潘翔珍1薛飞2（商丘市第一人民医院病理科476000，2郑州大学医学院临床医学系450000）
【摘要】目的：研究一定浓度的大黄素对体外培养的口腔鳞癌Tca8113细胞的抑制作用情况。方法：20μmol/ml,40μmol/ml,60μmol/ml,80μmol/ml,100μmol/ml浓度的大黄素溶液作用于口腔鳞癌Tca8113细胞48h，倒置显微镜下观察细胞的增殖情况,荧光染色进一步观察细胞的凋亡情况。结果：倒置显微镜下观察到，随着大黄素浓度在一定范围内的升高，细胞的增殖能力随之下降，AO/EB染色观察到，随着大黄素浓度的增高，处于晚期凋亡的细胞随之增多。结论：一定浓度的大黄素可抑制体外培养的口腔鳞癌Tca8113细胞的增殖和诱导其凋亡。
【关键词】大黄素口腔鳞癌细胞Tca8113抑制【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】2095-7165（2015）09-0447-01
大黄素（Emodin,EM）是一种从蓼属、大黄属、鼠李属植物和番泻叶中分离出来的主要的有效成分，其具有多种生物活性，如抗肿瘤，抗炎，免疫抑制等【1-2】,近年来，研究发现大黄素对多种肿瘤细胞均有明显的抑制作用。口腔鳞状细胞癌（oralsquamouscellcarcinoma,OSCC）,又称口腔癌，是口腔颌面部最为常见的上皮性恶性肿瘤，它的发病率约占口腔恶性肿瘤的95%以上.根据2004年世界癌症研究相关报道显示，口腔鳞癌的发病率在全世界范围内呈现上升的趋势。
本实验拟观察大黄素对人口腔鳞癌Tca8113细胞的抑制作用，初步阐明大黄素的对口腔鳞癌的抑制作用，为开发高效低毒的抗肿瘤新药提供实验室依据。
1材料与方法1.1材料大黄素购自上海源叶生物制剂有效公司；人口腔鳞癌Tca8113细胞购自南京凯基生物技术有限公司；胰蛋白酶，胎牛血清购自杭州四季青生物技术研究所；1.2方法1.2.1细胞培养100ug/ml的RIMP-1640培养液，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
细胞呈贴壁生长，每2-3d传代一次，传代时使用含有EDTA的0.25%胰酶1.5ml消化，室温下消化时间两分半，显微镜下观察，见细胞回缩，变圆，细胞间隙增大时，弃掉瓶内消化液，加入培养液终止消化。经免疫组织化学染色法及形态学观察鉴定为鳞癌细胞。
选用对数生长期细胞进行实验。大黄素用二甲基亚砜（DMSO）溶解，-20℃保存备用，实验前用培养液配置成不同浓度。
1.2.2AO/EB免疫荧光双染色法观察大黄素对人口腔鳞癌Tca8113细胞的抑制作用盖玻片浸酸过夜，高压灭菌后铺于6孔板底，取对数生长期的人口腔鳞癌Tca8113细胞，胰酶消化，制成细胞悬液，血球计数板计数，调整细胞密度为4.0×105/ml，接种于6孔板中，每孔加入细胞悬液2ml，贴壁后加入含有不同浓度大黄素的培养液，继续培养48h，轻轻取出培养板孔内的玻片，每个玻片滴加AO/EB染液200ul，载玻片封面，可直接在免疫荧光显微镜下观察。
2结果2.1常规体外培养下的Tca8113细胞的形态体外培养的Tca8113细胞各时间段贴壁生长良好，边界清楚，细胞核位于中央.,加入不同浓度大黄素作用48h后，细胞呈现不规则形，有大量空泡出现，边缘呈毛刺状。
2.2大黄素作用48h后免疫荧光显微镜下观察细胞形态变化大黄素作用48h后，对照组细胞膜完整，呈现绿色均匀荧光，实验组细胞，出现包膜突触，早期凋亡的细胞胞质仍呈现绿色，但核已经固缩或呈串珠状，晚期凋亡的细胞，核染色质发橙红色荧光，呈固缩状或呈串珠状，有时核碎裂散布于胞浆中，随着浓度的增高，处于晚期凋亡的细胞逐渐增多。
3讨论大黄素（1,3,8-三羟基2-6-甲基蒽醌）属蒽醌类衍生物，具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用。目前国内外研究显示，大黄素的抗肿瘤作用主要与其诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖及其血管形成，逆转肿瘤细胞的多要耐药性，影响肿瘤细胞周期等有关。近年来，大黄素的抗肿瘤作用研究已经逐渐引起了人们的关注，研究表明，大黄素能有效的抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞的增殖只有轻度的抑制，药物毒性很小。目前国内外尚未有大黄素对体外培养的口腔鳞癌Tca8113细胞增殖影响作用的研究。本实验以人口腔鳞癌Tca8113细胞为研究对象，分别加入的20umol/ml,40umol/ml,60umol/ml,80umol/ml,100umol/ml大黄素，作用48h小时后，利用免疫荧光显微镜观察细胞的微结构变化及凋亡的情况，实验结果显示，大黄素对人口腔鳞癌Tca8113细胞有明显的抑制其增值的作用，大黄素作用48h后，可以诱导人口腔鳞癌Tca8113细胞的凋亡，免疫荧光AO/EB染色后，可以见到随着大黄素浓度的增加，处于晚期凋亡的细胞数目增多，染色逐渐加深，由此可见大黄素能诱导人口腔鳞癌Tca8113细胞的凋亡，抑制其增殖，其作用呈明显的浓度依赖性。大黄素是极有应用前途的抗肿瘤中药成分之一，随着近年来研究的不断深入，大黄素的抗肿瘤机制不断被研究，因此具有广阔的临床应用前景。本实验为大黄素对口腔鳞癌的抑制，及对开发高效低毒的抗肿瘤新药提供理论依据。
参考文献：[1]DongQG,SclabasGM,FujiokaS,etal.ThefunctionofmultipleIkappaB:NF-kappaBcomplexesintheresistanceofcancercellstoTaxol-inducedapoptosis.Oncogene.2002.21(42):6510-6519.[2]HuangQ,ShenHM,OngCN.Inhibitoryeffectofemodinontumorinvasionthroughsuppressionofactivatorprotein-1andnuclearfactor-kappaB.BiochemPharmacol.2004.68(2):361-371._