导读:本文包含了重组腺病毒携带论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:多西他赛,Onco~(Ad)-mK5,前列腺癌,VEGF
重组腺病毒携带论文文献综述
胡云,方先龙,顾锦法,杨圆圆,李慧[1]（2019）在《携带mK5基因的重组腺病毒联合多西他赛对LNCaP细胞的体外抗癌作用探究》一文中研究指出该文通过携带mK5基因的溶瘤腺病毒Onco~(Ad)-mK5联合多西他赛(docetaxel, DTX)处理前列腺癌细胞株LNCaP,以探究两者联合作用的体外抗癌效果。采用CCK-8法分别检测Onco~(Ad)mK5、docetaxel以及两者联合用药对LNCaP增殖的抑制作用;用显微镜分别观察Onco~(Ad)-mK5、多西他赛单独作用及两者联合作用引起的细胞形态学变化;利用Hoechst 33258染色、流式细胞术检测各处理组细胞的凋亡情况; Western blot检测E1A、m K5以及凋亡相关蛋白Caspase-8、XIAP、PARP的蛋白质表达水平;实时荧光定量PCR(Q-PCR)分析处理组细胞的血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA水平变化。结果表明:感染复数(multiplicity of infection, MOI)=4的溶瘤腺病毒Onco~(Ad)-mK5与5 nmol/L的docetaxel能够协同抑制LNCaP的生长,且两者联合处理组的细胞凋亡现象比单独作用的效果更明显,这一新的药物组合为前列腺癌的临床治疗提供了参考。(本文来源于《中国细胞生物学学报》期刊2019年05期）
陈爽[2]（2019）在《携带apoptin的重组腺病毒对人乳腺癌细胞MCF-7的抗肿瘤作用及蛋白质组学相关研究》一文中研究指出研究背景:乳腺癌作为世界上常见恶性肿瘤其发病率呈逐年上升[1]。手术是乳腺癌最常见的治疗方法,其次为术后辅助化疗。然而手术创伤大,化疗副作用多,部分癌细胞还具有显着耐药性[2,3]。因此,开发毒性低、副作用少的新型抗肿瘤药物尤为重要。肿瘤的发生与发展不仅体现为细胞增殖失控、分化异常,也与肿瘤细胞凋亡失衡密切相关。伴随分子生物学的不断发展进步,科学家发现凋亡并非是决定细胞死亡的唯一命运。近年,细胞自噬被证实与凋亡共同调控细胞死亡,不同情况下,自噬可能抑制或是促进凋亡。Apoptin是一种具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡作用的新型抗肿瘤生物蛋白。虽然其诱导某些肿瘤细胞凋亡得以肯定,但对其具体机制仍不明确,并且与凋亡密切的相关的另一种死亡形式——自噬,是否也与apoptin相关至今未有人提出。本实验旨在发现apoptin对肿瘤细胞MCF-7的抗肿瘤作用及其发生的相应分子机制。研究目的:利用本课题组已构建的人5型腺病毒为载体叁种重组腺病毒Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK,研究表达apoptin蛋白的重组病毒Ad-VT和Ad-VP3对肿瘤细胞MCF-7的杀伤作用参与方式,是否为自噬或凋亡,是否为是二者均有,它们之间是否又存在联系及可能参与的信号通路,为apoptin的进一步研究和开发提供理论依据。研究方法:MTS细胞活性检测,分析叁种重组腺病毒Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对肿瘤细胞MCF-7和人乳腺上皮细胞MCF-10A的杀伤抑制作用。利用自噬抑制剂3-MA的Annexin V-FITC/PI.流式实验,qPCR和Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62和Beclin-1的定量定性实验,鉴定自噬的多种染色实验(MDC、IFA、p EGFP-LC3)及透射电镜实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞的自噬作用。通过细胞周期检测、AnnexinV-FITC/PI检测、Hoechst染色、JC-1染色、透射电镜等实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞的凋亡作用。通过伤口愈合实验和BioCoat小室侵袭实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞迁移和侵袭能力的影响。通过蛋白质组学实验分析携带apoptin的重组腺病毒Ad-VT和Ad-VP3作用MCF-7细胞后,产生的差异蛋白的功能和可能参与的信号通路。