王安宇徐寒松杨传经赵胜乔艺杰（贵阳中医学院第二附属医院代谢内分泌二科550003）
【摘要】目的：观察糖尿病足基因谱表达特征及其对丹黄散治疗的反应。方法：获取糖尿病足溃疡局部组织，和丹黄散外敷治疗后糖尿病足组织作比较，以OligoGEArray.芯片检测两组溃疡组织基因表达谱，比较分析基因表达谱差异。结果：丹黄散治疗组涉及表达上调基因30个，表达下调基因4个。结论：糖尿病足溃疡组织涉及启动基因、效应基因及信号转导基因表达异常，经过丹黄散治疗后，异常表达基因可得以调控。
【关键词】糖尿病足基因谱治疗
【中图分类号】R587.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）05-0022-03
糖尿病足是糖尿病的一个严重并发症，其病程长，病情重，医疗费用巨大，临床疗效较差。目前以改善微循环、抗感染等作为经典治疗方法已使其临床疗效大为提高，但仍有相当高的截肢致残率。糖尿病足属于中医“脱疽”范畴，病机为血瘀毒蕴、痹阻经络，中医外治法以其无创、无痛苦、少污染、低毒副作用等优势逐渐成为中医治疗“脱疽”的一大特色。丹黄散由丹参、大黄等五味中药组成，具有活血、除痹、解毒、生肌之功效，临床疗效显著。为系统研究丹黄散临床疗效，并探讨其作用机制。笔者对丹黄散治疗后的糖尿病足溃疡组织进行基因芯片检测，并和治疗前的糖尿病足组织做对照，以分析其基因表达谱特征，现作报告如下：
1材料与方法
1.1材料
1.1.1标本来源标本取自贵阳中医学院第二附属医院代谢与内分泌科2007年10月-2008年9月糖尿病足患者9例，年龄31—72岁，糖尿病足病史1周-4月，男性6例，女性3例。其中伴发高血压者5例，伴发脂代谢率乱者3例，伴发高尿酸血症/痛风者2例。病例入选后，5例在常规改善微循环和抗感染治疗基础上，予丹黄散外敷治疗；4例则在常规治疗上，予生理盐水、胰岛素、山莨菪碱、庆大霉素浸湿棉纱外敷；本组拟探讨丹黄散作用机制，选择了丹黄散治疗组和分组前糖尿病足溃疡组织作为对照。所获组织分装于不同冷冻管中，液氮速冻。
1.1.2主要试剂及仪器OligoGEArray.芯片由上海康成生物公司提供，标本RNA提取，基因芯片杂交以及图像分析均在上海康成生物公司完成。
1.2方法
1.2.1总RNA提取按Trizol试剂盒说明书进行，经DNaseⅠ消化去除DNA，行两相分离，RNA沉淀，RNA清洗，重新溶解RNA沉淀并保存于-70℃备用。
1.2.2RNA质量检测紫外吸收测定法检测RNA纯度和浓度，使用NanoDrop.ND-1000进行操作；变性琼脂糖凝胶电泳检测28S和18S核糖体RNA带。
1.2.3cRNA标记与合成根据TrueLabeling-AMP.线性RNA扩增试剂盒和SuperArrayArrayGradecRNA纯化试剂盒说书进行cDNA合成；cRNA合成，标记和扩增；cRNA纯化；质量控制。
1.2.4芯片杂交1）预杂交，60°C预热GEAhyb杂交液，杂交管放在杂交炉中，以转速5-10rpm60°C预杂交1到两小时；2）杂交，加入4到20μg用TrueLabeling-AMP试剂盒制备的生物素标记的cRNA样品至0.75ml预热的GEAhyb杂交液中，混合均匀放于60°C，弃去杂交管中的预杂交液，加入含有标记的cRNA的样品杂交液，于60°C保持5到10rpm旋转杂交过夜；3）洗膜，配制洗液1：2XSSC,1%SDS（混合10ml20XSSC,5ml20%SDS,和85mlddH2O）、洗液2：0.1XSSC,0.5%SDS（混合0.5ml20XSSC,2.5ml20%SDS和97mlddH2O），并预热至60°C。加入5ml洗液1至杂交管中，60°C20到30rpm转动洗膜15分钟，弃去洗液。加入5ml洗液2至杂交管中，60°C20到30rpm转动洗膜15分钟，弃去洗液。盖上杂交管盖以保持膜湿润，冷却至室温。
1.2.5化学发光检测根据化学发光检测试剂盒ChemiluminescentDetectionKit(SuperArrayBioscience,CatalogNumberD-01)操作说明书进行。1）膜封闭：最后一次洗膜后，弃去洗液，立刻加入1.5mlGEAb封闭液Q，在杂交仪中30到40rpm孵育40分钟。2）加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶：弃去杂交管中的GEA封闭液Q，加入2ml结合缓冲液，在杂交仪中轻轻摇动孵育10分钟；3）洗膜：洗膜4次：加入4ml的1×缓冲液F温和振荡5分钟，弃去1×缓冲液F。加入3ml缓冲液G温和震荡分钟；倒掉，再用3ml缓冲液G重复洗一次；4）检测：加入1.0mlCDP-Star化学发光底物至杂交管中，室温孵育2分钟。取出膜，放在一张滤纸上以去除多余的CDP-Star溶液，然后用干净的塑料膜两面包住，驱除气泡，用X-射线胶片曝光。
