVC能与抗6×His组氨酸单克隆抗体特异结合。2.2小鼠免疫学指标(1)小鼠脾、胸腺重量检测结果蛋白抗原组小鼠脾重量较对照组为高(P=0.004),差异具有统计学意义;菌体抗原组小鼠脾重量与对照组比较,P=0.919,无统计学差异。菌体抗原组、蛋白抗原组与对照组小鼠胸腺重量比较差异均无统计学意义。(2)小鼠脾淋巴细胞转化率检测结果菌体抗原组小鼠ConA刺激的T淋巴细胞转化率、LPS刺激的B淋巴细胞转化率较对照组高(P=0.018、P=0.001),差异具有统计学意义,其Vv刺激的淋巴细胞转化率较对照组高,但差异不具有显着性(P=0.216);蛋白抗原组小鼠ConA刺激的T淋巴细胞转化率、LPS刺激的B淋巴细胞转化率及rVVC刺激的淋巴细胞转化率与对照组比较,差异均无显着性。(3)小鼠外周血淋巴细胞亚群检测结果叁组小鼠外周血的CD19~+ B淋巴细胞百分比差异具有统计学意义(P=0.03),菌体抗原组、蛋白抗原组均高于对照组。叁组小鼠外周血的CD4~+T细胞及CD8~+T细胞之百分比差异无统计学意义,CD4~+/CD8~+比值差异也无统计学意义。(4)血清凝集试验结果第3次免疫后,菌体抗原组与蛋白抗原组小鼠血清与菌体悬液混合,呈现流沙样阳性反应;对照组小鼠血清、生理盐水与菌体悬液混合均为阴性结果。(5)小鼠血清抗体IgG效价测定结果第5次加强免疫后,取小鼠血液行间接ELISA检测血清抗菌体/rVVC蛋白IgG效价,菌体抗原组血清抗菌体效价最高达1:25600,蛋白抗原组血清抗rVVC效价最高达1:25600。以各组血清最高稀释度取对数值1g行两独立样本t-检验,结果表明:菌体抗原组小鼠抗菌体IgG效价高于对照组,差异具有统计学意义;蛋白抗原组小鼠抗rVVC蛋白IgG效价高于对照组,差异具有统计学意义。(6)Western-blot检测结果将纯化复性后的rVVC经SDS-PAGE后,转移到PVDF膜上,以鼠抗rVVC血清为一抗进行Western-blot反应,结果显示rVVC能与免疫血清特异性结合,在相应大小处(约70KD)出现了特异性反应区带。2.3创伤弧菌攻击试验结果(1)小鼠一般情况生理盐水对照组注射菌液后36h内10只小鼠死亡,2只小鼠存活,存活率为16.7%;其中一只小鼠左后肢出现脓肿、破溃及溃疡形成,后肢活动明显受限。菌体抗原组及蛋白抗原组小鼠注射菌液后出现毛发竖立、进食减少、蜷缩少动等情况,但均较对照组为轻,48b内小鼠均存活,存活率为100%。菌体抗原组及蛋白抗原组小鼠48h存活率均高于对照组,差异具有统计学意义。对照组小鼠血培养为阳性,还原鉴定为创伤弧菌。菌体抗原组及蛋白抗原组小鼠注射菌液后48h血培养为阳性,10d培养为阴性。(2)病理改变生理盐水对照组死亡小鼠各脏器组织充血淤血病变严重,局部见中性粒细胞浸润;存活小鼠各组织基本正常,其中一只后肢皮肤溃疡形成、软组织呈蜂窝织炎改变。菌体抗原组及蛋白抗原组48h处死小鼠各脏器组织轻度淤血,可见炎细胞浸润;10d处死小鼠:蛋白抗原组肝组织局部细胞灶状、片状坏死,呈脓肿样改变;其余各组织基本正常。结论1创伤弧菌ATCC27562对紫外线敏感,属紫外线低度抗性菌;90μW/cm~2的紫外线能有效灭杀创伤弧菌ATCC27562,20g/L戊二醛、5g/L过氧乙酸、75%乙醇能将其迅速有效灭活。2创伤弧菌菌体抗原、创伤弧菌溶细胞毒素蛋白抗原能有效刺激、增强BALB/c小鼠特异性体液免疫功能,产生创伤弧菌菌体抗体及创伤弧菌溶细胞毒素蛋白抗体,使小鼠获得有效的免疫保护,可作为创伤弧菌的候选疫苗进一步研究。3致死量创伤弧菌侵犯BALB/c小鼠,小鼠体内创伤弧菌菌体抗体、溶细胞毒素蛋白抗体不能完全将其杀灭,能有效减轻其毒性作用,明显提高小鼠生存率,降低致残作用。(本文来源于《南方医科大学》期刊2009-04-10）
