本文主要研究内容
作者杨虹（2019）在《GH45和GH12家族纤维素酶的稳定性和催化特性研究》一文中研究指出：稳定性好、催化活性高的纤维素酶有着广阔的工业应用前景。本论文以从高温真菌Thielavia arenaria XZ7和Neosartorya fischeri P1中分别克隆得到的GH45家族纤维素酶TaCel45和GH12家族纤维素酶NfEG12A为研究对象。针对其高稳定性和高催化特性,进行了蛋白质工程领域的稳定性、催化效率和多底物催化功能的分子机制研究,并延伸到α/β家族酶的多催化反应机制的研究中,以深入探讨酶的多催化功能机理,从而为蛋白质工程改良提供经验与理论基础。具体如下:TaCel45降解CMC-Na的比活为498 U/mg,最适温度和T_m值分别为60和68.4?C,但该酶在90?C和100?C下处理1 h后还能剩余70%和45%的原始酶活。我们构建了7个二硫键突变体来研究其对该酶结构、活性和稳定性的影响。结果显示,六对二硫键(C11-C136、C16-C87、C31-C57、C88-C203、C90-C193和C160-C171)的突变体蛋白均未成功表达,说明它们对TaCel45的正确折叠和分泌是不可或缺的;而突变体C12S微弱表达,但其最适温度和T_m值降为50℃和60.2?C;圆二色谱扫描结果显示C12S的二级结构已发生改变,说明该二硫键对TaCel45的结构稳定和热解折叠有着重要作用。NfEG12A水解CMC-Na的比活为2210 U/mg。该家族酶催化通道中的loop 3区域在氨基酸组成和长度方面存在较大差异,我们在NfEG12A中的loop 3中插入FN/STTQA的序列,而在另一个来源于黑曲霉的GH12纤维素酶EG(PDB:1KS4)中截去STTQA序列,以研究loop 3对GH12纤维素酶催化特性的影响。结果显示,这些突变体改变了酶的催化效率:NfEG12A[100%]<NfEG12A-FN[140%]<NfEG12A-STTQA[190%],EG[100%]>EGΔSTTQA[41%]。分子对接和动力学模拟揭示出延长loop 3可以增强其中的N/Q与底物间的氢键相互作用,从而增加酶的催化效率。GH12家族糖苷水解酶的另一特点是多底物催化功能,其主要包含葡聚糖酶和木葡聚糖酶两类活性,我们通过序列保守性软件分析及突变实验来研究参与底物识别与结合的不同位点。以两个葡聚糖酶NfEG12A和AtEglD及一个木葡聚糖酶NfXyG12A为研究对象,获得的三联突变体NfEG12A-Y7W/N18Y/Y111W和AtEglD-Y7W/N18Y/Y111W降解木葡聚糖的催化效率分别提高到原酶的13.7和3.2倍,而降解葡聚糖的催化效率分别降低为原酶的0.58和0.62倍。反向突变体NfXyG12A-Y18N的葡聚糖酶的催化效率提高了2倍,而木葡聚糖酶的催化效率降低为原酶的0.1倍。这些结果说明7、18和111为重要的底物结合位点。为了更清晰地揭示GH12家族酶与两种底物结合模式的差异,我们获得了NfEG12A和NfEG12A-N18Y的晶体结构,并分别与纤维六糖和木葡寡糖底物进行分子对接和动力学模拟。最后揭示出残基N22、Q67、N194和Q196与葡聚糖分子形成的氢键对该类底物的结合十分重要;而残基N22、Y18、N194和Q196是结合木葡聚糖重要的位点,尤其Y18与木葡聚糖侧链木糖形成稳定的疏水堆积力对该类底物的结合至关重要。α/β家族酶具有多催化反应机制的特点,其中的酯酶催化水解反应,而裂解酶催化单步的去除反应。我们以该家族的酯酶EST1和羟基乙腈裂解酶HNL1为研究材料,采用序列保守性分析,并结合氢氘交换质谱分析蛋白结构柔性的差异,以研究酶结合两类底物的差异位点及区域。最终,我们获得替换HNL1催化通道10.5?以内的16个残基的突变体,其酯酶的催化效率提升为原酶的322倍,裂解酶的催化效率降低为原酶的0.29倍。并且突变体催化口袋内部残基的空间构象已变得更易于结合类似pNPAc苯基朝向的酯类底物,说明这16个残基是结合酯类的关键位点。
Abstract
wen ding xing hao 、cui hua huo xing gao de qian wei su mei you zhao an kuo de gong ye ying yong qian jing 。ben lun wen yi cong gao wen zhen jun Thielavia arenaria XZ7he Neosartorya fischeri P1zhong fen bie ke long de dao de GH45jia zu qian wei su mei TaCel45he GH12jia zu qian wei su mei NfEG12Awei yan jiu dui xiang 。zhen dui ji gao wen ding xing he gao cui hua te xing ,jin hang le dan bai zhi gong cheng ling yu de wen ding xing 、cui hua xiao lv he duo de wu cui hua gong neng de fen zi ji zhi yan jiu ,bing yan shen dao α/βjia zu mei de duo cui hua fan ying ji zhi de yan jiu zhong ,yi shen ru tan tao mei de duo cui hua gong neng ji li ,cong er wei dan bai zhi gong cheng gai liang di gong jing yan yu li lun ji chu 。ju ti ru xia :TaCel45jiang jie CMC-Nade bi huo wei 498 U/mg,zui kuo wen du he T_mzhi fen bie wei 60he 68.4?C,dan gai mei zai 90?Che 100?Cxia chu li 1 hhou hai neng sheng yu 70%he 45%de yuan shi mei huo 。wo men gou jian le 7ge er liu jian tu bian ti lai yan jiu ji dui gai mei jie gou 、huo xing he wen ding xing de ying xiang 。jie guo xian shi ,liu dui er liu jian (C11-C136、C16-C87、C31-C57、C88-C203、C90-C193he C160-C171)de tu bian ti dan bai jun wei cheng gong biao da ,shui ming ta men dui TaCel45de zheng que she die he fen bi shi bu ke huo que de ;er tu bian ti C12Swei ruo biao da ,dan ji zui kuo wen du he T_mzhi jiang wei 50℃he 60.2?C;yuan er se pu sao miao jie guo xian shi C12Sde er ji jie gou yi fa sheng gai bian ,shui ming gai er liu jian dui TaCel45de jie gou wen ding he re jie she die you zhao chong yao zuo yong 。NfEG12Ashui jie CMC-Nade bi huo wei 2210 U/mg。