导读:本文包含了定点突变体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:CotA漆酶,短小芽胞杆菌,定点突变,可溶性表达
定点突变体论文文献综述
罗权[1]（2018）在《定点突变提高CotA漆酶突变体WLF活性及表达水平的研究》一文中研究指出芽胞杆菌CotA漆酶是具有工业应用前景的“绿色”酶,其底物谱广、热稳定性高、pH作用范围宽、重要的是能在碱性条件下发挥作用,对印染废水等碱性工业废水处理具有重要应用潜力,然而野生CotA漆酶的催化活性偏低是工业应用瓶颈。本实验室前期针对自主筛选的短小芽胞杆菌W3(Bacillus pumilus W3)CotA漆酶已构建出一个催化效率提高约4倍的优良突变体L386W/G417L/G57F(WLF),但其在重组大肠杆菌(Escherichia coli)中可溶性表达水平低。为尝试进一步提高WLF的催化活性,并提高其可溶性表达水平,基于序列比对的理性分析,分别构建了5个突变体,分别为M502L/WLF、M502F/WLF、K317N/WLF、D501G/WLF和K317N/D501G/WLF,并对其酶学性质和稳定性进行测定。实验结果显示,突变体M502L/WLF和M502F/WLF无活性,表明M502位点是CotA漆酶催化中心维持活性的关键性位点,不可替换;突变体D501G/WLF和K317N/D501G/WLF在E.coli的可溶性表达量分别提高了约4.48倍和3.63倍;K317N/WLF不能提高酶可溶性表达水平,但对CotA漆酶的稳定性略有提升。分析显示,突变酶D501G/WLF和K317N/D501G/WLF依然保持较高的热稳定性和耐酸碱高盐等特性,对染料的脱色效率依然很高。不同的金属离子对以上突变体有不同影响,Cu~(2+)能够显着增强活力,Fe~(2+)对突变酶有较强抑制作用,Na~+、K~+和Ca~(2+)显示微弱抑制作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)和Mg~(2+)显示微弱促进作用。通过生物信息学分析结合圆二色谱进行二级结构测定显示,位点突变后影响了CotA漆酶的氨基酸残基间的氢键数,二级结构发生变化,可溶性表达提高的潜在机制是T1Cu中心结构变化-β-折迭的增加促进了CotA漆酶突变体表达翻译后折迭效率的提高,并对漆酶的热稳定性产生正向影响。本研究首次通过定点突变方法提高短小芽胞杆菌CotA漆酶在重组E.coli的可溶性表达水平。构建的突变体D501G/WLF和K317N/D501G/WLF具有工业应用潜力。(本文来源于《江南大学》期刊2018-06-01）
陈冬冬[2]（2018）在《口蹄疫病毒VP3定点突变体的构建及其生物学特性和免疫血清学研究》一文中研究指出口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种重大动物疫病,我国历史上发生和近年来流行的有O、A和Asia 1叁个血清型,其中O型口蹄疫对我国畜牧养殖业的威胁最大。疫苗免疫是防控本病的重要手段,现有的市售口蹄疫疫苗包括常规灭活疫苗和合成肽疫苗。但是,前者不利于与口蹄疫病毒自然感染动物的鉴别诊断;后者在有新发外来病毒株入侵时可能会出现免疫失败。目前,随着口蹄疫反向疫苗学的发展,借助基因工程手段缺失或沉默口蹄疫病毒非结构蛋白的免疫优势表位创制的负标记疫苗有效解决了第一个瓶颈问题;本研究探索性地在口蹄疫病毒外部衣壳蛋白VP3的G–H环中进行靶向改造,旨在为广谱、多联(价)、正标记疫苗的研发提供借鉴性思路。首先,为了评估外部衣壳蛋白VP3 G–H环展示外源标签的能力,本研究利用成熟的O型Cathay拓扑型口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台(pOFS→r HN),构建了两种HA插入型(第3171–3172位)的基因组全长c DNA。