郑晶[6]（2008）在《创伤弧菌溶细胞毒素及金属蛋白酶的基因克隆、蛋白表达、抗体制备及其致病性研究》一文中研究指出创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是弧菌属第5群细菌,根据其生化特性、流行病学模式以及宿主范围将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个亚型,其中Ⅰ型Vv是导致人群创伤感染及原发性败血症的病原体。创伤弧菌感染一旦出现败血症,其死亡率高达50%以上。原发性创伤弧菌感染发病率呈逐年递增的趋势。我国国内1990年首次报道一例,随后沿海各地区每年都有散发病例报道,其病死率一直居高不下。对本病的认识不足,发病早期未能正确诊断,或误诊为药物超敏反应而使用大剂量激素,是造成高病死率的主要原因。因此,认清创伤弧菌感染的特点及致病机制,建立适合的诊断方法至关重要。有研究表明金属蛋白酶(VVP)及溶细胞毒素(VVC)作为创伤弧菌的两种胞外产物,与创伤弧菌的致病性密切相关。虽然目前有大量关于金属蛋白酶及溶细胞毒素与创伤弧菌致病性关系的研究,例如:有学者认为金属蛋白酶具有增加血管通透性,引起出血性损伤的作用;而溶细胞毒素是创伤弧菌分泌的一种水溶性的多肽,是创伤弧菌致病性的重要因素之一。但是目前这两种胞外产物的具体致病机制及其在感染创伤弧菌机体中的定位并未明了。在对创伤弧菌感染的诊断方面,由于创伤弧菌引起的腹泻及最初的症状并无特异性,因而实验室诊断成为最可靠的确诊手段。以免疫学为基础的血清学检测,是采用单克隆或多克隆抗体,利用抗原抗体特异性反应,并结合生物化学或物理学方法而建立的免疫学检测方法。由于其操作简便、快速,结果易于判定,在创伤弧菌的鉴定中日益显出优势。而以免疫学为基础的血清学检测诊断的实施,其首要条件是选择合适的被测靶抗原,并且获得针对靶抗原的高质量特异性抗体也是其根本所在。金属蛋白酶及溶细胞毒素均是创伤弧菌的胞外产物,且与创伤弧菌的致病性密切相关。另一方面,分别表达这两种胞外产物的基因:vvp和vvhA,在不同创伤弧菌菌株之间也具有高度保守性。因此,金属蛋白酶及溶细胞毒素可以作为创伤弧菌感染诊断的实验室检测靶标。无论是研究这两种胞外产物的具体致病机制还是要制备以它们为靶标的Vv免疫检测试剂盒,都必须以获得相应的足量、高纯度的金属蛋白酶和溶细胞毒素为基础。但是金属蛋白酶和溶细胞毒素作为创伤弧菌种特征性的外毒素,它们自然分泌产量并不高,且因方法学的限制,采用常规生化方法获得足量高纯度的蛋白相当困难。而通过基因工程的方法,就可以在一个合适的系统中,使外源基因高效表达,从而生产有价值的蛋白质,对其应用或进行功能的研究。目的:通过基因工程的方法,建立使vvp及vvhA基因高效表达的原核表达系统,从而得到高产量高纯度的创伤弧菌金属蛋白酶和溶细胞毒素。并在此基础上制备分别针对二者的多克隆抗体并初步研究这两种创伤弧菌胞外产物的具体致病作用及其在感染创伤弧菌机体中的定位,为揭示Vv的致病机制、临床Vv感染的诊治及进一步免疫检测试剂的研究提供依据。方法:1.创伤弧菌溶细胞毒素vvhk基因及金属蛋白酶vvp基因的体外扩增、克隆及序列分析:(1) PCR扩增、目的片断的纯化回收及连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α:以Vv基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增vvhA、vvp基因的全长cds片断;紫外灯下切下含目的片断的凝胶,应用TakaRa的凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化;纯化回收的目的片断与T-载体在连接酶的作用下进行连接反应;CaCl_2法制备感受态大肠杆菌DH5α,将连接产物转化感受态细胞。(2)鉴定及序列分析:氨卞抗性筛选后,用质粒小提试剂盒对具有氨卞抗性的克隆进行质粒抽提;以提取的质粒为模板进行PER扩增反应,对PCR阳性结果的重组质粒再用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切鉴定。将鉴定正确的质粒分别命名为pGEM-T-vvhA和pGEM-T-vvp,并进行测序,对测序结果进行序列分析。2.创伤弧菌溶细胞毒素vvhA及金属蛋白酶vvp重组表达质粒的构建及鉴定:(1)原核表达载体的构建:对重组质粒pGEM-T-vvhA、pGEM-T-vvp及质粒pET-32a~+用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳。切下含有目的片断的凝胶带后,进行纯化回收。