导读:本文包含了嵌合纤毛论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:六邻体,纤毛头,中和抗体,叁价疫苗
嵌合纤毛论文文献综述
刘甜恬[1]（2018）在《人3、7和55型腺病毒叁价疫苗候选株及纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒的研究》一文中研究指出【目的】人类腺病毒(HAdV)3、7和55型可引起急性呼吸道疾病流行和暴发。1、研究并探讨一株抗人3、7和55型腺病毒叁价疫苗候选株,为腺病毒疫苗研究奠定基础。2.鉴定中和抗原对监测疫情和疫苗开发至关重要,以人叁型腺病毒为基础,构建7型腺病毒纤毛头和六邻体蛋白嵌合型重组腺病毒,研究产生主要中和抗体的抗原。3、构建人5型腺病毒纤毛蛋白嵌合型重组人叁型腺病毒,研究其对类动物细胞的感染性。【方法】一、通过同源重组,将含有HAdV-55六邻体的片段pSKE3LR-h55中的HAdV-55六邻体(h55)重组到含有HAdV-3和HAdV-7六邻体的质粒p BRAd-MHE3中,得到的叁价腺病毒质粒命名为p BRAd-MHE3-h55。在二价疫苗rAdMHE3的E3区表达HAdV-55的六邻体,包装出重组抗人3、7和55型腺病毒叁价疫苗候选株rAdMHE3-h55。测定重组腺病毒的生长曲线用来分析其生长特性,使用小鼠血清对重组病毒进行的体外中和试验。使用rAdMHE3-h55免疫小鼠,分别用HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55滴鼻攻毒,取肺组织进行Q-PCR检测、HE染色,检测重组腺病毒对小鼠的保护力。通过PCR扩增人7型腺病毒的纤毛头基因,与人3型腺病毒载体进行同源重组,包装出含Ad3E骨架和HAdV-7纤毛头的重组衣壳嵌合人腺病毒rAd3E-Fk7。通过PCR获得的人7型腺病毒的六邻体基因替换p Ad3E-Fk7的3型六邻体,包装出含有Ad3E骨架和HAdV-7六邻体和纤毛头的重组衣壳嵌合人腺病毒rAd3E-H7Fk7。测定重组腺病毒的生长曲线用来分析其生长特性,使用小鼠和人血清对嵌合腺病毒进行的体外中和试验。使用纯化的病毒HAdV-3、HAdV-7和rAd3E-H7Fk7免疫小鼠获得血清进行体外中和实验,在人血清中对重组腺病毒进行中和试验。叁、通过PCR扩增人5型腺病毒的纤毛头基因,与人3型腺病毒载体进行同源重组,包装出包含Ad3E骨架和HAdV-5纤毛头的重组衣壳嵌合人腺病毒rAd3E-Fk5。测定重组腺病毒的生长曲线用来分析其生长特性。重组人腺病毒rAd3E-Fk5感染小鼠原代肾上皮细胞、金仓鼠原代肾上皮细胞以及测定rAd3E-Fk5在金仓鼠原代细胞内晚期基因的表达。【结果】一、成功包装出了重组抗人3、7和55型腺病毒叁价疫苗候选株rAdMHE3-h55。重组叁价病毒rAdMHE3-h55表达HAdV-55的六邻体蛋白并且具有与其对应的野生型HAdV-3有相似的复制动力学。小鼠抗-rAdMHE3-h55对HAdV-3、HAdV-7、HAdV-55和rAdMHE3-h55产生强应答,而小鼠抗-HAdV-55仅针对HAdV-55和rAdMHE3-h55的产生应答。这些发现证实,重组腺病毒rAdMHE3-h55能够在小鼠中诱导免疫应答,并且产生针对HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55的抗体。用rAdMHE3-h55接种可BALB/c小鼠,使用HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55对其进行滴鼻感染,发现第五天,免疫后的小鼠对叁种病毒都能有效的清除。