导读:本文包含了减毒猪霍乱沙门氏菌论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:PRRSV,ORF5,重组减毒沙门氏菌,生物学特性,免疫学特性
减毒猪霍乱沙门氏菌论文文献综述
张淼丹[1]（2014）在《重组PRRSV ORF5基因减毒猪霍乱沙门氏菌C78-1生物学及免疫学特性初步研究》一文中研究指出猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)引起的以妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪严重的呼吸道症状及高死亡率为特征的传染病，并已成为危害全球养猪业最严重的传染病之一。沙门氏菌作为一种细胞内侵袭性寄生菌，能有效的呈递外源抗原，能同时激发机体产生抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫应答。本研究以携带PRRSV ORF5基因的重组减毒猪霍乱沙门氏菌为研究对象，检测了其生物学特性和免疫学特性，为PRRS新型基因工程疫苗的研究和减毒猪霍乱沙门氏菌携带和表达外源基因的可行性提供了新的思路。（1）实现了PRRSV ORF5的原核表达将PRRSV ORF5基因的N端的31个氨基酸的信号肽编码序列截去，构建了原核表达载体pET28a-dORF5并实现了高效表达，经SDS-PAGE和Western-blot检测表明，表达的PRRSV GP5重组蛋白具有良好的反应原性。进而将表达的GP5蛋白经镍柱纯化并复性后，得到了纯化和复性的GP5蛋白，为进一步研究GP5蛋白的生物学功能奠定了良好的基础。（2）重组PRRSV ORF5减毒猪霍乱沙门氏菌的生物学特性研究对重组菌的表型性状、生长特性、稳定性以及安全性等生物学特性进行检测，并对其表达的GP5蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示，该重组菌株恢复了在DAP阴性环境中生存的能力；同时不能利用麦芽糖、果糖及蔗糖等碳源，但仍能够利用葡萄糖，其生长速度明显低于强毒株C78-1，而与crp asdC78-1相比没有明显变化；在体外连续传代培养能够稳定遗传578bp dORF5基因片段。Western-blot分析证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合；通过口服感染的途径，测得亲本株C78-1的毒力是重组菌crp asdC78-1(pYA-dORF5)的492倍，而疫苗株C500的毒力是重组菌的1.31倍。（3）重组PRRSV ORF5减毒猪霍乱沙门氏菌免疫学特性初步研究将重组菌接种小鼠，对其在小鼠体内的分布情况进行了检测。同时，分别应用ELISA方法检测小鼠不同时期血清中抗PRRS GP5抗体、沙门氏菌抗体和肠液中SIgA抗体的产生情况以及MTT法检测淋巴细胞分化情况，以了解重组菌的免疫学特性。结果显示，重组菌能够在小鼠体内稳定存活，具有良好的侵袭力。血清抗体IgG检测结果显示，在二次免疫后第1周，抗GP5抗体达到高峰，OD值达到0.788，此时空白菌对照组和PBS对照组的OD值仅为0.022和0.0218；而对于沙门氏菌IgG抗体来说，重组菌株与疫苗株C500的免疫力相当。二免后4周小鼠肠粘膜液中分泌性SIgA抗体的量显着高于两个对照组，分别为10.58、0.55和2.73；淋巴细胞转化实验表明该重组能够刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答反应，说明该重组菌能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种免疫应答方式。(本文来源于《河南科技大学》期刊2014-05-30）
吉贞颖[2]（2014）在《基因调控延迟减毒和提高异源抗原表达的猪霍乱沙门氏菌载体的构建》一文中研究指出沙门氏菌作为一种侵袭性胞内菌,其减毒后具有良好的侵袭能力,在体内生长缓慢,能够有效地持续刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫以及局部粘膜免疫。但是经过改造过的病原菌,要么过度减毒,损伤了免疫原性；而当保留了较好的免疫原性,细菌却不够减毒,引起宿主的各种临床症状。