1.2.6图像采集和数据分析使用CDP-Star孵育过后，芯片即
可用于图像采集，使用综合型GEArray表达分析配套软件（GEArrayExpressionAnalysisSuite）进行完整的芯片数据分析。
2结果
2.1紫外分光法测定RNA纯度及浓度(ODA260/A280值2.0左右，O.D.A260/A230值超过1.8为合格)表1
Table1RNAQuantificationandQualityAssurancebyNanoDropND-1000（Forspectrophotometer,theO.D.A260/A280ratioshouldbecloseto2.0forpureDNA(ratiosbetween1.8and2.1areacceptable).TheO.D.A260/A230ratioshouldbemorethan1.8）
2.1紫外分光法测定RNA纯度及浓度(ODA260/A280值2.0左右，O.D.A260/A230值超过1.8为合格)表1
2.2各组织RNA电泳结果
图1各组织总RNA1.5%琼脂糖凝胶电泳结果
Figure1ElectrophoresisresultoftotalRNAindifferenttissuesby1.5%agarose
1danhuangsangroup2diabeticfootgroup;
各组织总RNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳都显清晰的28S和18S区带，表明所提取的总RNA具有良好的完整性和均一性。
2.3各组织基因表达谱
将各组织RNA所标记的cDNA所标记的探针分别基因芯片杂交后，经洗膜、显影及图像采集后，如下图所示：
图2丹黄散组图3糖尿病足组
Figure2HybridizationresultoftotalRNAindiabeticfoottreatedwithdanhuangsanongenechip
Figure3HybridizationresultoftotalRNAindiabeticfoottissueongenechip
2.4各组织基因表达谱的差异
将X光片经图像扫描后，使用综合型GEArray表达分析配套软件（GEArrayExpressionAnalysisSuite）进行完整的芯片数据分析，选出表达最为明显的、有差异的基因（见表2、表3）。丹黄散治疗组中有白细胞介素、生长分化因子、肿瘤坏死因子等30个基因表达上调；有白细胞介素4、白细胞介素7等4个基因表达下调。
表2丹黄散治疗组中表达上调的基因
Table2Genesup-regulatedindiabeticfoottreatedwithdanhuangsanp
表3丹黄散治疗组中表达下调的基因
Table3Genesdown-regulatedindiabeticfoottreatedwithdanhuangsan
3讨论
糖尿病足是一个糖尿病患者中常见的严重并发症，是糖尿病患者截肢、致残的主要原因。现代医学认为，糖尿病足其病机涉及血管病变、神经病变和感染，在以上三大致病因素相互交叉、重叠和放大下，使得糖尿病足病成为一个不断进展的恶性循环。最终损及神经、肌腱甚至骨髓乃至截肢。当然，历经多年的科研以及临床工作都得以证实，彻底清创是糖尿病足获得良好控制的第一步，同时，营养神经在糖尿病足的治疗中也占有重要地位。在此基础上，近年发展起来了各种个体化的矫形防护鞋对患足进行有效防护，可以明显改善患者生活质量。以及外科血管移植术以及跟腱延长术的开展，使部分难治性糖尿病足也得到了有效控制，传统治疗方法如降血糖、清创、消炎、改善微循环治疗对多数糖尿病足患者有效，但在临床观察中发现，部分患者在现有治疗手段干预下，不能有效减少溃疡面、缺乏新鲜肉芽组织生长。在前期研究中业已证实，糖尿病足的发生发展涉及多基因、多靶点的改变，要想在某一点、某一通道甚至某一层面上阻断糖尿病足进展，从理论上和临床中都难以实现。多层次、多靶点的改变，病因的复杂性，临床表现的不一致性，势必要从多靶点上进行干预，中药复方成分复杂，多途径作用的特点使其在这一类疾病的治疗中占有优势。