我们的体外和体内研究表明,rAdMHE3-h55不仅能够诱导针对HAdV3、HAdV7和HAdV55的中和抗体,而且使用HAdV-3、HAdV-7或HAdV-55对小鼠进行滴鼻攻毒,rAdMHE3-h55免疫对小鼠能明显产生保护作用。二、成功构建了重组腺病毒rAd3E-Fk7和rAd3E-H7Fk7。重组腺病毒rAd3E-Fk7、rAd3E-H7Fk7与野生型腺病毒具有相同的复制曲线。用嵌合腺病毒进行体外中和实验表明,六邻体和纤毛头蛋白能诱导产生针对HAdV-3和HAdV-7的中和抗体。对人血清进行体外中和实验,显示六邻体和纤毛头蛋白能产生HAdV-3或HAdV-7的中和抗体。总之,HAdV-3和HAdV-7中的六邻体蛋白和纤毛头蛋白都可能是诱导中和抗体应答。研究结果对腺病毒疫苗和药物开发有重要意义。叁、成功构建了重组人五型腺病毒纤毛头蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-Fk5。结果显示rAd3E-Fk5病毒在金仓鼠原代细胞内有显着增殖。而rAd3E病毒在金仓鼠原代细胞内没有显着增殖。人3型腺病毒rAd3E对小鼠肾原代细胞感染能力低,而纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-Fk5的感染力高,与对照人5型腺病毒rAd5E感染力相近。rAd3E-Fk5在金仓鼠原代细胞内有晚期基因的表达。可以用于人3型腺病毒疫苗评价、抗病毒药物评价、致病机制的小鼠、金仓鼠动物模型中。【结论】一、重组腺病毒rAdMHE3-h55能够在小鼠中诱导免疫应答,并且产生针对HAdV-3、HAdV-7和HAdV-55的抗体。对重组腺病毒疫苗的开发有重要意义。二、HAdV-3和HAdV-7中的六邻体蛋白和纤毛头蛋白都可能是诱导中和抗体应答。因此可能对腺病毒疫苗和药物开发很重要。叁、纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒rAd3E-Fk5在体外可以感染小鼠肾原代上皮细胞、金仓鼠肾原代细胞,其感染效率与HAdV-5相近,相比其母毒株rAd3E其感染效率要高得多,rAd3E-Fk5在金仓鼠细胞内有显着复制,可以用于人3型腺病毒疫苗评价、抗病毒药物评价、致病机制等动物模型中。(本文来源于《广州医科大学》期刊2018-03-01）
庞涛[2]（2013）在《靶向胃癌相关成纤维细胞的纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体的实验研究》一文中研究指出胃癌目前在中国的发生率及死亡率仍明显高于世界平均水平，手术及化疗效果仍不尽如人意，缺乏特异性是胃癌治疗面临的一个主要问题，因此研发出新的肿瘤靶向机制的治疗方法显得非常必要。作为肿瘤赖以生存的土壤，肿瘤间质主要由细胞外基质、内皮细胞、免疫细胞以及肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts, CAFs）等组成。CAFs是其中最主要的组成部分，可以分泌肿瘤细胞生长所需的各种细胞因子、生长因子和粘附分子等，促进肿瘤细胞的增殖、分化；分泌多种蛋白酶，促进肿瘤细胞的扩散及转移；CAFs可以明显增强肿瘤细胞逃避机体免疫系统的打击能力，并可以增强肿瘤细胞对放、化疗的抵抗，成为肿瘤难治及复发的根源。此外，有研究表明，CAFs在维持适于肿瘤干细胞生存的微环境过程中也扮演着重要角色。由此可见，CAFs在肿瘤的发生、发展、复发、转移，乃至拮抗放、化疗等过程中都发挥着至关重要的作用。