检测已构建含萤火虫荧光素酶的MCF-7细胞通过荧光素酶活性、稳定性,体外成像筛选出最稳定表达荧光素酶的MCF-7-luc。进行MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的生长特性、侵袭能力和细胞周期等生物学特性的比对检测。通过细胞抑制率MTS实验、细胞膜AnnexinV-FITC/PI流式实验、细胞核Hoechst染色实验验证Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的作用效果。建立小鼠皮下荷瘤模型后,通过活体成像实验、游标卡尺测量肿瘤体积及生存期观察,研究Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对肿瘤的抑制效果和小鼠生存期的影响。研究结果:1.体外MTS实验发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3对人乳腺癌MCF-7细胞具有杀伤作用,对人乳腺上皮细胞MCF-10A无显着杀伤作用。Ad-MOCK对MCF-7细胞和MCF-10A无杀伤作用。2.流式细胞术、Western Blot、qPCR、MDC染色、IFA和透射电镜实验提示携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3在细胞作用早期(6h和12h)促进肿瘤细胞MCF-7自噬增强。3.通过细胞周期检测、AnnexinV-FITC/PI检测、Hoechst染色、JC-1染色、透射电镜实验,发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3促进人乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡。4.通过伤口愈合实验和BioCoat小室侵袭实验,发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3能够抑制MCF-7细胞的迁移和侵袭能力。5.蛋白质组学实验对差异蛋白进行GO和KEGG分析提示:携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3作用能够促发人乳腺癌细胞MCF-7的自噬和凋亡。FOXO1和FOX03a蛋白参与apoptin引起细胞死亡的机制,特别是AMPK信号通路。6.选择活性最高、稳定性最好且与发光强度呈正相关的线性关系(R2=0.9903)的Clone 15株进行实验;通过MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞生物学特性鉴定,证明了构建过程对细胞的生长特性、侵袭能力和细胞周期未产生显着的影响。体外MTS实验、AnnexinV-FITC/PI流式实验和Hoechst染色实验证实重组腺病毒对MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的作用效果无显着差别,可使用MCF-7-luc细胞进行小鼠荷瘤实验。7.体内实验裸鼠活体成像提示:携带apoptin的Ad-VP3和Ad-VT治疗组与对照组相比肿瘤平均生物发光强度较低,肿瘤体积变小,荷瘤小鼠的生存期延长。研究结论:携带apoptin的重组腺病毒可显着抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长,而对人乳腺正常上皮细胞MCF-10A无抑制作用。携带apoptin的重组腺病毒主要以细胞凋亡方式引起MCF-7细胞的死亡,同时会对细胞自噬产生显着的影响,在作用的早期,自噬对癌细胞起到保护性作用,而在凋亡水平逐渐占据主导时,凋亡作用已经超过自噬所起到的保护作用的阈值,自噬开始逐渐降低,而后至48h左右自噬再一次升高和凋亡共同作用促进MCF-7细胞死亡。FOXO1蛋白和FOX03a蛋白参与了 apoptin引发的MCF-7细胞的自噬和凋亡,特别是与FOXO蛋白相关的AMPK信号通路,因此本研究认为AMPK可能将细胞自噬和细胞凋亡联系起来作为apoptin引起肿瘤细胞死亡的调控通路。(本文来源于《延边大学》期刊2019-05-11）