本文以野生型猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3为载体,利用细菌分子生物学技术,对猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3染色体进行基因改造,使猪霍乱沙门氏菌突变株在甘露糖和阿拉伯糖的调控下,其毒力逐渐减弱的同时,所携带的外源抗原的表达得以不断提高,最终使减毒株在入侵宿主机体时能够具有野生型猪霍乱沙门氏菌那样的入侵能力,侵入宿主后由于毒力基因的失表达而毒力减弱,以保障疫苗候选株的安全性,然而其质粒所携带的外源抗原的表达能够不断提高。本研究在C78-3中共引入△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lad TT和△asdA四个突变,该减毒株被命名为x0011；将猪链球菌2型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(简写为6-PGD)克隆插入原核表达载体pAY3493中,形成疫苗候选株χ0011(pYA6-PGD);最后对χ0011(pYA6-PGD)的生物学特性进行了分析。1.减毒猪霍乱沙门氏菌x0011的构建本部分在猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3上分别引入由甘露糖调控的△manA突变和由阿拉伯糖调控的△Pcrp::TT araC PBAD crp和△relA::araC PBAD lacI TT突变。△manA突变使突变菌的manA基因在没有甘露糖时不能表达,导致突变菌不能合成细菌LPS O-抗原的侧链而减毒；△Pcrp::TT araC PBAD crp是在没有阿拉伯糖时,突变菌的crp基因不能表达,导致突变菌不能合成crp蛋白而减毒；△relA::araC PBAD lacI TT突变是由阿拉伯糖控制lacI基因的表达,从而使外源基因在没有阿拉伯糖的动物机体内可以高效表达；引入的AasdA突变使减毒株(asdA-)与蛋白表达载体pAY3493(asdA+)形成平衡致死系统,使得只有携带外源抗原质粒的疫苗候选株才能稳定地在动物机体内复制。依据无抗性标记缺失基因的自杀载体方法,首先分别构建含缺失基因△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lad TT和AasdA结构的自杀载体；即在GenBank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列,找到在猪霍乱沙门氏菌上拟缺失基因或启动子的上下游序列,在上下游基因中设计引物,以上下游基因的300bp左右为同源臂,删除拟缺失基因或启动子序列,以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板,经PCR等分子生物学技术,获得删除基因或启动子序列后与C78-3有500-600碱基的同源臂序列,将此同源臂序列连接至自杀载体质粒pRE112(pRE118)上,通过酶切鉴定和序列测定,将正确缺失基因或启动子序列的pRE112载体转化至工程菌大肠杆菌x7213中,获得自杀载体x7213(pYAs001)(△Pcrp::TT araC PBAD crp),χ7213(pYAs002)(△manA), χ7213(pYAs003)(△relA::araC PBAD lacITT)和χ7213(pYAs004)(△asdA).然后以猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3为受体菌,含自杀性质粒的x7213为供体菌,运用自杀载体介导的同源重组技术,在C78-3上分别引入△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lad TT和△asdA,最后获得χ0011(△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lacI TT和△asdA)减毒株。2.减毒猪霍乱沙门氏菌载体x0011生物学特性的研究本论文的目的是用基因调控的方法,使减毒载体在入侵宿主机体时能够具有野生型猪霍乱沙门氏菌那样的侵袭能力,侵入宿主后使毒力基因失表达而减毒,以保障疫苗候选株的安全性。为验证本研究中x0011减毒株是否达到论文设计的目的,首先将猪链球菌Ⅱ型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(6-PGD)克隆插入原核表达载体pAY3493中,形成表达6-PGD蛋白的原核表达质粒pYA6-PGD,再将pYA6-PGD转化至减毒株x0011中,成为致死/平衡系统的χ0011(pYA6-PGD)(见第叁章)。