而CAFs具有两个显着特征使其区别于正常的成纤维细胞：首先，绝大多数上皮来源恶性肿瘤的CAFs表面均表达具有丝氨酸蛋白酶活性的成纤维细胞活化蛋白（FAP），其表达水平与肿瘤的恶性程度存在着明显的正相关，且FAP仅见于活化的成纤维细胞膜表面，正常组织、细胞不表达；其次，高表达具有细胞趋化作用的间质衍生因子CXCL12，该因子及其特异性受体（CXCR4、CXCR7）在肿瘤细胞的增殖、活化、肿瘤新生血管形成以及转移过程中都发挥着非常重要的作用。二者是肿瘤间质治疗的研究热点。由此，靶向CAFs进行肿瘤间质治疗，使肿瘤成为无本之木，是一种非常有前景的肿瘤治疗策略。但以往的研究多以小分子药物或单克隆抗体为主，不仅制备工艺复杂，且靶点相对单一，疗效有限。鉴于此，我们在本研究中引入了肿瘤间质生物治疗的概念，即利用溶瘤腺病毒特异性地杀伤CAFs。重组腺病毒是一种非常优良的载体，具有致病性低、不与宿主基因组整合（低致癌性）、可感染处于静止和非静止期的细胞、允许装载较大的外源DNA片段、基因表达谱及相应的蛋白功能的了解比较清楚以及易于大规模制备和纯化等诸多优点，被广泛应用于基因治疗的各个领域。但其在临床应用中仍存在一定限制，主要有：1、目前常用的腺病毒载体（C亚群的Ad2、Ad5）宿主范围广泛，对几乎所有的哺乳类动物细胞都有一定的感染能力，但靶向性欠佳；2、受细胞表面受体和整合素表达水平的限制，腺病毒对不同细胞组织的感染能力差别很大，对CAFs的感染效率较低；3、Ad2、Ad5虽有易于大规模制备的优点，但经系统途径给药时易在肝脏富集，导致其不仅难于到达肿瘤发生部位，还可能造成严重的肝毒性；4、CAFs的存在会明显减弱腺病毒的治疗效果；5、成人体内大多存在有针对Ad2、Ad5的中和抗体，系统途径给予腺病毒时易激发机体的免疫反应从而被清除。为此，我们拟在保留腺病毒固有优点的基础上，综合运用纤毛蛋白修饰、转录水平调控以及六联体嵌合等多种策略对腺病毒载体进行改造，构建一种可以特异、高效地感染并杀伤CAFs，且低肝脏亲嗜性、低免疫原性的溶瘤腺病毒载体，本文通过体外实验对构建4种靶向FAP增殖型溶瘤腺病毒对胃癌相关成纤维细胞的选择性杀伤能力进行评估，并进一步观察不同给药途径对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效果。希望通过本研究为肿瘤间质治疗开辟一条新的途径，对于降低胃癌的复发率、减少死亡率、提高患者的生存质量以及减轻患者家庭的经济负担都具有重要的现实意义。方法和结果：1、纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体构建、重组及制备利用pShE1、pENTR-GF-LA、pAd Rc/delLA叁载体系统对腺病毒基因组进行重组，以SG600系统的穿梭载体（pSG502，由本课题组构建）为模板，通过PCR、酶切、连接等分子生物学方法，用CXCL12基因启动子（已克隆、测序并验证功能）替换原穿梭载体的腺病毒E1A基因启动子（即端粒酶逆转录酶启动子，hTERTp），同时保留E1B基因启动子（5×HRE及CMV），构建新的穿梭载体pShSDF-E1。利用In-Fusion位点特异性重组技术，在pENTR-GF-LA的SpeI位点处插入合成的FAP特异性识别肽段对应的碱基序列，得到pENTR/FAP；利用pAdRc/delLA中特异的酶切位点（AscI、XmaI等），通过PCR、酶切、连接等分子生物学方法，以嵌合型六联体基因（H5HVR48，全基因合成）替换Ad5原有的六联体基因，得到含有Ad48高变区的嵌合型六联体的腺病毒骨架质粒载体pAd5HVR48-Rc/delLA。