vvp、vvhA基因片断分别与pET-32a~+质粒酶切片断在T_4连接酶的作用下连接;并将连接产物转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)。(2)重组质粒的筛选和鉴定:用质粒小提试剂盒对具有氨卞抗性的克隆进行质粒抽提;以提取的质粒为模板进行PCR鉴定和以BamH I和Xho I双酶切鉴定后,将两种重组质粒分别命名为pET-32a-vvhA和pET-32a-vvp。以诱导剂IPTG诱导外源基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达,对表达产物作SDS-PAGE分析,将融合蛋白分别命名为rVVP及rVVC,并以抗6×His组氨酸单克隆抗体为一抗对融合蛋白的表达进行免疫印迹检测。3.溶细胞毒素及金属蛋白酶重组蛋白的纯化及抗原性分析:(1)蛋白表达条件的优化:对蛋白表达可溶性进行分析后针对诱导过程中对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素:诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用统计学软件进行正交实验设计,对结果进行直观分析及方差分析。对实验得出的最佳诱导条件组合进行验证。(2)目的蛋白的纯化、复性、浓缩、浓度测定及抗原性分析:以最佳诱导条件对重组工程菌进行诱导后,超声破菌。融合蛋白rVVP及rVVC经过His-Bind亲和层析方法获得纯化。纯化后的蛋白以透析法进行复性和浓缩。采用Bradford法进行蛋白定量,绘制标准曲线计算出蛋白浓度。以纯化后的重组蛋白为抗原,以兔抗创伤弧菌全菌血清为一抗,通过间接ELISA法及Western-blot检测重组蛋白抗原性。4.溶细胞毒素及金属蛋白酶多克隆抗体的制备及溶细胞毒素及金属蛋白酶致病性的研究:(1)多克隆抗体的制备:将蛋白与佐剂1:1混合后注射新西兰大白兔,皮下多点注射。用免疫琼脂双扩散法初步检测抗体的滴度,当滴度达到1:16后,颈动脉放血,提取血清,并对免疫血清进行效价测定及特异性检测;根据抗血清特异性检测结果,对多抗血清进行吸收纯化,得到多克隆抗体。(2)溶细胞毒素及金属蛋白酶致病性的研究:昆明小鼠36只,应用随机数字表法随机分成6组,每组6只,分别为溶细胞毒素注射组、金属蛋白酶注射组、溶细胞毒素及金属蛋白酶联合注射组、Vv活菌注射组及对照1组、对照2组。Vv活菌注射组腹腔注射Vv菌液;对照1组腹腔注射等量的灭菌的Marinebroth 2216培养基;溶细胞毒素注射组及金属蛋白酶注射组小鼠分别注射前述纯化复性的rVVC及rVVP,联合注射组小鼠注射rVVC和rVVP的混合液;对照2组尾静脉注射等量的灭菌的透析液。随后对小鼠一般情况进行观察及脏器组织的Vv分离鉴定和病理学观察,以确定溶细胞毒素及金属蛋白酶对各脏器组织的致病性;以所制备的多克隆抗体为一抗免疫组化法检测组织中创伤弧菌溶细胞毒素和金属蛋白酶的分布情况。结果:1.创伤弧菌溶细胞毒素vvhA基因及金属蛋白酶vvp基因的体外扩增、T-A克隆及序列分析:从VvATCC27562株DNA模板中扩增vvhA基因及vvp基因cds全长,均获得与预期大小相符合的目的条带。经过T-A克隆得到重组质粒pGEM-T-vvhA和pGEM-T-vvp,对其进行测序、序列分析及比对:vvp基因cds全长1830bp,A、T含量分别为25.96%和24.54%,(G+C)含量占49.5%。其核苷酸序列与创伤弧菌E86株的vvp基因序列(GeneBank No.DQ923325)比较,同源性为99%,有17处点突变。其中15处为同义突变;2处为错义突变:vvhA基因cds全长1356bp,A、T含量分别为27.65%和23.89%,(G+C)含量占48.45%。其核苷酸序列与创伤弧菌CDC B3547株的vvhA基因序列(GeneBank No.AB124803.1)比较,同源性为99%,有9处点突变并且均为同义突变。2.创伤弧菌溶细胞毒素vvhA及金属蛋白酶vvp重组表达质粒的构建及鉴定:表达载体pET-32a-vvhA及pET-32a-vvp转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,均能表达融合蛋白。