张本斯,李庄,卞思源,杨桂,李艳娇[3]（2018）在《携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体的构建和包装》一文中研究指出目的:构建携带ephrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体,通过包装、扩增、鉴定,为后续开展目的基因靶向治疗乳腺癌研究奠定基础。方法:以pMD18T-Casp3、pMD18T-EphrinA1为模板扩增caspase-3、EphrinA1基因,以pET28a为载体,通过双酶切、连接、转化、测序鉴定,构建pET28a-EphrinA1-Casp3。然后以质粒pEC3.1(+)为载体,获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3。采用LR体外同源重组,构建pAd-EphrinA1-Casp3,以HEK293包装和放大培养。结果:成功将PCR扩增的EphrinA1胞外端基因和人活性型caspase-3基因定向克隆入质粒pET28a,并将EphrinA1-caspase-3融合基因转移到穿梭质粒pEC3.1(+),获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3载体;经过体外同源重组,成功构建携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3;并在HEK 293细胞中完成包装和扩增;获得重组腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3。结论:利用GatewayTM技术成功构建重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3,经HEK293细胞包装,获得重组腺病毒rAdEphrinA1-Casp3。(本文来源于《解剖学杂志》期刊2018年04期）
艾迪,李文杰,李一权,陈爽,朱羿龙[4]（2018）在《携带Apoptin及hTERT启动子的双重特异性重组腺病毒的构建及鉴定》一文中研究指出从质粒pMT-E1a和pIRES-neo中获得目的基因E1a和PolyA并连接入质粒pKS-hTERTp,用XhoⅠ和SpeⅠ双酶切后连接入线性化的pAd-Apoptin,获得穿梭载体pAd-apoptin-PolyA-hTERTp-E1a。穿梭载体pAd-ApoptinPolyA-hTERTp-E1a和腺病毒骨架质粒(pAd5)共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a,采用RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,MTS法检测病毒对A549细胞的抑制作用;绘制重组腺病毒生长曲线,监测重组腺病毒在细胞内的复制能力。结果显示:构建出的重组腺病毒中包含有了目的基因Apoptin和E1a,并且目的基因在细胞中正确的表达;MTS结果显示重组腺病毒对A549具有抑制作用,且抑制作用具有一定的时效及剂效关系;重组腺病毒具有在A549细胞中正常复制的能力。结果表明:成功的构建出了具有特异性杀伤和特异性复制能力的双重特异性重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2018年05期）
邓守恒,胡茵,曹风军,蔡晓军,李林均[5]（2017）在《携带凋亡素VP3基因重组腺病毒的制备及其在人结肠癌SW480细胞中的表达》一文中研究指出目的利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒并观察其在人结肠癌SW480细胞中的表达。方法扩增目的基因VP3 cDNA,与EcoRⅤ酶切线性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭质粒连接构建重组穿梭质粒pShuttle-VP3-hrGFP,PmeⅠ酶切线性化pShuttleVP3-hrGFP并转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-VP3-hrGFP,并经PCR、EcoRⅤ、PacⅠ酶切电泳及测序鉴定,线性化的重组腺病毒质粒经脂质体包裹转染AD293细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,CsCI密度梯度离心法行病毒浓缩和纯化并将其感染人结肠癌SW480细胞中进行表达,观察其感染效率及VP3蛋白表达水平。结果 pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒构建鉴定成功,PCR反应扩增出402 bp的片段;pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒经酶切获得大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,重组腺病毒质粒经测序证实VP3-hrGFP编码区成功克隆入腺病毒p Ad中,且其序列与Gen Bank中VP3 CDNA序列完全一致。成功包装出携带VP3基因的重组腺病毒,滴度为1.738×10~(12)opu/ml,重组腺病毒可在SW480细胞内得到有效表达。结论用细菌内同源重组法可快速、高效地制备携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒,并可在人结肠癌细胞中高效表达。(本文来源于《中国老年学杂志》期刊2017年18期）