经过测定χ0011(pYA6-PGD)减毒株在Balb/C小鼠中的LD50和定居能力、在猪肺巨噬细胞和猪外周血单核细胞中的存活能力,发现x0011(pYA6-PGD)的毒力比亲本强毒株C78-3明显减弱(减弱106倍),而与疫苗弱毒株C500相似；定居实验表明χ0011(pYA6-PGD)在小肠的派伊尔氏淋巴结定居能力较强,在肝脏和脾脏的定居能力弱于强毒株；尤其是(pYA6-PGD)在猪肺巨噬细胞和猪外周血单核细胞中的存活能力体现了逐渐减毒的特性,即在入侵猪肺巨噬细胞和猪外周血单核细胞后24h, χ0011(pYA6-PGD)的入侵能力与野毒株C78-3相当,而疫苗弱毒株C500己明显弱于减毒株χ0011(pYA6-PGD)(p<0.01)：在入侵猪肺巨噬细胞和和猪外周血单核细胞48h和72h,x0011(pYA6-PGD)入侵的能力明显弱于野毒株C78-3(p<0.01),但是却明显强于疫苗弱毒株C500(p<0.01)。3.携带猪链球菌6-PGD蛋白减毒沙门氏菌载体构建6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-PGD)在多种细菌中具有较高的保守性,据报道猪链球菌6-PGD蛋白具有较好的免疫原性。本研究参照已经报道的猪链球菌2型的6-PGD基因序列(GI：8151617),设计引物扩增出6-PGD基因(1428bp),连接至原核表达载体pET28a上,转化至大肠杆菌BL21,将表达和纯化的6-PGD蛋白免疫新西兰大白兔,获得针对6-PGD蛋白的多抗血清：然后将6-PGD基因插入原核表达载体pYA3493,电转化入x0011减毒沙门氏菌载体,命名为x0011(pYA6-PGD), Western-Blot检测表明减毒株χ0011(pYA6-PGD)可以高效表达6-PGD蛋白：质粒pYA6-PGD在x0011中可以稳定传代表达60代；将减毒株x0011(pYA6-PGD)免疫6周龄的Balb/c小鼠可以诱导很高的针对6-PGD蛋白IgG抗体；以14×LDso的猪链球菌2型剂量腹腔攻毒经2次免疫的Balb/c、鼠,发现χ0011(pYA6-PGD)仅能延长小鼠的存活时间,没有得到预期的保护效果。以上实验结果表明,本研究构建的χ0011(△Pcrp::TT araC PBAD crp, AmanA,△relA::araC PBAD lacI TT和AasdA)减毒株获得了在入侵宿主机体时具有像野生型猪霍乱沙门氏菌C78-3一样强的入侵能力,侵入宿主后由于毒力基因的失表达其毒力明显减弱,具备了疫苗候选株安全性的特性：携带猪链球菌2型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-PGD)外源抗原的x0011免疫Balb/c小鼠可诱导较高的对6-PGD蛋白的IgG抗体。(本文来源于《扬州大学》期刊2014-05-01）
惠锋明,茆达干,蒋进[3]（2011）在《DNA疫苗的运送载体——减毒霍乱沙门氏菌》一文中研究指出霍乱沙门氏菌是人兽共患病原菌,遗传背景清楚,利用它作为载体表达外源抗原基因已得到较广泛的研究并取得了一定的效果。本文从沙门氏菌的侵入途径、减毒重组菌对基因疫苗的呈递及诱发免疫应答的机制、作为载体的优势以及免疫存在的问题等方面就减毒霍乱沙门氏菌作为运送DNA疫苗的载体作简要概述。(本文来源于《免疫学杂志》期刊2011年08期）
甄艳红,韩丽,梁爱心,王庆玲,杨利国[4]（2009）在《含抑制素重组质粒的减毒猪霍乱沙门氏菌C500遗传稳定性研究》一文中研究指出为了分析研究含抑制素重组质粒pVAX-IS-asd(以下简写为pXAIS)的crp(cAMP受体蛋白)和asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株的遗传稳定性。方法:将现有的无抗性抑制素重组表达质粒pXAIS转化入crp和asd基因双缺失猪霍乱沙门氏菌C500菌株(简称"空质粒株")中,得"含质粒株"。将"含质粒株"细菌在无选择压力条件下传代培养50代,利用酶切鉴定方法,分析"含质粒株"细菌中抑制素pXAIS质粒的稳定性;利用PCR方法扩增菌株("含质粒株"和"空质粒株")保守序列中invA基因,分析各代细菌的invA基因稳定性;通过比较传代培养后各代细菌的生长图型,分析"含质粒株"细菌传代后的生长规律。结果表明,"含质粒株"细菌连续传代50次后,仍能检出pXAIS质粒和invA基因,而且生长规律与"空质粒株"没有明显差异。说明含pXAIS质粒的猪霍乱沙门氏菌crp和asd基因双缺失株具有良好的遗传稳定性。(本文来源于《生物技术通报》期刊2009年S1期）