Western-blot免疫印迹实验结果表明表达产物rVVC及rVVP均能与抗6×His组氨酸单克隆抗体特异性结合,这一结果也证实所构建的两种原核表达系统均能表达融合6×His组氨酸的蛋白。3.溶细胞毒素金属蛋白酶重组蛋白的纯化及抗原性分析:基于正交实验设计优化融合蛋白的表达条件,对实验结果的直观分析及方差分析均表明:各因素对rVVP表达的重要性依次为诱导摇菌转数、诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度。本实验的最佳组合诱导条件为摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L:而各因素对rVVC表达的重要性依次为诱导时间、摇菌转数、诱导剂IPTG浓度、诱导温度。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度30℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。在各自优化的诱导条件下两种蛋白均能高效表达,蛋白表达量分别达到了40.67%(rVVP)及58.27%(rVVC)。通过亲和层析的方法可以获得较纯的蛋白,并且两种蛋白都具有良好的抗原性。4.溶细胞毒素VVC及金属蛋白酶VVP多克隆抗体的制备及其致病性研究:(1)多克隆抗体的效价及特异性检测:吸收纯化后的溶细胞毒素及金属蛋白酶多克隆抗体分别与相应的溶细胞毒素及金属蛋白酶均能很好地特异性结合,且与多种常见细菌菌体无交叉反应;两种抗体的效价均达到了1:12800。(2)腹腔注射Vv致小鼠感染后致小鼠多脏器损伤,尤以肺、肝脏、肾脏的损伤最为严重。肺和肾脏的损伤均以出血性病变为主,而肝脏的损伤表现为肝细胞广泛的水肿、气球样变性。(3)溶细胞毒素及金属蛋白酶对小鼠各脏器组织的致病性观察:溶细胞毒素可导致小鼠肺脏的损伤,且与腹腔注射Vv致小鼠感染后肺损伤相似,以出血性病变为主。而金属蛋白酶未对小鼠的各脏器组织造成明显损伤。溶细胞毒素联合金属蛋白酶作用导致的小鼠肺损伤与溶细胞毒素单独作用没有差别。(4)免疫组化检测结果:溶细胞毒素注射组、联合注射组及Vv活菌注射组小鼠肺组织中均检测到了溶细胞毒素的分布:主要分布于肺支气管上皮、肺泡上皮;以兔免疫前血清作为一抗的阴性对照组肺组织,肺支气管上皮及肺泡上皮均为阴性结果;肝脏和肾组织中未见溶细胞毒素分布。而金属蛋白酶注射组、联合注射及Vv活菌注射组小鼠的各主要脏器组织中均未检测到金属蛋白酶的分布。结论:1.证实了vvp基因及vvhA基因均在创伤弧菌的不同菌株之间具有高度的保守性。2.构建了创伤弧菌vvp基因及vvhA基因高效原核表达系统,得到了高纯度有活性的重组蛋白rVVP和rVVC;两种蛋白均具有良好的免疫原性,为创伤弧菌致病机制的研究及创伤弧菌免疫检测试剂盒及疫苗的研制奠定了基础。3.成功制备了特异性较好的抗Vv溶细胞毒素多克隆抗体及抗Vv金属蛋白酶多克隆抗体。4.首次证实创伤弧菌感染机体时,溶细胞毒素对其毒性的产生是必须的,溶细胞毒素可独立发挥作用对机体造成损伤;发现肺脏是创伤弧菌感染机体时其毒力因素溶细胞毒素作用的靶器官。5、在注射剂量为0.338mg/只的情况下,金属蛋白酶不能独立作用对小鼠机体组织造成损伤;金属蛋白酶对伤弧菌毒力的产生可能并不是必须的。6、溶细胞毒素和金属蛋白酶之间不存在相互协同或抑制作用。(本文来源于《南方医科大学》期刊2008-04-15）
张家敏,楼永良,应斌宇,严杰[7]（2006）在《创伤弧菌溶细胞毒素单克隆抗体制备及其鉴定》一文中研究指出目的制备创伤弧菌(Vibrio vulnificus)溶细胞素vvhA基因产物鼠源性单克隆抗体并鉴定其特异性和免疫性,为进一步研制创伤弧菌检测试剂盒奠定基础。方法采用IPTG诱导目的重组蛋白rvvhA表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rvvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用杂交瘤技术和rvvhA-ELISA制备并筛选分泌rvvhA单克隆抗体的细胞株,有限稀释法进行细胞克隆。