利用高效的位点特异性重组（Gateway）技术，介导pENTR/FAP与pAd5HVR48-Rc/delLA之间的重组，利用ccdB的毒性作用和氨苄青霉素抗性筛选重组子，将改造好的腺病毒基因组的右端序列还纳到骨架质粒载体内，得到经纤毛蛋白修饰的六联体嵌合型重组腺病毒骨架质粒pAd5HVR48/FAP/delE1E3；将pShSDFpE1与pAd5HVR48/FAP/delE1E3共转染大肠杆菌E.coli BJ5183，进行细菌内同源重组，利用卡纳霉素抗性筛选重组子，得到E1A和E1B基因分别受CXCL12启动子和缺氧反应元件（HRE）调控、经纤毛蛋白修饰的六联体嵌合型重组腺病毒质粒pAd5HVR48/SDFp/FAP；验证正确的重组子，经限制性内切酶PacI充分消化，暴露腺病毒基因组两端的反向末端重复序列（ITR），用脂质体包裹后，转染腺病毒包装细胞株HEK293A，包装形成病毒颗粒，经叁次空斑纯化，得到靶向感染癌相关成纤维细胞并复制增殖的六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体pRCAdHVR48-SDF1p-P9/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-P9-4C/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-GP/EGFP，同时构建了相应的复制缺陷型（E1区缺失）腺病毒载体以及对照载体pRCAdHVR48-SDF1p-RGD-4C/EGFP（HI环内插入RGD-4C短肽序列）。对其进行大量扩增、CsCl密度梯度离心纯化后，TCID50法检测病毒滴度，-80℃冻存，备用。2、溶瘤腺病毒载体对CAFs感染、杀伤以及增殖能力检测GCAFs分离培养：取长海医院普外一科2012年4月-8月临床胃癌患者术后组织标本及癌旁组织（5例），利用胶原酶消化发分离、10%FBS-DMEM/F12培养基培养GCAFs及胃癌旁粘膜成纤维细胞（GPFs）。利用流式细胞技术（FACS）检测其FAP、CXCL12和整合素（αvβ3、αvβ5等）表达情况。病毒感染能力测定：取对数生长期的GCAFs细胞，接种六孔板，1×105/孔，分别按MOI=100加入4种复制缺陷型腺病毒，4℃孵育1h，冷PBS洗去未结合的病毒，换用5%FBS-DMEM/F12培养基。37℃5%CO2条件下孵育48h后，荧光显微镜下观察拍照，FACS检测EGFP表达情况。QIAamp试剂盒提取病毒基因组DNA，利用绝对定量PCR（SYBR Green法）检测腺病毒（E4区基因）拷贝数。以GAPDH作为内参照，以正常成纤维细胞株BJ作为阴性对照。Westenblot检测复制缺陷型腺病毒感染GCAFs后细胞裂解液中Hexon蛋白表达情况。在给予FAP抗体阻断后PCR检测及Westenblot检测均显示腺病毒结合水平明显下降。病毒增殖实验：取对数生长期细胞，铺6孔板（1×105/孔），37℃，5%CO2孵育24hr；换用无血清培养液，按MOI＝5分别加入病毒；2hr后换含5％血清培养液；分别收集病毒感染0hr、6hr、12hr、24hr、48hr和96hr的细胞及上清液；按标准的50%组织培养感染剂量（TCID50）法检测病毒滴度，与0hr的病毒滴度比较，得到病毒在感染细胞后不同时间的增殖倍数。荧光显微镜镜检观察病毒增殖情况：将携带绿色荧光EGFP报告基因的4种腺病毒以MOI=0.1分别转染正常细胞BJ、胃癌细胞及胃癌相关成纤维细胞，转染后第1、3、7、10天在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明在正常BJ细胞中绿色荧光持续单个、分散存在；而在胃癌细胞和胃癌相关成纤维细胞中随着时间延长，绿色荧光的表达由散在、单个存在逐渐变为集中、融合存在，并出现CPE现象。同时，可发现4种重组腺病毒在胃癌细胞及胃癌相关成纤维细胞中均存在复制、增殖，溶解细胞的过程。细胞杀伤能力检测：取对数生长期的GCAFs细胞，接种六孔板，1×105/孔，分别按MOI=1加入4种增殖型溶瘤腺病毒，分别于感染后3、7、10Days荧光显微镜下观察拍照。