吴冰冰[6]（2017）在《携带凝集素基因的重组腺病毒和痘苗病毒对肝癌细胞的作用机制研究》一文中研究指出第一部分携带凝集素基因的重组腺病毒和痘苗病毒对肝癌细胞的作用机制研究癌症严重威胁人类的生命和健康。肝癌是人类最常见癌症之一。随着分子生物学的发展和基因技术的进步,靶向基因—病毒联合治疗已成为肝癌治疗新的研究热点。凝集素是一类专一识别糖并与之非共价、可逆地结合的蛋白质或糖蛋白。过去几年本课题组应用病毒携带凝集素基因,通过病毒感染使凝集素基因在肿瘤细胞内表达,并对肿瘤细胞产生的细胞毒性作了一定的研究。但是,将携带不同凝集素的重组腺病毒和痘苗病毒对体外肝癌细胞的杀伤机制还没有深入研究。本课题利用已构建好的携带鲈鱼凝集素(Dicentrarchus labrax lectin,DIFBL)、紫海胆凝集素(Strongylocentrotus purpuratus lectin,SPL)、盘鲍鱼凝集素(Haliotis discus discus Lectin,HddSBL)和掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)的重组腺病毒Ad-DIFBL、Ad-SPL、Ad-HddSBL和重组溶瘤痘苗病毒OncoPox-PPA、OncoPox-SPL,感染肝癌细胞,研究凝集素对细胞的毒性作用机制。本课题将人的肝癌细胞SMMC-7721的肌纤维膜关联蛋白(Sarcolemma associated protein,SLMAP)和Striatin靶点Knock Down,然后用等量感染复数的Ad-DIFBL感染细胞,MTT检测以及荧光显微镜观察显示,Ad-DIFBL对SLMAP和Striatin Knock Down的SMMC-7721细胞的毒性作用明显低于对照细胞,说明SLMAP和Striatin这两种基因可能与凝集素的毒性有一定的关系,但其深入的机制尚需进一步研究。通过Western blot实验,发现用Ad-DIFBL和Ad-HddSBL处理后的细胞中组蛋白Histone H3表达量下降;用Ad-SPL和Ad-HddSBL处理后的细胞中ISG15表达量下降。OncoPox-PPA和OncoPox-SPL相较于对照病毒OncoPox-pCB,使肿瘤细胞中C-myc、SLMAP、Beclin 1表达水平明显下降;β-catenin微量下降;β-tubulin产生二聚体和叁聚体。用OncoPox-PPA、OncoPox-SPL与Onco Pox-pCB分别去感染SMMC-7721肿瘤细胞,将样品进行转录组数据分析,结果显示凝集素对多种基因水平产生影响。OncoPox-PPA处理与Onco Pox-pCB处理相比,细胞中Caspase8,FGFR1,MAVS,SIKE1上调;而TMEM173,STRIP1,IFIH1,CTTNBP2NL,Striatin4,FGFR4下调;OncoPox-SPL感染的细胞与Onco Pox-pCB感染相比,CTTNBP2NL,Striatin4,FGFR2,FGFR3,SIKE1上调;AKT1,Caspase9,FGFR4,PRMT5,STRIP1,FGFR1,MAVS,CERK下调。综上所述,Ad-DIFBL对SLMAP和Striatin Knock Down的SMMC-7721细胞的毒性相比于对照细胞明显降低,说明凝集素DIFBL与SLMAP、Striatin之间存在某种相互作用,具体是什么样的作用需要后续深入研究;Western blot,免疫共沉淀,转录组数据分析等结果显示,凝集素对多种基因表达水平产生影响。本研究为今后将凝集素基因应用于肝癌治疗研究提供了一定的基础。第二部分DIFBL、HddSBL凝集素与腺病毒受体连接的融合蛋白的抗肿瘤机制研究利用已构建好的sCAR-DIFBL和sCAR-HddSBL两种融合凝集素基因,连接到原核表达载体pQE30上,将质粒分别转到M15原核表达菌株中。通过IPTG诱导剂成功诱导出两种融合蛋白的表达,并且是以包涵体的形式表达。将诱导出的蛋白进行Ni离子亲和层析纯化及包涵体复性。