采用免疫双扩散法鉴定单克隆抗体类型。采用ELISA、免疫双扩散法和Western Blot鉴定单克隆抗体的效价和特异性。结果在0.5mmol/L IPTG诱导下,rvvhA产量可占细菌总蛋白的18%。提纯的rvvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。共获得9株rvvhA抗体阳性的杂交瘤细胞株,其中A5E8和C3B6株可持续分泌高效价特异性单克隆抗体,其抗体类型分别为IgG1和IgG2a。A5E8和C3B6单克隆抗体有较高特异性,与多种其它细菌蛋白不发生免疫反应,对rvvhA及创伤弧菌GTC333株和WZ01株蛋白的ELISA检测阳性的效价可达1∶4000~1∶8000、免疫双扩散效价为1∶4~1∶8,Western Blot结果显示此等单克隆抗体均能有效识别rvvhA。结论本研究成功地获得了2株稳定分泌rvvhA特异性单克隆抗体的鼠源性杂交瘤细胞株,rvvhA单克隆抗体可用于检测自然表达的创伤弧菌溶细胞素。(本文来源于《中国人兽共患病学报》期刊2006年11期）
齐东来,李一丹,高继国[8]（2005）在《苏云金杆菌溶细胞毒素及相关基因研究进展》一文中研究指出苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性土壤细菌,在其芽孢形成期能够产生多种杀虫晶体蛋白,这些蛋白在靶害虫中肠内被激活为毒素并使细胞膜穿孔,从而达到杀虫目的。近年来,关于溶细胞毒素分布、分类、杀虫机理、昆虫抗性等问题的研究已成为新的热点。文章综述了各国实验室在这些方面的最新进展。(本文来源于《东北农业大学学报》期刊2005年01期）
溶细胞毒素论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:对创伤弧菌溶细胞毒素融合蛋白表达条件进行优化,从而获得高效稳定的溶细胞毒素(Vibrio vulnificus Hemolysin,VVH)原核表达系统。方法:质粒pGEX-4T-1-vvh转化E.coli BL21/DE3后,针对诱导过程中对工程菌表达蛋白产生影响的4个因素:诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数,运用统计学软件进行正交实验设计,对结果进行直观分析及方差分析。并对实验得出的最佳搭配诱导条件进行验证。结果:直观分析表明诱导时间的R值最大,其次为摇菌转速和诱导剂IPTG浓度,诱导温度的R值最小;方差分析表明诱导时间的P<0.05,而转速、温度及IPTG浓度的P均>0.05。结论:诱导时间为主要因素(其为4h,表达水平最高),其次为摇菌转速、诱导剂IPTG浓度和诱导温度。本实验的最佳搭配诱导条件为摇菌转数为250r/min、诱导时间4h、诱导温度30℃、诱导剂IPTG浓度1mmol/L。在此诱导条件下,溶细胞毒素的表达量达到了55.31%。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
溶细胞毒素论文参考文献
[1].史文军,张朝晖,秦松,吴建平.中华仙影海葵溶细胞毒素的初步分离及稳定性研究[J].中国海洋药物.2013
[2].郑晶,王明华.正交试验设计优化重组蛋白溶细胞毒素的表达[J].海南医学院学报.2012
[3].孙佳春.创伤弧菌溶细胞毒素对人肺腺癌细胞株A549杀伤作用及初步机制的研究[D].南方医科大学.2011
[4].欧刚卫.霍乱弧菌蛋白酶PrtV对霍乱弧菌溶细胞毒素引起人肠上皮细胞炎性反应的修饰[J].遵义医学院学报.2009
[5].王贵明.创伤弧菌消杀抗性及其菌体抗原、溶细胞毒素蛋白抗原主动免疫的动物实验研究[D].南方医科大学.2009
[6].郑晶.创伤弧菌溶细胞毒素及金属蛋白酶的基因克隆、蛋白表达、抗体制备及其致病性研究[D].南方医科大学.2008
[7].张家敏,楼永良,应斌宇,严杰.创伤弧菌溶细胞毒素单克隆抗体制备及其鉴定[J].中国人兽共患病学报.2006
[8].齐东来,李一丹,高继国.苏云金杆菌溶细胞毒素及相关基因研究进展[J].东北农业大学学报.2005