徐引弟,郭爱珍,陈焕春[5]（2007）在《减毒猪霍乱沙门氏菌作为疫苗及载体的研究进展》一文中研究指出猪霍乱沙门氏菌是引起仔猪副伤寒的主要病原之一,同时也是食物中毒的重要病原,因此在养殖业和公共卫生上均有重要意义。本文就其疫苗及疫苗作为载体的研究进展作一综述。(本文来源于《国外畜牧学(猪与禽)》期刊2007年06期）
减毒猪霍乱沙门氏菌论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
沙门氏菌作为一种侵袭性胞内菌,其减毒后具有良好的侵袭能力,在体内生长缓慢,能够有效地持续刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫以及局部粘膜免疫。但是经过改造过的病原菌,要么过度减毒,损伤了免疫原性；而当保留了较好的免疫原性,细菌却不够减毒,引起宿主的各种临床症状。本文以野生型猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3为载体,利用细菌分子生物学技术,对猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3染色体进行基因改造,使猪霍乱沙门氏菌突变株在甘露糖和阿拉伯糖的调控下,其毒力逐渐减弱的同时,所携带的外源抗原的表达得以不断提高,最终使减毒株在入侵宿主机体时能够具有野生型猪霍乱沙门氏菌那样的入侵能力,侵入宿主后由于毒力基因的失表达而毒力减弱,以保障疫苗候选株的安全性,然而其质粒所携带的外源抗原的表达能够不断提高。本研究在C78-3中共引入△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lad TT和△asdA四个突变,该减毒株被命名为x0011；将猪链球菌2型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(简写为6-PGD)克隆插入原核表达载体pAY3493中,形成疫苗候选株χ0011(pYA6-PGD);最后对χ0011(pYA6-PGD)的生物学特性进行了分析。1.减毒猪霍乱沙门氏菌x0011的构建本部分在猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3上分别引入由甘露糖调控的△manA突变和由阿拉伯糖调控的△Pcrp::TT araC PBAD crp和△relA::araC PBAD lacI TT突变。△manA突变使突变菌的manA基因在没有甘露糖时不能表达,导致突变菌不能合成细菌LPS O-抗原的侧链而减毒；△Pcrp::TT araC PBAD crp是在没有阿拉伯糖时,突变菌的crp基因不能表达,导致突变菌不能合成crp蛋白而减毒；△relA::araC PBAD lacI TT突变是由阿拉伯糖控制lacI基因的表达,从而使外源基因在没有阿拉伯糖的动物机体内可以高效表达；引入的AasdA突变使减毒株(asdA-)与蛋白表达载体pAY3493(asdA+)形成平衡致死系统,使得只有携带外源抗原质粒的疫苗候选株才能稳定地在动物机体内复制。依据无抗性标记缺失基因的自杀载体方法,首先分别构建含缺失基因△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lad TT和AasdA结构的自杀载体；即在GenBank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列,找到在猪霍乱沙门氏菌上拟缺失基因或启动子的上下游序列,在上下游基因中设计引物,以上下游基因的300bp左右为同源臂,删除拟缺失基因或启动子序列,以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板,经PCR等分子生物学技术,获得删除基因或启动子序列后与C78-3有500-600碱基的同源臂序列,将此同源臂序列连接至自杀载体质粒pRE112(pRE118)上,通过酶切鉴定和序列测定,将正确缺失基因或启动子序列的pRE112载体转化至工程菌大肠杆菌x7213中,获得自杀载体x7213(pYAs001)(△Pcrp::TT araC PBAD crp),χ7213(pYAs002)(△manA), χ7213(pYAs003)(△relA::araC PBAD lacITT)和χ7213(pYAs004)(△asdA).然后以猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-3为受体菌,含自杀性质粒的x7213为供体菌,运用自杀载体介导的同源重组技术,在C78-3上分别引入△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lad TT和△asdA,最后获得χ0011(△Pcrp::TT araC PBAD crp,△manA,△relA::araC PBAD lacI TT和△asdA)减毒株。