融合蛋白的sCAR部分是腺病毒受体的膜外片段,能够和5型腺病毒结合;融合蛋白的凝集素部分可与肿瘤细胞膜上的某些糖蛋白结合。因此,这些融合蛋白可以通过桥连作用,使腺病毒通过细胞膜糖蛋白感染凝集素识别的肿瘤细胞。所以本课题利用这两种融合蛋白作为工具蛋白,和Ad-EGFP联合作用感染多种肿瘤细胞,通过荧光显微镜观察不同融合蛋白对Ad-EGFP感染肿瘤细胞效率的影响,发现两种融合蛋白不仅能够增强Ad-EGFP对K562/ADR和U87-MG细胞中的感染。流式检测GFP表达量结果与荧光显微镜下观察结果一致,提示凝集素DIFBL和HddSBL能识别某些肿瘤细胞膜上的糖蛋白。分别用重组腺病毒Ad-DIFBL和Ad-PPA与融合蛋白s CAR-DIFBL和sCAR-HddSBL单独或联合作用,MTT和Annexin V-FITC/PI双标记流式结果表明融合蛋白sCAR-DIFBL能够与重组病毒协同作用,增强对肿瘤细胞的杀伤效果;sCAR-HddSBL虽然也能增加病毒感染率,却能够抑制Ad-DIFBL和Ad-PPA的对肿瘤细胞的杀伤作用。Western blot结果显示,用重组腺病毒Ad-DIFBL和Ad-PPA与融合蛋白sCAR-DIFBL和sCAR-HddSBL联合作用U87-MG细胞后,p-ERK水平上升,说明凝集素DIFBL和HddSBL对细胞毒性作用无关;sCAR-HddSBL无论是与病毒联合还是单独作用于U87-MG后,E2F-1的表达量都呈上升的趋势,表明HddSBL很可能激活E2F-1的表达,达到保护肿瘤细胞生长的目的,进一步揭示了凝集素DIFBL和HddSBL对肿瘤细胞的作用机制。(本文来源于《浙江理工大学》期刊2017-03-20）
赵珍珍[7]（2016）在《携带CTTNBP2NL基因的重组腺病毒的抗癌研究》一文中研究指出Ⅰ.随着生活压力增大,环境污染加剧,恶性肿瘤的发病率越来越高,所以寻找一种高效治疗方法已成为近年的研究重点。CTTNBP2NL(CTTNBP2N-terminal like)编码的蛋白为N末端样皮肌动蛋白结合蛋白2,与CTTNBP2同源,在神经系统的发生过程中起重要作用。又因为腺病毒在病毒疗法中具有稳定性好,宿主范围广,使用安全的优点。我们将CTTNBP2NL基因插入到腺病毒载体上,构建了非复制型重组腺病毒Ad-CTTNBP2NL。利用MTT法检测重组病毒对不同癌细胞系增殖有抑制作用。结晶紫实验观察到重组腺病毒对癌细胞有很好的杀伤效果。通过Hoechst33258染色和流式细胞术实验分析携带CTTNBP2NL基因的重组腺病毒可以诱导细胞凋亡。转染pEGFP-LC3-C1到癌细胞后,感染重组病毒检测癌细胞没有自噬。Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白及自噬相关蛋白的表达量,证明CTTNBP2NL基因通过凋亡途径诱导癌细胞死亡。本实验为将CTTNBP2NL基因运用到癌症的治疗上提供了一定的理论基础。Ⅱ.在海洋自然资源中,海洋凝集素在治疗癌症方面具有很大的潜力。其中UPL1(Ulva pertusa lectin 1)能够对红细胞起凝集作用,具有研究价值。本实验在已有的研究基础上对UPL1和细胞信号通路之间相互作用的关系做了进一步的探究。通过IP检测UPL1与PRMT5(精氨酸N端甲基化转移酶5)、β-Tubulin、β-Actin的相互作用。利用激光共聚焦显微镜观察UPL1和MEP50WD(WDR77)的亚细胞定位。Western blot分别检测感染了复制缺陷型腺病毒Ad-UPL1的BEL-7404、Huh7细胞系中ERK、p-ERK、Akt、p38、p-p38、STAT、p-STAT、ISG15的表达量,以及自噬相关蛋白Beclin1、LC3-II的表达。EBSS饥饿处理诱导凋亡后,检测UPL1对癌细胞的存活率的影响。利用U0126(MEK抑制剂)、SB203580(p38抑制剂)、LY294002(PI3K抑制剂)分别处理癌细胞后,检测到UPL1可以导致癌细胞有更低的存活率。Western blot分析UPL1对β-Tubulin、Akt、PARP、caspase3蛋白有影响。UPL1在癌细胞中与MEK、p38、PI3K等信号通路存在关联。其在肿瘤治疗方面有广泛的应用前景。(本文来源于《浙江理工大学》期刊2016-12-26）