WST1检测溶瘤腺病毒对GCAFs的杀伤能力。3．增殖腺病毒治疗裸鼠移植瘤的疗效观察瘤内注射增殖型腺病毒治疗裸鼠原代胃癌移植瘤：取对数生长期的人原代胃癌细胞，胰酶消化后，PBS重悬、计数，并稀释成1×108/ml细胞悬液，接种于裸鼠皮下（100μl/只）。成瘤后，无菌条件下切取肿瘤组织，切成1mm3大小组织块，重新种植于裸鼠皮下，构建移植瘤裸鼠模型。待肿瘤生长至0.5cm3大小时，将其随机分为以下治疗组：在BALB/C小鼠右侧肋腹部皮下建立原代胃癌移植瘤模型，随机将成瘤裸鼠分为五组：RCAd5HVR48/SDFp/FAP-Ad/EGFP、RCAd5HVR48/SDFp/FAP-P9/EGFP、RCAd5HVR48/SDFp/FAP-P9-4C/EGFP、RCAd5HVR48/SDFp/FAP-GP/EGFP、同时设阴性对照组（注射PBS），n=5。除特别指出，所有溶瘤腺病毒治疗组的病毒剂量均为1×108pfu/100μl，采用单盲对照方法进行试验，溶瘤腺病毒载体及PBS均经系统途径给予，结果统计分析采用非配对t检验。实验结果表明四个治疗组同阴性对照组相比，能明显的抑制肿瘤生长，具有显着差异（P<0.01）。在四个治疗组中，GP、P9-4C、P9、Ad在整个治疗过程中对肿瘤杀伤效果程递减趋势（P<0.05）。常规病理切片检查发现治疗组同对照组相比，肿瘤组织中有大量坏死灶出现，免疫组化检查检测到病毒治疗组的瘤体组织内腺病毒Hexon蛋白表达，说明增殖腺病毒能在肿瘤细胞内增殖，明显抑制移植瘤的生长。结论：本文成功构建了纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体：pRCAdHVR48-SDF1p-Ad/EGFP、 pRCAdHVR48-SDF1p-P9/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-P9-4C/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-GP/EGFP，其可特异、高效地感染并杀伤GCAFs，且低肝脏亲嗜性、低免疫原性的溶瘤腺病毒载体，体外实验表明4种重组腺病毒可以选择性地在FAP阳性GCAFs及胃癌细胞中增殖、杀伤，而在正常细胞中基本不增殖，且4种腺病毒在感染能力和杀伤作用上由Ad、P9、P9-4C、GP逐渐增强，在FAP抗体阻断GCAFs表面FAP后，4种腺病毒结合GCAFs能力明显下降。用重组腺病毒治疗裸鼠胃癌移植瘤模型观察到明显的抗肿瘤作用。以上实验结果表明靶向FAP的重组腺病毒可靶向杀伤胃癌相关成纤维细胞及胃癌细胞，是一种有效且安全的溶瘤病毒，为胃癌的生物靶向治疗提供了一种新的策略，可取得更明显抗肿瘤疗效。(本文来源于《第二军医大学》期刊2013-05-01）
嵌合纤毛论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
胃癌目前在中国的发生率及死亡率仍明显高于世界平均水平，手术及化疗效果仍不尽如人意，缺乏特异性是胃癌治疗面临的一个主要问题，因此研发出新的肿瘤靶向机制的治疗方法显得非常必要。作为肿瘤赖以生存的土壤，肿瘤间质主要由细胞外基质、内皮细胞、免疫细胞以及肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts, CAFs）等组成。CAFs是其中最主要的组成部分，可以分泌肿瘤细胞生长所需的各种细胞因子、生长因子和粘附分子等，促进肿瘤细胞的增殖、分化；分泌多种蛋白酶，促进肿瘤细胞的扩散及转移；CAFs可以明显增强肿瘤细胞逃避机体免疫系统的打击能力，并可以增强肿瘤细胞对放、化疗的抵抗，成为肿瘤难治及复发的根源。