遗憾的是,未能拯救到基因工程毒。遂将HA、Flag、VSV-G替换性引入该区段,构建了六种外源标签替换型的基因组全长c DNA。同样地,也未能获得基因工程毒;而且,其中一种HA替换型的口蹄疫病毒基因组全长c DNA经密码子优化后仍无法获得基因工程毒。这表明骨架病毒r HN的VP3 G–H环中存在着与口蹄疫病毒感染性相关的关键性氨基酸。为此,本研究对照一种HA修饰型质粒,对骨架病毒的基因组全长感染性c DNA进行定点突变,构建了四种突变型质粒;同时,参考C型和SAT2型口蹄疫病毒代表株,构建了叁种血清型间嵌合型质粒。转染结果证实,仅有突变型质粒pOFS~(V3174Y)和血清型间嵌合型质粒pOFS~(D3173N+V3174E+N3179C)具有感染性,两种定点突变体分别命名为r HN~(V3174Y)和r HND3173N+V3174E+N3179C。最后,本研究对两种定点突变体与骨架病毒进行了生物学特性鉴定和免疫血清学比较分析。试验发现,(1)r HN~(D3173N+V3174E+N3179C)定点突变体在BHK-21细胞上连续传代时容易引发假回复突变和第二位点突变;(2)r HN~(V3174Y)和r HN~(D3173N+V3174E+N3179C)细胞传代毒均获得了侵染CHO系列细胞的能力(非RGD依赖型受体);(3)r HN、r HN~(V3174Y)和r HN~(D3173N+V3174E+N3179C)遗传稳定株在BHK-21细胞上的蚀斑表型、复制动力学略有差异,但差异不显着。(4)与r HN相比,r HN~(V3174Y)和r HN~(D3173N+V3174E+N3179C)遗传稳定株的体内/外致病力均有下降,后者更为明显;(5)与r HN的免疫阳性血清相比,r HN~(V3174Y)和r HN~(D3173N+V3174E+N3179C)遗传稳定株的免疫阳性血清对我国现已分离的O型Mya98和Pan Asia-1谱系FMDV的交叉中和能力均有不同程度的改变,且后者的r值均大于0.5(符合OIE规定标准,r≥0.3)。上述研究结果提示,可通过尝试性地在空间结构上外露于病毒衣壳表面且靠近口蹄疫病毒抗原位点的茎环区进行氨基酸残基的人为修饰,有望针对性地拓实口蹄疫疫苗候选株的免疫效力。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2018-05-01）
薛金辉[3]（2018）在《利用CRISPR-Cas9介导的定点诱变方法构建Cas9温敏突变体》一文中研究指出CRISPR-Cas系统是存在于细菌和古生菌基因组中的一些短的间隔重复序列,是这些原核生物在长期演化的过程中用来抵抗病毒或质粒等外源DNA入侵的一种“适应性免疫防御系统”[1]。自2012年,研究证明CRISPR-Cas系统具有非常高效地靶向基因修饰作用,并且可以应用在任何组织中,之后又证明该系统对哺乳动物基因组能进行有效地特异性修饰,说明其作为基因编辑技术有着巨大的应用前景[2]。目前大多数CRISPR-Cas的应用都源自于Streptococcus pyogenes的spCas9,另外其他原核生物中各种不同的CRISPR-Cas系统也已经被发现,并证明也可以作为有效地基因修饰工具。CRISPR-Cas9是一种RNA引导的DNA核酸内切酶,通过将入侵的噬菌体或质粒DNA片段整合到宿主染色体上的CRISPR序列中[2],转录产生成熟的CRISPRRNAs(crRNAs),其引导Cas蛋白靶向带有互补序列的外来核酸DNA,来指导同源序列的降解,从而提供免疫性。CRISPR/Cas9作为新一代的基因编辑技术,和传统的锌指核酸内切酶(ZFNs)[]和类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)[4]技术相比,使用一段特异性的RNA来引导核酸内切酶靶向切割外源DNA,而不依赖于蛋白结构域,从而完成基因编辑,操作更简洁高效。