张磊[8]（2016）在《2型糖尿病大鼠模型的建立及携带adipsin基因重组腺病毒治疗2型糖尿病大鼠模型的初步研究》一文中研究指出2型糖尿病是由于胰岛素抵抗引起的葡萄糖代谢能力下降,并伴随着代偿性胰岛素分泌而引起的胰岛p细胞功能缺陷最终胰岛素分泌不足导致的疾病。研究表明脂肪细胞生成的细胞信号蛋白adipsin在刺激胰岛素分泌、降低胰岛素抵抗、控制血糖中具有重要的调控作用。为研究adipsin在2型糖尿病大鼠模型中的治疗作用,本研究通过重组腺病毒系统将adipsin基因传递至Zucker Diabetic Fatty (ZDF)大鼠与2型糖尿病SD大鼠体内,对2型糖尿病进行治疗,研究结果为进一步研究脂肪因子adipsin与代谢系统之间相互作用的分子机制提供了一定的实验基础。研究首先利用重组腺病毒表达系统PadEasy,构建pAdEasy-CMV-adipsin腺病毒质粒,在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-adipsin,通过PCR和免疫印迹(Western Blot)检测adipsin蛋白在HEK293细胞中获得了表达。其次,通过高脂高糖喂养并结合STZ成功诱导出具有高血糖、高血脂、胰岛素抵抗的2型糖尿病SD大鼠模型。在测定重组腺病病毒滴度后,通过尾静脉注射Ad-adipsin治疗2型糖尿病大鼠模型。结果显示,治疗后的2型糖尿病模型大鼠的空腹血糖值(FPG)、空腹胰岛素值(FINS)、血清总胆固醇(TC)、甘油叁脂(TG)等与注射重组腺病毒Ad-lacZ对照组2型糖尿病模型大鼠相比有显着下降(P<0.05),并且胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显着降低(P<0.05),其中治疗后的2型糖尿病SD大鼠血糖可以控制在较低水平长达6周。治疗结果显示重组腺病毒Ad-adipsin可以有效的改善2型糖尿病模型大鼠的糖尿病状况。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2016-05-01）
周少怀,杜谢琴,金静,卞峰,方红育[9]（2016）在《携带重组腺病毒BMP-2的巨噬细胞对C3H10细胞成骨分化的影响》一文中研究指出目的 :探讨携带BMP-2(Bone Morphogenetic protine-2)腺病毒的巨噬细胞对小鼠C3H10细胞的增殖和成骨分化的作用。方法 :感染重组腺病毒BMP-2的巨噬细胞与小鼠C3H10细胞共培养。MTT方法检测共培养体系中C3H10细胞的增殖能力;共培养7 d对C3H10细胞进行ALP染色和活性检测;细胞培养至21 d,进行标茜素红染色检测矿化结节;定量PCR实验验证过表达腺病毒载体BMP-2有效性并且检测Runx2的表达;Western blot检测细胞中磷酸化Smad1/5/8蛋白表达。结果 :与对照组相比,巨细胞过表达BMP-2与C3H10细胞共培养后,可以促进C3H10细胞增殖;ALP染色程度和活性上升;矿化结节增多;定量PCR结果显示Ruxn2 RNA表达增加,Western blot结果显示Ruxn2蛋白表达上升。结论 :过表达BMP-2的巨噬细胞可以促进小鼠C3H10细胞的增殖,并且可能通过BMPs经典途径促进C3H10细胞的成骨分化。(本文来源于《湖南师范大学学报(医学版)》期刊2016年02期）
李慧,胡琼英,贾永前[10]（2015）在《构建携带人/鼠IFN-γ重组腺病毒体外转染人脐带间充质干细胞的实验研究》一文中研究指出目的构建人/鼠干扰素(IFN-γ)的重组腺病毒,体外转染人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs),为研究IFN-γ在预防和治疗移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)中的作用提供实验依据。方法采用PCR法从含有人/鼠IFN-γ基因的质粒中扩增出目的基因片段IFN-γ,然后定向克隆到穿梭质粒载体pDC316中,构建pDC316-IFN-γ,经酶切、PCR及测序鉴定后,再将IFN-γ定向克隆至腺病毒骨架载体,从而构建携带IFN-γ的重组腺病毒载体,并转染人胚肾细胞系293细胞,进行重组腺病毒(Ad-IFN-γ)的包装、生产和纯化;用半数组织培养感染量(50%tissue culture infective dose,TCID50)法检测重组腺病毒滴度。将Ad-IFN-γ及空病毒(Ad-null,作为载体阴性对照)分别转染HUMSCs,在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达,采用Western blot与ELISA法鉴定IFN-γ蛋白的表达。结果成功构建了携带IFN-γ的重组腺病毒,鼠IFN-γ(Ad-mIFN-γ)的滴度为1.0×1010 IU/mL,人IFN-γ(Ad-hIFN-γ)的滴度为1.6×1010 IU/mL,Ad-GFP的滴度为1.0×109 IU/mL。Ad-IFN-γ转染HUMSCs后24h开始观察到绿色荧光,72h时该荧光表达更强;Western blot和ELISA法均证实HUMSCs表达IFN-γ蛋白。结论成功构建了携带人/鼠IFN-γ基因的重组腺病毒载体,并证实其可有效转染HUMSCs。(本文来源于《四川大学学报(医学版)》期刊2015年06期）