gai jia zu mei cui hua tong dao zhong de loop 3ou yu zai an ji suan zu cheng he chang du fang mian cun zai jiao da cha yi ,wo men zai NfEG12Azhong de loop 3zhong cha ru FN/STTQAde xu lie ,er zai ling yi ge lai yuan yu hei qu mei de GH12qian wei su mei EG(PDB:1KS4)zhong jie qu STTQAxu lie ,yi yan jiu loop 3dui GH12qian wei su mei cui hua te xing de ying xiang 。jie guo xian shi ,zhe xie tu bian ti gai bian le mei de cui hua xiao lv :NfEG12A[100%]<NfEG12A-FN[140%]<NfEG12A-STTQA[190%],EG[100%]>EGΔSTTQA[41%]。fen zi dui jie he dong li xue mo ni jie shi chu yan chang loop 3ke yi zeng jiang ji zhong de N/Qyu de wu jian de qing jian xiang hu zuo yong ,cong er zeng jia mei de cui hua xiao lv 。GH12jia zu tang gan shui jie mei de ling yi te dian shi duo de wu cui hua gong neng ,ji zhu yao bao han pu ju tang mei he mu pu ju tang mei liang lei huo xing ,wo men tong guo xu lie bao shou xing ruan jian fen xi ji tu bian shi yan lai yan jiu can yu de wu shi bie yu jie ge de bu tong wei dian 。yi liang ge pu ju tang mei NfEG12Ahe AtEglDji yi ge mu pu ju tang mei NfXyG12Awei yan jiu dui xiang ,huo de de san lian tu bian ti NfEG12A-Y7W/N18Y/Y111Whe AtEglD-Y7W/N18Y/Y111Wjiang jie mu pu ju tang de cui hua xiao lv fen bie di gao dao yuan mei de 13.7he 3.2bei ,er jiang jie pu ju tang de cui hua xiao lv fen bie jiang di wei yuan mei de 0.58he 0.62bei 。fan xiang tu bian ti NfXyG12A-Y18Nde pu ju tang mei de cui hua xiao lv di gao le 2bei ,er mu pu ju tang mei de cui hua xiao lv jiang di wei yuan mei de 0.1bei 。zhe xie jie guo shui ming 7、18he 111wei chong yao de de wu jie ge wei dian 。wei le geng qing xi de jie shi GH12jia zu mei yu liang chong de wu jie ge mo shi de cha yi ,wo men huo de le NfEG12Ahe NfEG12A-N18Yde jing ti jie gou ,bing fen bie yu qian wei liu tang he mu pu gua tang de wu jin hang fen zi dui jie he dong li xue mo ni 。zui hou jie shi chu can ji N22、Q67、N194he Q196yu pu ju tang fen zi xing cheng de qing jian dui gai lei de wu de jie ge shi fen chong yao ;er can ji N22、Y18、N194he Q196shi jie ge mu pu ju tang chong yao de wei dian ,you ji Y18yu mu pu ju tang ce lian mu tang xing cheng wen ding de shu shui dui ji li dui gai lei de wu de jie ge zhi guan chong yao 。α/βjia zu mei ju you duo cui hua fan ying ji zhi de te dian ,ji zhong de zhi mei cui hua shui jie fan ying ,er lie jie mei cui hua chan bu de qu chu fan ying 。wo men yi gai jia zu de zhi mei EST1he qiang ji yi jing lie jie mei HNL1wei yan jiu cai liao ,cai yong xu lie bao shou xing fen xi ,bing jie ge qing dao jiao huan zhi pu fen xi dan bai jie gou rou xing de cha yi ,yi yan jiu mei jie ge liang lei de wu de cha yi wei dian ji ou yu 。zui zhong ,wo men huo de ti huan HNL1cui hua tong dao 10.5?yi nei de 16ge can ji de tu bian ti ,ji zhi mei de cui hua xiao lv di sheng wei yuan mei de 322bei ,lie jie mei de cui hua xiao lv jiang di wei yuan mei de 0.29bei 。bing ju tu bian ti cui hua kou dai nei bu can ji de kong jian gou xiang yi bian de geng yi yu jie ge lei shi pNPAcben ji chao xiang de zhi lei de wu ,shui ming zhe 16ge can ji shi jie ge zhi lei de guan jian wei dian 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自中国农业科学院的杨虹，发表于刊物中国农业科学院2019-07-05论文，是一篇关于纤维素酶论文,稳定性论文,催化效率论文,催化多功能性论文,分子动力学模拟论文,中国农业科学院2019-07-05论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自中国农业科学院2019-07-05论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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