为了能够有效提高CRISPR-Cas9的热稳定性,本研究利用已经公布的热敏感突变体预测网站TSpred,对Cas9蛋白进行分析并预测潜在的可突变位点,然后利用CRISPR-Cas9介导的定点诱变方法对Cas9基因进行酶切,通过PCR的方法在Cas9基因序列中引入目的突变,并联合本实验室的“T5核酸外切酶介导的克隆方法”构建Cas9温敏突变体,最后纯化表达筛选出热稳定性高的Cas9突变体。主要内容如下:1.在NCBI中查到来源于Streptococcus pyogenes的spCas9蛋白质序列,全基因序列是由武汉金开瑞公司合成并装在pUC57克隆载体上。2.根据Cas9序列和大肠杆菌表达载体pET-23a分别设计正反向引物,然后利用PCR扩增Cas9基因,片段回收后,通过本实验室的“T5核酸外切酶介导的PCR产物定向克隆的方法”装载到pET-23a载体上。3.从蛋白质数据库查询Cas9的PDB代码,利用TSpred预测系统对Cas9蛋白进行分析获得潜在温敏突变位点。4.根据获得的可突变位点,在Cas9基因序列上寻找合适的切割位点,并设计引物来合成相应的sgRNA转录模板,利用T7体外转录试剂盒转录出需要的sgRNA,与纯化的Cas9蛋白一起对pET23a-Cas9质粒切割,回收酶切后的线性质粒当做载体备用,同时在切割位点和突变碱基处分别设计引物,利用PCR将突变引入片段中。5.通过T5克隆将突变的片段克隆到切好的载体上,转化后挑菌测序获得预想的Cas9突变体,表达纯化得到Cas9突变蛋白,检测其与原始Cas9蛋白在不同温度梯度的酶切效果,筛选出热稳定好的突变体。目前已经做了 17个位点一共70个突变体,其中筛选出来的L279E,L279F和F238G叁个突变体相比野生型Cas9在50℃有着更好的切割效果,而且L279E在55℃也可以进行酶切;另外有些突变体在42℃的切割效果比野生型更差,比如位于Cas9蛋白序列的第18位的Trp,突变后酶活性降低;还有部分突变体表达量非常低,例如位于335和380 的 Leu。由于Cas9蛋白分子量非常大,单个氨基酸的突变对于整个蛋白的热稳定性影响很小,若要寻找热稳定更好的突变体,可以通过结合几个有效的单突变位点构建多点突变体。由于Cas9蛋白非常大,目前现有的的各种预测网站无法对其进行准确的多点预测,无法设计多位点突变,现在这部分工作还没有进行。(本文来源于《湖北大学》期刊2018-04-14）
郭子平,翟清华,曾令锋,邓西平,杨淑慎[4]（2016）在《小麦TaGAPC定点突变体基因载体构建及其原核表达》一文中研究指出为了研究催化活性半胱氨酸Cys154、Cys158残基对小麦细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Ta GAPC)蛋白酶活性的影响,利用重迭延伸PCR法分别将这2个位点的半胱氨酸突变成丝氨酸,并分别连入p ET28a(+)原核表达载体。在25℃条件下,Ta GAPC及其定点基因Ta Cys154S/Ta Cys158S经0.25 mmol/L IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示,目标重组蛋白均为可溶性且大小约为40 k Da,与预测结果一致。在此基础上,经超声波破菌及镍柱纯化获得3种纯化重组蛋白。这为后续Ta GAPC及其定点突变体蛋白酶活性测定及活性位点分析提供试验材料。(本文来源于《华北农学报》期刊2016年01期）