丹黄散是本科在临床中常用于糖尿病足外敷的中药复方散剂，临床应用时间长，具有明确临床疗效。在常规治疗基础上联合应用丹黄散，能刺激肉芽组织增生，减少溃疡创面分泌物，促进溃疡创面修复。丹黄散由丹参、大黄、沉香、没药、松香组成，具有活血化瘀、解毒生肌功能。现代药理研究认为，其中，丹参具有扩张血管[1]、改善微循环[2]、抗菌消炎作用[3]。大黄能明显抑制巨噬细胞分泌细胞因子，且随时间延长和浓度增加而加强[4]。大黄对多种细胞和病毒有抑制作用[5]。沉香具镇痛、抑菌作用[6]。没药也具镇痛作用，还能促进粘膜再生[7]。当归能抗血栓，抗血小板集聚，减少血粘度，提高单核吞噬细胞系统的吞噬功能[8]。
本研究采用的基因芯片技术具有信息量大、操作可靠、可重复等优点，已成功用于基因表达检测、DNA测序、寻找新基因、诊断疾病等研究领域[9]。实验通过对糖尿病足溃疡组织和丹黄散外敷治疗后组织进行基因芯片技术筛查，找出差异基因，探讨丹黄散发挥临床疗效可能的分子机制。通过对比发现，和糖尿病足组相比，丹黄散治疗组溃疡组织中有表达上调基因30个，有表达下调基因4个。这些差异表达基因中，涉及细胞分化、信号转导、转化生长因子受体通道、诱导调亡、炎症反应、肿瘤坏死因子受体等。
集落刺激因子1和生长分化因子3、生长分化因子10诱导细胞生长分化和组织增生，在糖尿病足组织中较正常组织中表达水平增高，而在丹黄散干预后，上调的基因表达非但没有下调，反而较糖尿病足中基因表达进一步上调，通过对糖尿病足的自然病程和丹黄散临床疗效的观察推测，在糖尿病足中，由于溃疡局部感染，炎症反应强烈，导致炎细胞大量浸润并分泌了大量的细胞因子，而在丹黄散干预后，进一步上调了集落刺激因子及生长分化因子水平，则诱导了细胞生长分化及组织的修复，表达为肉芽组织增生以及溃疡面的愈合。丹黄散干预后，在糖尿病足组织中表达下调的IL-16在丹黄散组中表达明显上调，IL-16能趋化CD4+T细胞、单核细胞和嗜酸性淋巴细胞，IL-16的低表达，导致了机体对免疫应答的辅助和调节作用减弱。而丹黄散作用后，组织修复加快伴随IL-16水平上调，使机体免疫调节能力得以加强，以利于溃疡愈合。
丹黄散作用后，糖尿病足组中表达上调IL-4、IL-7、IL-26以及IK基因均表达下调。IL-4可致感染恶化。IL-4促进Th2细胞的成熟，易感的小鼠因IL-4占优势，而感染会越来越严重[10]。同时，IFN-γ基因表达水平上调，表明体内Th1/Th2的平衡得以重新调节。IL-7是T细胞代谢的一个重要调控子。通过调控T细胞的增殖分化进而达到影响内环境中炎症反应的转归。IL-26则参与了炎症反应，丹黄散作用后，炎症得以控制而表现为IL-26基因表达下调。
实验结果初步表明，糖尿病足溃疡局部分子病理基础影响糖尿病足病程及预后，这种病理改变可因糖尿病足常规治疗联合中药丹黄散外用得以纠正。
参考文献
[1]沈映君.中药药理学.北京:人民卫生出版社,2000:632-634.
[2]ULUBELENA,OKSZS,KOLAKU,eta.lCardioactiveterpenoidsandanewrearrangedditerpenefromSalviasyriaca.PlantaMed,2000,66(7):627-629.
[3]孙吉兰,常云亭,宋海英,等.丹参的体外抑菌作用研究.时珍国医国药,2003,14(12):725.
[4]郑虎占，董泽宏，佘靖.中药现代研究与应用。.北京，学苑出版社：1999：89
[5]黄敬耀，药理学。.北京，人民卫生出版社。2006：304
[6]欧明.简明中药成分手册.北京:中国医药科技出版社,2003∶194
[7]万文珠，娄红祥.没药的化学成分和药理作用。国外医药.植物药分册，2005，20（5）：236-241
[8]中国医学科学院药物研究所.中草药现代研究(Vol2)北京:北京医科大学-中国协和医科大学联合出版社,1996:11,26,45.
[9]GeritD,Mulder.Diabeticfootulcers:oldproblems-newtechnologies.NephrolDialTransplant2001;16:695-698.
[10]谷美龄，李亦梅，郑宏．INF-γ，IL-4在寄生虫感染免疫中作用的研究进展．地主病通报，2010，25（3）：69-71