此外，有研究表明，CAFs在维持适于肿瘤干细胞生存的微环境过程中也扮演着重要角色。由此可见，CAFs在肿瘤的发生、发展、复发、转移，乃至拮抗放、化疗等过程中都发挥着至关重要的作用。而CAFs具有两个显着特征使其区别于正常的成纤维细胞：首先，绝大多数上皮来源恶性肿瘤的CAFs表面均表达具有丝氨酸蛋白酶活性的成纤维细胞活化蛋白（FAP），其表达水平与肿瘤的恶性程度存在着明显的正相关，且FAP仅见于活化的成纤维细胞膜表面，正常组织、细胞不表达；其次，高表达具有细胞趋化作用的间质衍生因子CXCL12，该因子及其特异性受体（CXCR4、CXCR7）在肿瘤细胞的增殖、活化、肿瘤新生血管形成以及转移过程中都发挥着非常重要的作用。二者是肿瘤间质治疗的研究热点。由此，靶向CAFs进行肿瘤间质治疗，使肿瘤成为无本之木，是一种非常有前景的肿瘤治疗策略。但以往的研究多以小分子药物或单克隆抗体为主，不仅制备工艺复杂，且靶点相对单一，疗效有限。鉴于此，我们在本研究中引入了肿瘤间质生物治疗的概念，即利用溶瘤腺病毒特异性地杀伤CAFs。重组腺病毒是一种非常优良的载体，具有致病性低、不与宿主基因组整合（低致癌性）、可感染处于静止和非静止期的细胞、允许装载较大的外源DNA片段、基因表达谱及相应的蛋白功能的了解比较清楚以及易于大规模制备和纯化等诸多优点，被广泛应用于基因治疗的各个领域。但其在临床应用中仍存在一定限制，主要有：1、目前常用的腺病毒载体（C亚群的Ad2、Ad5）宿主范围广泛，对几乎所有的哺乳类动物细胞都有一定的感染能力，但靶向性欠佳；2、受细胞表面受体和整合素表达水平的限制，腺病毒对不同细胞组织的感染能力差别很大，对CAFs的感染效率较低；3、Ad2、Ad5虽有易于大规模制备的优点，但经系统途径给药时易在肝脏富集，导致其不仅难于到达肿瘤发生部位，还可能造成严重的肝毒性；4、CAFs的存在会明显减弱腺病毒的治疗效果；5、成人体内大多存在有针对Ad2、Ad5的中和抗体，系统途径给予腺病毒时易激发机体的免疫反应从而被清除。为此，我们拟在保留腺病毒固有优点的基础上，综合运用纤毛蛋白修饰、转录水平调控以及六联体嵌合等多种策略对腺病毒载体进行改造，构建一种可以特异、高效地感染并杀伤CAFs，且低肝脏亲嗜性、低免疫原性的溶瘤腺病毒载体，本文通过体外实验对构建4种靶向FAP增殖型溶瘤腺病毒对胃癌相关成纤维细胞的选择性杀伤能力进行评估，并进一步观察不同给药途径对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效果。希望通过本研究为肿瘤间质治疗开辟一条新的途径，对于降低胃癌的复发率、减少死亡率、提高患者的生存质量以及减轻患者家庭的经济负担都具有重要的现实意义。方法和结果：1、纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体构建、重组及制备利用pShE1、pENTR-GF-LA、pAd Rc/delLA叁载体系统对腺病毒基因组进行重组，以SG600系统的穿梭载体（pSG502，由本课题组构建）为模板，通过PCR、酶切、连接等分子生物学方法，用CXCL12基因启动子（已克隆、测序并验证功能）替换原穿梭载体的腺病毒E1A基因启动子（即端粒酶逆转录酶启动子，hTERTp），同时保留E1B基因启动子（5×HRE及CMV），构建新的穿梭载体pShSDF-E1。利用In-Fusion位点特异性重组技术，在pENTR-GF-LA的SpeI位点处插入合成的FAP特异性识别肽段对应的碱基序列，得到pENTR/FAP；利用pAdRc/delLA中特异的酶切位点（AscI、XmaI等），通过PCR、酶切、连接等分子生物学方法，以嵌合型六联体基因（H5HVR48，全基因合成）替换Ad5原有的六联体基因，得到含有Ad48高变区的嵌合型六联体的腺病毒骨架质粒载体pAd5HVR48-Rc/delLA。