贾丽,赵国芬,李晨曦,张和平,包秋华[5]（2015）在《利用PCR介导的基因定点突变技术构建L.plantarumP-8亚油酸异构酶突变体》一文中研究指出以植物乳杆菌P-8(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum P-8)亚油酸异构酶为研究对象,通过http://swissmodel.expasy.org/,http://smart.embl-heidelberg.de/和vecter NTI等在线工具与软件,对亚油酸异构酶进行生物信息学分析并预测与酶活性相关的位点,预测亚油酸异构酶的3个氨基酸可能为第68位甘氨酸、第107位精氨酸和第172位组氨酸。设计1对含突变的引物,以重组质粒p QE30-LAI为模板,利用PCR介导的定点突变技术构建突变体。经序列比对表明,成功构建了突变体G68A(甘氨酸突变为丙氨酸)、R107L(精氨酸突变为亮氨酸)和H172P(组氨酸突变为脯氨酸),为进一步研究LAI的结构和功能奠定了基础。(本文来源于《农产品加工》期刊2015年15期）
李猛[6]（2013）在《拟南芥pipe恢复突变体LL-2的研究及PIPE的定点突变》一文中研究指出本实验室使用EMS(甲基磺酸乙酯)诱变处理拟南芥,筛选得到一个与表皮细胞发育相关突变体pipe。通过图位克隆的方法克隆到目的基因,该基因编码一种蛋白磷酸酶。本实验在pipe突变体的基础上,经EMS二次诱变,从中筛选得到能够部分恢复pipe突变体矮化表型的株系LL-2。与pipe匕较,LL-2植株明显增高。pipe突变体的莲座叶叶序发生变化,叶片狭小、不规则卷曲,LL-2的莲座叶叶序恢复正常,叶片不具有卷曲现象,但是莲座叶的数目较野生型少。与野生型相比,pipe的莲座叶下表皮扁平细胞明显呈砖块状排列,不具有指状交错的形态,LL-2莲座叶下表皮的扁平细胞呈指状交错排列,恢复为野生型表型。遗传分析证明LL-2突变基因与PIPE基因紧密连锁。对LL-2突变基因进行定位,发现PIPE基因的第547位碱基由C变为T,对应的第183位的氨基酸由组氨酸变成酪氨酸。通过酵母双杂实验,验证PIPEH183Y-BD.PIPEH183YT246M-BD与DELLA的蛋白互作。构建35S-PIPEH183Y-GFP、35S-PIPEH183YT46M-GFP载体,转入野生型和pipe,观察转基因植株表型,发现无明显变化。另外,为了进一步研究PIPE的功能,本论文还定点突变该基因的叁个活性位点,构建点突变载体并转入野生型或pipe突变体中,发现转基因植株在表型上与野生型或pipe突变体差别不大。此外,本实验还探讨了拟南芥中CKI(I型酪蛋白激酶)对GA信号途径的影响。对拟南芥中CKI叁个同源性较高的激酶基因的T-DNA插入株系进行了鉴定,初步发现激酶的T-DNA插入并不能恢复pipe的表型,表明CKI可能没有参与GA信号途径中DELLA的调节。(本文来源于《兰州大学》期刊2013-05-01）
崔敬爱,王德梅,陈晓平[7]（2013）在《抗菌肽Spinigerin α基因定点突变体的构建》一文中研究指出通过对Spinigerin α抗菌肽的结构分析,结合抗菌肽的抗菌机理,根据毕赤酵母的偏爱密码子对该抗菌肽进行定点突变。将亲水性氮端的碱性赖氨酸分别突变为碱性更强的精氨酸、酸性的天冬氨酸以及中性的丙氨酸,将疏水性碳端的中性亮氨酸突变成碱性的精氨酸、酸性的天冬氨酸。将定点突变后的Spinigerin α基因按正确阅读框克隆至穿梭质粒pPICZ α-A上,经PCR鉴定、序列分析,所转化的宿主酵母GS115中含有该突变体,结果表明已成功构建了抗菌肽Spinigerin α基因的突变体,为获得高效的抗菌效果的抗菌肽奠定一定的基础。(本文来源于《食品科技》期刊2013年03期）
徐小明[8]（2012）在《内毒素结合肽突变体（mEBP9）的聚乙二醇定点修饰及其稳定性和拮抗内毒素效应研究》一文中研究指出革兰氏阴性杆菌外膜的主要成分内毒素(lipopolysaccharide, LPS)是临床上导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和脓毒症(sepsis)的主要原因。目前SIRS或者脓毒症仍然具有较高的发病率和死亡率，现阶段防治革兰氏阴性杆菌引起的SIRS或者脓毒症主要依赖于抗生素控制感染，但对内毒素血症(Endotoxemia)的疗效并不理想。脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)具有放大LPS毒性的作用。LBP的氨基端含有特异性LPS结合位点；LBP的第91-108位氨基酸序列是已知的结合LPS能力很强的氨基酸序列(Endotoxin binding peptide，EBP)。在本课题组前期工作中，为增强EBP的拮抗LPS生物活性，通过对EBP的结构进行改建，从11条内毒素结合肽突变体(mutant of EBP，mEBP)中筛选出拮抗LPS作用较强的第9条内毒素结合肽突变体(mEBP9)。鉴于普通多肽在体内容易被降解，生物半衰期较短，而经聚乙二醇修饰的多肽在体内比未经修饰的多肽可能具有较高的稳定性和较好的保护效应；本研究在mEBP9的氨基端或者羧基端引入一个半胱氨酸(mEBP9-SH)，通过mEBP9-SH上的巯基加成到mPEG-MAL(甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺)的双键上，实现对mEBP9进行聚乙二醇定点修饰。我们课题组通过生物合成途径已经获得mEBP9、 PEG-NH-mEBP9以及PEG-COOH-mEBP9，观察PEG-NH-mEBP9和PEG-COOH-mEBP9的拮抗LPS活性并筛选出拮抗LPS效应更强的PEG-NH-mEBP9；在此基础上比较PEG-NH-mEBP9与mEBP9的体内外拮抗LPS活性。主要研究结果如下：1. CCK-8法检测结果显示1、5、10、20μmol/L的mEBP9、PEG-NH-mEBP9和PEG-COOH-mEBP9对RAW264.7细胞均无可见的细胞毒性。2. PEG-NH-mEBP9抑制LPS诱导的TAL活化效应明显强于同浓度的PEG-COOH-mEBP9(P＜0.01)；PEG-NH-mEBP9抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6作用优于等浓度的PEG-COOH-mEBP9。3.10μmol/L的PEG-NH-mEBP9或mEBP9在-20℃放置30天后抑制LPS诱导的TAL活化能力大于在37℃放置30天后的PEG-NH-mEBP9或mEBP9；10μmol/L的mEBP9在-20℃环境放置30天后抑制LPS诱导的TAL活化能力大于等浓度的PEG-NH-mEBP9；10μmol/L的PEG-NH-mEBP9在37℃环境放置30天后抑制LPS诱导的TAL活化作用明显强于同浓度的mEBP9(P＜0.05)。LPS诱导RAW264.7细胞3h、6h、12h后，5μmol/L的mEBP9抑制RAW264.7细胞分泌TNF-α效应均强于同一时相点同浓度的PEG-NH-mEBP9；LPS刺激RAW264.7细胞24h、36h、48h后，5μmol/L的PEG-NH-mEBP9的抑制RAW264.7细胞分泌TNF-α能力反而都强于同一时相点等浓度的mEBP9。4. PEG-NH-mEBP9与mEBP9体外拮抗LPS生物活性比较：mEBP9抑制LPS诱导的TAL活化效应强于同浓度的PEG-NH-mEBP9；mEBP9抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6作用明显优于等浓度的PEG-NH-mEBP9(P＜0.05)。5. PEG-NH-mEBP9和mEBP9体内拮抗LPS效应比较：(1)提高模型小鼠生存率：“LPS/D-GalN”组48h内全部死亡，“mEBP9+LPS/D-GalN”组和“PEG-NH-mEBP9+LPS/D-GalN”组48h生存率分别为为40%和60%。(2)减少血浆TNF-α和IL-6水平：LPS/D-GalN处理后90min，PEG-NH-mEBP9和mEBP9都可以明显抑制小鼠体内血浆TNF-α/IL-6分泌(P＜0.01)，且PEG-NH-mEBP9拮抗LPS的效应显着强于mEBP9(P＜0.05)。