重组腺病毒携带论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究背景:乳腺癌作为世界上常见恶性肿瘤其发病率呈逐年上升[1]。手术是乳腺癌最常见的治疗方法,其次为术后辅助化疗。然而手术创伤大,化疗副作用多,部分癌细胞还具有显着耐药性[2,3]。因此,开发毒性低、副作用少的新型抗肿瘤药物尤为重要。肿瘤的发生与发展不仅体现为细胞增殖失控、分化异常,也与肿瘤细胞凋亡失衡密切相关。伴随分子生物学的不断发展进步,科学家发现凋亡并非是决定细胞死亡的唯一命运。近年,细胞自噬被证实与凋亡共同调控细胞死亡,不同情况下,自噬可能抑制或是促进凋亡。Apoptin是一种具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡作用的新型抗肿瘤生物蛋白。虽然其诱导某些肿瘤细胞凋亡得以肯定,但对其具体机制仍不明确,并且与凋亡密切的相关的另一种死亡形式——自噬,是否也与apoptin相关至今未有人提出。本实验旨在发现apoptin对肿瘤细胞MCF-7的抗肿瘤作用及其发生的相应分子机制。研究目的:利用本课题组已构建的人5型腺病毒为载体叁种重组腺病毒Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK,研究表达apoptin蛋白的重组病毒Ad-VT和Ad-VP3对肿瘤细胞MCF-7的杀伤作用参与方式,是否为自噬或凋亡,是否为是二者均有,它们之间是否又存在联系及可能参与的信号通路,为apoptin的进一步研究和开发提供理论依据。研究方法:MTS细胞活性检测,分析叁种重组腺病毒Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对肿瘤细胞MCF-7和人乳腺上皮细胞MCF-10A的杀伤抑制作用。利用自噬抑制剂3-MA的Annexin V-FITC/PI.流式实验,qPCR和Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62和Beclin-1的定量定性实验,鉴定自噬的多种染色实验(MDC、IFA、p EGFP-LC3)及透射电镜实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞的自噬作用。通过细胞周期检测、AnnexinV-FITC/PI检测、Hoechst染色、JC-1染色、透射电镜等实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞的凋亡作用。通过伤口愈合实验和BioCoat小室侵袭实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞迁移和侵袭能力的影响。通过蛋白质组学实验分析携带apoptin的重组腺病毒Ad-VT和Ad-VP3作用MCF-7细胞后,产生的差异蛋白的功能和可能参与的信号通路。检测已构建含萤火虫荧光素酶的MCF-7细胞通过荧光素酶活性、稳定性,体外成像筛选出最稳定表达荧光素酶的MCF-7-luc。进行MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的生长特性、侵袭能力和细胞周期等生物学特性的比对检测。通过细胞抑制率MTS实验、细胞膜AnnexinV-FITC/PI流式实验、细胞核Hoechst染色实验验证Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的作用效果。建立小鼠皮下荷瘤模型后,通过活体成像实验、游标卡尺测量肿瘤体积及生存期观察,研究Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对肿瘤的抑制效果和小鼠生存期的影响。研究结果:1.体外MTS实验发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3对人乳腺癌MCF-7细胞具有杀伤作用,对人乳腺上皮细胞MCF-10A无显着杀伤作用。Ad-MOCK对MCF-7细胞和MCF-10A无杀伤作用。2.流式细胞术、Western Blot、qPCR、MDC染色、IFA和透射电镜实验提示携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3在细胞作用早期(6h和12h)促进肿瘤细胞MCF-7自噬增强。