利用高效的位点特异性重组（Gateway）技术，介导pENTR/FAP与pAd5HVR48-Rc/delLA之间的重组，利用ccdB的毒性作用和氨苄青霉素抗性筛选重组子，将改造好的腺病毒基因组的右端序列还纳到骨架质粒载体内，得到经纤毛蛋白修饰的六联体嵌合型重组腺病毒骨架质粒pAd5HVR48/FAP/delE1E3；将pShSDFpE1与pAd5HVR48/FAP/delE1E3共转染大肠杆菌E.coli BJ5183，进行细菌内同源重组，利用卡纳霉素抗性筛选重组子，得到E1A和E1B基因分别受CXCL12启动子和缺氧反应元件（HRE）调控、经纤毛蛋白修饰的六联体嵌合型重组腺病毒质粒pAd5HVR48/SDFp/FAP；验证正确的重组子，经限制性内切酶PacI充分消化，暴露腺病毒基因组两端的反向末端重复序列（ITR），用脂质体包裹后，转染腺病毒包装细胞株HEK293A，包装形成病毒颗粒，经叁次空斑纯化，得到靶向感染癌相关成纤维细胞并复制增殖的六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体pRCAdHVR48-SDF1p-P9/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-P9-4C/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-GP/EGFP，同时构建了相应的复制缺陷型（E1区缺失）腺病毒载体以及对照载体pRCAdHVR48-SDF1p-RGD-4C/EGFP（HI环内插入RGD-4C短肽序列）。对其进行大量扩增、CsCl密度梯度离心纯化后，TCID50法检测病毒滴度，-80℃冻存，备用。2、溶瘤腺病毒载体对CAFs感染、杀伤以及增殖能力检测GCAFs分离培养：取长海医院普外一科2012年4月-8月临床胃癌患者术后组织标本及癌旁组织（5例），利用胶原酶消化发分离、10%FBS-DMEM/F12培养基培养GCAFs及胃癌旁粘膜成纤维细胞（GPFs）。利用流式细胞技术（FACS）检测其FAP、CXCL12和整合素（αvβ3、αvβ5等）表达情况。病毒感染能力测定：取对数生长期的GCAFs细胞，接种六孔板，1×105/孔，分别按MOI=100加入4种复制缺陷型腺病毒，4℃孵育1h，冷PBS洗去未结合的病毒，换用5%FBS-DMEM/F12培养基。37℃5%CO2条件下孵育48h后，荧光显微镜下观察拍照，FACS检测EGFP表达情况。QIAamp试剂盒提取病毒基因组DNA，利用绝对定量PCR（SYBR Green法）检测腺病毒（E4区基因）拷贝数。以GAPDH作为内参照，以正常成纤维细胞株BJ作为阴性对照。Westenblot检测复制缺陷型腺病毒感染GCAFs后细胞裂解液中Hexon蛋白表达情况。在给予FAP抗体阻断后PCR检测及Westenblot检测均显示腺病毒结合水平明显下降。病毒增殖实验：取对数生长期细胞，铺6孔板（1×105/孔），37℃，5%CO2孵育24hr；换用无血清培养液，按MOI＝5分别加入病毒；2hr后换含5％血清培养液；分别收集病毒感染0hr、6hr、12hr、24hr、48hr和96hr的细胞及上清液；按标准的50%组织培养感染剂量（TCID50）法检测病毒滴度，与0hr的病毒滴度比较，得到病毒在感染细胞后不同时间的增殖倍数。荧光显微镜镜检观察病毒增殖情况：将携带绿色荧光EGFP报告基因的4种腺病毒以MOI=0.1分别转染正常细胞BJ、胃癌细胞及胃癌相关成纤维细胞，转染后第1、3、7、10天在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明在正常BJ细胞中绿色荧光持续单个、分散存在；而在胃癌细胞和胃癌相关成纤维细胞中随着时间延长，绿色荧光的表达由散在、单个存在逐渐变为集中、融合存在，并出现CPE现象。