(3)减少血清ALT和AST水平：LPS/D-GalN处理后6h，PEG-NH-mEBP9和mEBP9都可以明显抑制小鼠体内血清ALT/AST活性(P＜0.01)，且PEG-NH-mEBP9拮抗LPS活性明显强于mEBP9(P＜0.05)。(4)减轻小鼠肝脏病理组织学改变：“LPS/D-GalN”组肝脏有明显的病理学改变，包括肝细胞坏死，充血，肝组织结构的破坏，肝窦内大量的炎症细胞聚集；“LPS/D-GalN+mEBP9”组肝脏组织坏死的区域和坏死程度均降低，而且炎症细胞浸润减少；“LPS/D-GalN+PEG-NH-mEBP9”组肝脏病理组织学改变程度比“LPS/D-GalN+mEBP9”组轻。主要研究结论：PEG-NH-mEBP9拮抗LPS效应优于PEG-COOH-mEBP9；PEG-NH-mEBP9拮抗LPS的生物活性稍逊于mEBP9，而PEG-NH-mEBP9的体外稳定性优于mEBP9；PEG-NH-mEBP9和mEBP9均可保护D-氨基半乳糖增敏的内毒素血症模型小鼠，且PEG-NH-mEBP9对模型小鼠的保护作用优于mEBP9。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2012-05-01）
舒婷,张剑韵,黄龙全[9]（2011）在《家蚕吡哆醛激酶基因定点突变及突变体功能》一文中研究指出【目的】吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK)是维生素B6关键代谢酶。前期研究克隆出家蚕Bombyx mori吡哆醛激酶cDNA,经序列比对发现几个重要且保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。为明确家蚕吡哆醛激酶分子若干特定位置上氨基酸残基在酶功能上的作用进行本研究。【方法】采用重迭延伸法对家蚕吡哆醛激酶Thr47,Asn121,Ile54,Arg88和Trp230氨基酸残基进行定点突变,构建表达载体pET-22b(+)-PLK并转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中进行诱导表达,经亲和层析对重组蛋白进行纯化,通过酶活性检测进行功能鉴定。【结果】家蚕吡哆醛激酶Thr47,Ile54和Arg88氨基酸突变后酶的催化活力分别下降82%,58%和85%;Asn121突变对酶的催化活力几乎没有影响;而Trp230突变导致酶丧失催化活性。【结论】本研究明确了选定氨基酸侧链基团在家蚕吡哆醛激酶催化功能上的意义。(本文来源于《昆虫学报》期刊2011年09期）
陈蕴如,郭朝万,黄增委,钱垂文,张晓伟[10]（2010）在《核苷二磷酸激酶A的定点突变及C4S突变体的制备和活性研究》一文中研究指出目的:对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)二硫键异构的关键残基C4进行定点突变,构建、表达并纯化C4S突变体,测定其磷酸转移酶活性和DNase活性,研究二硫键异构对NDPK-A活性的影响。方法:以pBV220-nm23-H1质粒作为模板,通过设计合适的引物对NDPK-A进行定点突变,将第4位半胱氨酸突变为丝氨酸,构建NDPK-AC4S突变体;在大肠杆菌BL21中表达,DEAE-sepharose Fas tFlow与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B纯化目的蛋白,获得均一重组蛋白,纯度达到98%;DNA序列测定及重组蛋白的肽质量指纹图谱(PMF)分析均证明构建正确突变体;高效液相色谱法(HPLC)与DNA消化法分别测定野生型NDPK-A与C4S突变体的磷酸转移酶活性与DNase活性差异。结果:NDPK-AC4S突变体的磷酸基转移酶与DNase酶活性均高于野生型NDPK-A。结论:NDPK-A缺失二硫键后,活性增高。NDPK-A形成链内二硫键可能是其活性负调控模式之一。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2010年07期）
