（1.新疆医科大学第一附属医院肾病科新疆乌鲁木齐830011；2.第六师奇台医院药剂科.新疆乌鲁木齐830011；3.新疆工程学院新疆乌鲁木齐830011）
课题项目：新疆布鲁氏菌病传播机理的动力学模型和疾病预防控制研究；基金号：XJEDU2013S44
摘要：目的：建立HPLC法测定虫草中的腺苷和腺嘌呤的方法。方法:采用高效液相法，KromasilC18色谱柱(4.6x150mm,5µm)，流动相为1%乙酸甲醇-乙腈(V/V)，流速0.9ml.min-1,检测波长为2600nm。结果:腺嘌呤在0.59-1.18mg/mL（r=0.9998）范围内峰面积与浓度呈良好线性关系，平均加样回收率为97.5%，RSD=2.32%（n=6），腺苷在1.47-2.94mg/mL（r=0.9998）范围内峰面积与浓度呈良好线性关系,平均加样回收率为96.5%，RSD=1.37%（n=6）,结论:该方法操作简便、灵敏度高、重现性好、专属性强，适用于人工虫草腺苷及腺嘌呤含量的测定。为人工虫草在临床医学应用及新药开发提供了基础研究数据。
关键词:高效液相色谱法；虫草；腺苷；腺嘌呤；含量
[中图分类号]R-33[文献标识码]A文章编号：
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordycepssinensis(Berk)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体[1],为我国传统名贵中药材,主产于西藏、青海的高寒草甸。近年来,由于对野生冬虫夏草的过度采挖,导致虫草资源逐渐枯竭,人工虫草的培育研究应运而生。人工北虫草又称北冬虫夏草、蛹虫草(Cordycepsmilitaris),是从天然北虫草分离得到的菌种拟青霉(Paecilomycesmilitaris)经人工培养所获得的子实体,与冬虫夏草同属异种。据报道人工发酵的菌丝体产物，其化学成分与天然虫草基本相似[2]。中国药典2005年版把腺苷作为冬虫夏草的定量指标[3].已有一些文献报道使用HPLC方法测定虫草中核苷类成分[4-6]。为了考察人工虫草菌粉的质量，本实验应用HPLC，在相同色谱条件下测定人工虫草菌粉中腺苷和腺嘌呤的含量。
1.仪器与试剂
1.1仪器
LC-6A高效液相色谱仪；SPD-20A型紫外检测器；CBM-20A色谱工作站(日本岛津公司)。XS105型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多）；AL204型万分之一电子天平（梅特勒-托利多）；KQ-200KDE型高功率数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Direct-Q3超纯水仪(美国密理博公司)；DZF_6021型真空干燥箱(上海精密试验设备有限公司)；智能恒温电热套（郑州长城科工贸有限公司）。
1.2试剂与样品
腺苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号:100080—200707）；乙腈（色谱纯,飞世尔实验器材有限公司)；实验用水均为超纯水,人工虫草发酵菌粉(由江西济民可信金水宝制药有限公司提供)
2.方法与结果
2.1色谱条件
检测波长260nm，流速：0.9ml.min-1.色谱柱:KromasilC18:(4.6×150mm,5µm)；流动相:A=磷酸缓冲液,B=乙腈；梯度洗脱程序为：0-4min,流动相流动相A从93%线性减至87%，4-6min，流动相A为87%。
图1虫草色谱图图2腺苷腺嘌呤对照品色谱图
2.2对照品制备
精密称取腺苷准品8.3mg，以甲醇定容于10mL容量瓶中，配成浓度为0.83mg/mL的对照品溶液，精密称取腺嘌呤4.0mg,以甲醇定容于10mL容量瓶中,配成浓度为0.4mg/mL的对照品溶液，过0.45μm微孔滤膜。取腺嘌呤80L,腺苷200L，加入甲醇400L混合均匀。
2.3样品溶液制备
精密称取虫草粉末3.0000g于锥形瓶中，加入甲醇30mL，超声处理（功率150W，频率60HZ）40min，过滤后残渣加入甲醇30ml，相同条件超声40min，合并两次滤液浓缩至25mL，过0.45μm微孔滤膜，备用。
2.4标准曲线绘制
吸取标准品溶液5.0，6.0，7.0,8.0,9.0,10.0µl进样，按上述色谱条件测定峰面积，以浓度x为横坐标,峰面积y为纵坐标,进行线性回归。
腺苷回归方程为：
Y=781665X-142345.95，r=0.9998。
腺嘌呤回归方程为：
Y=894628X-68574.86，r=0.9998.