3.通过细胞周期检测、AnnexinV-FITC/PI检测、Hoechst染色、JC-1染色、透射电镜实验,发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3促进人乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡。4.通过伤口愈合实验和BioCoat小室侵袭实验,发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3能够抑制MCF-7细胞的迁移和侵袭能力。5.蛋白质组学实验对差异蛋白进行GO和KEGG分析提示:携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3作用能够促发人乳腺癌细胞MCF-7的自噬和凋亡。FOXO1和FOX03a蛋白参与apoptin引起细胞死亡的机制,特别是AMPK信号通路。6.选择活性最高、稳定性最好且与发光强度呈正相关的线性关系(R2=0.9903)的Clone 15株进行实验;通过MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞生物学特性鉴定,证明了构建过程对细胞的生长特性、侵袭能力和细胞周期未产生显着的影响。体外MTS实验、AnnexinV-FITC/PI流式实验和Hoechst染色实验证实重组腺病毒对MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的作用效果无显着差别,可使用MCF-7-luc细胞进行小鼠荷瘤实验。7.体内实验裸鼠活体成像提示:携带apoptin的Ad-VP3和Ad-VT治疗组与对照组相比肿瘤平均生物发光强度较低,肿瘤体积变小,荷瘤小鼠的生存期延长。研究结论:携带apoptin的重组腺病毒可显着抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长,而对人乳腺正常上皮细胞MCF-10A无抑制作用。携带apoptin的重组腺病毒主要以细胞凋亡方式引起MCF-7细胞的死亡,同时会对细胞自噬产生显着的影响,在作用的早期,自噬对癌细胞起到保护性作用,而在凋亡水平逐渐占据主导时,凋亡作用已经超过自噬所起到的保护作用的阈值,自噬开始逐渐降低,而后至48h左右自噬再一次升高和凋亡共同作用促进MCF-7细胞死亡。FOXO1蛋白和FOX03a蛋白参与了 apoptin引发的MCF-7细胞的自噬和凋亡,特别是与FOXO蛋白相关的AMPK信号通路,因此本研究认为AMPK可能将细胞自噬和细胞凋亡联系起来作为apoptin引起肿瘤细胞死亡的调控通路。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
重组腺病毒携带论文参考文献
[1].胡云,方先龙,顾锦法,杨圆圆,李慧.携带mK5基因的重组腺病毒联合多西他赛对LNCaP细胞的体外抗癌作用探究[J].中国细胞生物学学报.2019
[2].陈爽.携带apoptin的重组腺病毒对人乳腺癌细胞MCF-7的抗肿瘤作用及蛋白质组学相关研究[D].延边大学.2019
[3].张本斯,李庄,卞思源,杨桂,李艳娇.携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体的构建和包装[J].解剖学杂志.2018
[4].艾迪,李文杰,李一权,陈爽,朱羿龙.携带Apoptin及hTERT启动子的双重特异性重组腺病毒的构建及鉴定[J].中国兽医学报.2018
[5].邓守恒,胡茵,曹风军,蔡晓军,李林均.携带凋亡素VP3基因重组腺病毒的制备及其在人结肠癌SW480细胞中的表达[J].中国老年学杂志.2017
[6].吴冰冰.携带凝集素基因的重组腺病毒和痘苗病毒对肝癌细胞的作用机制研究[D].浙江理工大学.2017
[7].赵珍珍.携带CTTNBP2NL基因的重组腺病毒的抗癌研究[D].浙江理工大学.2016
[8].张磊.2型糖尿病大鼠模型的建立及携带adipsin基因重组腺病毒治疗2型糖尿病大鼠模型的初步研究[D].北京协和医学院.2016
[9].周少怀,杜谢琴,金静,卞峰,方红育.携带重组腺病毒BMP-2的巨噬细胞对C3H10细胞成骨分化的影响[J].湖南师范大学学报(医学版).2016
[10].李慧,胡琼英,贾永前.构建携带人/鼠IFN-γ重组腺病毒体外转染人脐带间充质干细胞的实验研究[J].四川大学学报(医学版).2015
标签：多西他赛; Onco~(Ad)-mK5; 前列腺癌; VEGF;