定点突变体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种重大动物疫病,我国历史上发生和近年来流行的有O、A和Asia 1叁个血清型,其中O型口蹄疫对我国畜牧养殖业的威胁最大。疫苗免疫是防控本病的重要手段,现有的市售口蹄疫疫苗包括常规灭活疫苗和合成肽疫苗。但是,前者不利于与口蹄疫病毒自然感染动物的鉴别诊断;后者在有新发外来病毒株入侵时可能会出现免疫失败。目前,随着口蹄疫反向疫苗学的发展,借助基因工程手段缺失或沉默口蹄疫病毒非结构蛋白的免疫优势表位创制的负标记疫苗有效解决了第一个瓶颈问题;本研究探索性地在口蹄疫病毒外部衣壳蛋白VP3的G–H环中进行靶向改造,旨在为广谱、多联(价)、正标记疫苗的研发提供借鉴性思路。首先,为了评估外部衣壳蛋白VP3 G–H环展示外源标签的能力,本研究利用成熟的O型Cathay拓扑型口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台(pOFS→r HN),构建了两种HA插入型(第3171–3172位)的基因组全长c DNA。遗憾的是,未能拯救到基因工程毒。遂将HA、Flag、VSV-G替换性引入该区段,构建了六种外源标签替换型的基因组全长c DNA。同样地,也未能获得基因工程毒;而且,其中一种HA替换型的口蹄疫病毒基因组全长c DNA经密码子优化后仍无法获得基因工程毒。这表明骨架病毒r HN的VP3 G–H环中存在着与口蹄疫病毒感染性相关的关键性氨基酸。为此,本研究对照一种HA修饰型质粒,对骨架病毒的基因组全长感染性c DNA进行定点突变,构建了四种突变型质粒;同时,参考C型和SAT2型口蹄疫病毒代表株,构建了叁种血清型间嵌合型质粒。转染结果证实,仅有突变型质粒pOFS~(V3174Y)和血清型间嵌合型质粒pOFS~(D3173N+V3174E+N3179C)具有感染性,两种定点突变体分别命名为r HN~(V3174Y)和r HND3173N+V3174E+N3179C。最后,本研究对两种定点突变体与骨架病毒进行了生物学特性鉴定和免疫血清学比较分析。试验发现,(1)r HN~(D3173N+V3174E+N3179C)定点突变体在BHK-21细胞上连续传代时容易引发假回复突变和第二位点突变;(2)r HN~(V3174Y)和r HN~(D3173N+V3174E+N3179C)细胞传代毒均获得了侵染CHO系列细胞的能力(非RGD依赖型受体);(3)r HN、r HN~(V3174Y)和r HN~(D3173N+V3174E+N3179C)遗传稳定株在BHK-21细胞上的蚀斑表型、复制动力学略有差异,但差异不显着。(4)与r HN相比,r HN~(V3174Y)和r HN~(D3173N+V3174E+N3179C)遗传稳定株的体内/外致病力均有下降,后者更为明显;(5)与r HN的免疫阳性血清相比,r HN~(V3174Y)和r HN~(D3173N+V3174E+N3179C)遗传稳定株的免疫阳性血清对我国现已分离的O型Mya98和Pan Asia-1谱系FMDV的交叉中和能力均有不同程度的改变,且后者的r值均大于0.5(符合OIE规定标准,r≥0.3)。上述研究结果提示,可通过尝试性地在空间结构上外露于病毒衣壳表面且靠近口蹄疫病毒抗原位点的茎环区进行氨基酸残基的人为修饰,有望针对性地拓实口蹄疫疫苗候选株的免疫效力。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
定点突变体论文参考文献
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