同时，可发现4种重组腺病毒在胃癌细胞及胃癌相关成纤维细胞中均存在复制、增殖，溶解细胞的过程。细胞杀伤能力检测：取对数生长期的GCAFs细胞，接种六孔板，1×105/孔，分别按MOI=1加入4种增殖型溶瘤腺病毒，分别于感染后3、7、10Days荧光显微镜下观察拍照。WST1检测溶瘤腺病毒对GCAFs的杀伤能力。3．增殖腺病毒治疗裸鼠移植瘤的疗效观察瘤内注射增殖型腺病毒治疗裸鼠原代胃癌移植瘤：取对数生长期的人原代胃癌细胞，胰酶消化后，PBS重悬、计数，并稀释成1×108/ml细胞悬液，接种于裸鼠皮下（100μl/只）。成瘤后，无菌条件下切取肿瘤组织，切成1mm3大小组织块，重新种植于裸鼠皮下，构建移植瘤裸鼠模型。待肿瘤生长至0.5cm3大小时，将其随机分为以下治疗组：在BALB/C小鼠右侧肋腹部皮下建立原代胃癌移植瘤模型，随机将成瘤裸鼠分为五组：RCAd5HVR48/SDFp/FAP-Ad/EGFP、RCAd5HVR48/SDFp/FAP-P9/EGFP、RCAd5HVR48/SDFp/FAP-P9-4C/EGFP、RCAd5HVR48/SDFp/FAP-GP/EGFP、同时设阴性对照组（注射PBS），n=5。除特别指出，所有溶瘤腺病毒治疗组的病毒剂量均为1×108pfu/100μl，采用单盲对照方法进行试验，溶瘤腺病毒载体及PBS均经系统途径给予，结果统计分析采用非配对t检验。实验结果表明四个治疗组同阴性对照组相比，能明显的抑制肿瘤生长，具有显着差异（P<0.01）。在四个治疗组中，GP、P9-4C、P9、Ad在整个治疗过程中对肿瘤杀伤效果程递减趋势（P<0.05）。常规病理切片检查发现治疗组同对照组相比，肿瘤组织中有大量坏死灶出现，免疫组化检查检测到病毒治疗组的瘤体组织内腺病毒Hexon蛋白表达，说明增殖腺病毒能在肿瘤细胞内增殖，明显抑制移植瘤的生长。结论：本文成功构建了纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体：pRCAdHVR48-SDF1p-Ad/EGFP、 pRCAdHVR48-SDF1p-P9/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-P9-4C/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-GP/EGFP，其可特异、高效地感染并杀伤GCAFs，且低肝脏亲嗜性、低免疫原性的溶瘤腺病毒载体，体外实验表明4种重组腺病毒可以选择性地在FAP阳性GCAFs及胃癌细胞中增殖、杀伤，而在正常细胞中基本不增殖，且4种腺病毒在感染能力和杀伤作用上由Ad、P9、P9-4C、GP逐渐增强，在FAP抗体阻断GCAFs表面FAP后，4种腺病毒结合GCAFs能力明显下降。用重组腺病毒治疗裸鼠胃癌移植瘤模型观察到明显的抗肿瘤作用。以上实验结果表明靶向FAP的重组腺病毒可靶向杀伤胃癌相关成纤维细胞及胃癌细胞，是一种有效且安全的溶瘤病毒，为胃癌的生物靶向治疗提供了一种新的策略，可取得更明显抗肿瘤疗效。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
嵌合纤毛论文参考文献
[1].刘甜恬.人3、7和55型腺病毒叁价疫苗候选株及纤毛蛋白嵌合型重组人3型腺病毒的研究[D].广州医科大学.2018
[2].庞涛.靶向胃癌相关成纤维细胞的纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体的实验研究[D].第二军医大学.2013