2.5精密度试验
精密吸取对照品溶液7μL，按上述色谱条件测定，连续进样6次。测定腺苷和腺嘌呤峰面积积分值，RSD为1.36%。实验结果表明，该方法精密度良好。
2.6稳定性试验
精密吸取样品溶液，分别在0、2、4、8、24h进样，测定腺苷和腺嘌呤峰面积积分值，RSD值为1.85%。实验结果表明，供试品溶液在24小时内稳定。
2.7重复性试验
精密称定虫草6份，按2.3方法操作，按上述色谱条件测定腺嘌呤为0.973mg/g,腺苷为2.995mg/g,RSD腺嘌呤为1.96%，腺苷为2.15%。实验结果表明，该方法测定腺苷和腺嘌呤含量准确可靠。
3.讨论
人工培养的冬虫夏草菌丝是从天然冬虫夏草中分离出的虫草真菌，经培养、发酵而得到的菌丝体[7]。人工虫草菌丝经大量的研究证明：在化学、药理、临床方面与天然虫草十分相似，且毒性比天然虫草[8,9]小.具有补肺益肾、止血化痰抗肿瘤、提高机体免疫力等功效。且虫草中含有甘露醇、腺苷、腺嘌呤、尿苷、鸟苷、尿嘧啶、麦角甾醇、氨基酸、虫草素及微量元素、矿物质元素等成分,含有强抗氧化活性,对肾组织损伤也有一定的保护作用,且虫草粉剂(金水宝胶囊)已被证实并应用于临床。
腺苷和腺嘌呤是冬虫夏草中主要有效成分之一,具有广泛的生理活性。且腺苷为药典规定的冬虫夏草定量指标。
本研究采用超声提取方法，此方法比回流方法提取筒便，可免除回流前后称重，有效组分不易丢失，各实验指标均符合色谱试验要求，效果较为理想。
本文通过高效液相色谱法对虫草中腺苷和嘌呤的含量进行测定,结果表明该方法测定腺苷、腺嘌呤含量准确，方法简单，重复性好。本次检测的产品人工虫草菌粉符合药典规定。
参考文献
[1]施仁潮.冬虫夏草[M].浙江;科学技术出版社,2003.
[2]中国医学科学院药物研究所编著.中草药现代研究[J].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1995年.99～102．
[3]卫生部国家药典委员会编.中华人民共和国药典2005年版,一部[M]．北京:化学工业出版社,2015:75．
[4]米莉莉,王智华,洪筱坤.冬虫夏草和人工菌丝体的核苷类成分的HPLC研究[J].中草药,2003,34(6):573-574.
[5]彭日煌,谢明勇,王远兴.RP-HPLC测定虫草菌粉中核苷类成分[J].食品与机械,2005,21(1):61-63.
[6].李绍平,张平,夏泉,黄赵刚,朱荃.天然和人工冬虫夏草多糖组分的HPLC分析[J].药物分析杂志,2003,23(1):20-23.
[7]吴源文,朱有华.中药在器官保存中的应用[J].中国中西医结合杂志,2004,24(4):373-375.
[8]宫壮,张晓良,刘必成.冬虫夏草研究现状及治疗进展[J].东南大学学报，2008，27(2):140-144.
[9]赵辉.冬虫夏草的抗氧化活性[M]．国外医学·中医中药分册,2001,23(5):270-271.
收稿日期：2015-10-13