2.减毒猪霍乱沙门氏菌载体x0011生物学特性的研究本论文的目的是用基因调控的方法,使减毒载体在入侵宿主机体时能够具有野生型猪霍乱沙门氏菌那样的侵袭能力,侵入宿主后使毒力基因失表达而减毒,以保障疫苗候选株的安全性。为验证本研究中x0011减毒株是否达到论文设计的目的,首先将猪链球菌Ⅱ型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(6-PGD)克隆插入原核表达载体pAY3493中,形成表达6-PGD蛋白的原核表达质粒pYA6-PGD,再将pYA6-PGD转化至减毒株x0011中,成为致死/平衡系统的χ0011(pYA6-PGD)(见第叁章)。经过测定χ0011(pYA6-PGD)减毒株在Balb/C小鼠中的LD50和定居能力、在猪肺巨噬细胞和猪外周血单核细胞中的存活能力,发现x0011(pYA6-PGD)的毒力比亲本强毒株C78-3明显减弱(减弱106倍),而与疫苗弱毒株C500相似；定居实验表明χ0011(pYA6-PGD)在小肠的派伊尔氏淋巴结定居能力较强,在肝脏和脾脏的定居能力弱于强毒株；尤其是(pYA6-PGD)在猪肺巨噬细胞和猪外周血单核细胞中的存活能力体现了逐渐减毒的特性,即在入侵猪肺巨噬细胞和猪外周血单核细胞后24h, χ0011(pYA6-PGD)的入侵能力与野毒株C78-3相当,而疫苗弱毒株C500己明显弱于减毒株χ0011(pYA6-PGD)(p<0.01)：在入侵猪肺巨噬细胞和和猪外周血单核细胞48h和72h,x0011(pYA6-PGD)入侵的能力明显弱于野毒株C78-3(p<0.01),但是却明显强于疫苗弱毒株C500(p<0.01)。3.携带猪链球菌6-PGD蛋白减毒沙门氏菌载体构建6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-PGD)在多种细菌中具有较高的保守性,据报道猪链球菌6-PGD蛋白具有较好的免疫原性。本研究参照已经报道的猪链球菌2型的6-PGD基因序列(GI：8151617),设计引物扩增出6-PGD基因(1428bp),连接至原核表达载体pET28a上,转化至大肠杆菌BL21,将表达和纯化的6-PGD蛋白免疫新西兰大白兔,获得针对6-PGD蛋白的多抗血清：然后将6-PGD基因插入原核表达载体pYA3493,电转化入x0011减毒沙门氏菌载体,命名为x0011(pYA6-PGD), Western-Blot检测表明减毒株χ0011(pYA6-PGD)可以高效表达6-PGD蛋白：质粒pYA6-PGD在x0011中可以稳定传代表达60代；将减毒株x0011(pYA6-PGD)免疫6周龄的Balb/c小鼠可以诱导很高的针对6-PGD蛋白IgG抗体；以14×LDso的猪链球菌2型剂量腹腔攻毒经2次免疫的Balb/c、鼠,发现χ0011(pYA6-PGD)仅能延长小鼠的存活时间,没有得到预期的保护效果。以上实验结果表明,本研究构建的χ0011(△Pcrp::TT araC PBAD crp, AmanA,△relA::araC PBAD lacI TT和AasdA)减毒株获得了在入侵宿主机体时具有像野生型猪霍乱沙门氏菌C78-3一样强的入侵能力,侵入宿主后由于毒力基因的失表达其毒力明显减弱,具备了疫苗候选株安全性的特性：携带猪链球菌2型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-PGD)外源抗原的x0011免疫Balb/c小鼠可诱导较高的对6-PGD蛋白的IgG抗体。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
减毒猪霍乱沙门氏菌论文参考文献
[1].张淼丹.重组PRRSVORF5基因减毒猪霍乱沙门氏菌C78-1生物学及免疫学特性初步研究[D].河南科技大学.2014
[2].吉贞颖.基因调控延迟减毒和提高异源抗原表达的猪霍乱沙门氏菌载体的构建[D].扬州大学.2014
[3].惠锋明,茆达干,蒋进.DNA疫苗的运送载体——减毒霍乱沙门氏菌[J].免疫学杂志.2011
[4].甄艳红,韩丽,梁爱心,王庆玲,杨利国.含抑制素重组质粒的减毒猪霍乱沙门氏菌C500遗传稳定性研究[J].生物技术通报.2009
[5].徐引弟,郭爱珍,陈焕春.减毒猪霍乱沙门氏菌作为疫苗及载体的研究进展[J].国外畜牧学(猪与禽).2007