导读:本文包含了双元调控系统论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:金黄色葡萄球菌,VraSR,基因敲除,致病性
双元调控系统论文文献综述
高彩虹,戴媛媛,常文娇,马筱玲[1]（2019）在《金黄色葡萄球菌二元调控系统vraSR基因敲除菌株的构建及其致病性研究》一文中研究指出利用基因敲除及基因回补技术构建异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌标准菌株(Mu3)vraSR基因敲除株(ΔvraSR)及基因回补株(CΔvraSR),使用小鼠皮肤脓肿形成模型研究VraSR在金黄色葡萄球菌致病性中的作用。PCR及RT-PCR验证vraSR基因敲除株及其回补株构建成功。与野生株Mu3比较,ΔvraSR菌株小鼠皮肤脓肿面积显着减小(P<0.001),皮肤组织荷菌量明显减低(P<0.01),皮肤组织病理损伤减轻。CΔvraSR株可以恢复致病性。VraSR可增加金黄葡萄球菌的致病性。(本文来源于《安徽医科大学学报》期刊2019年10期）
高彩虹[2]（2019）在《万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌二元调控系统VraSR在细菌致病性中的作用研究》一文中研究指出目的万古霉素中介金葡菌(VISA)和异质性万古霉素中介金葡菌(h-VISA)通常伴有毒力和生物膜等多个生物学表型特征的改变,这些变化可使细菌在体内长期存活,导致感染反复发作。Vra SR是金葡菌万古霉素耐药相关二元调控系统。有研究显示,vra SR的表达水平在h VISA/VISA中明显上升。通过前期研究,我们发现Vra R蛋白可直接与金葡菌全局调控子agr启动子区域结合,提示Vra SR可能具有广泛的调控作用。本文重点探讨Vra SR在h VISA/VISA致病性中发挥的作用,以期为基于Vra SR的h VISA/VISA感染诊断和临床治疗提供理论依据。方法(1)利用基因敲除及基因回补技术构建异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌标准菌株(Mu3)vra SR基因敲除株(Δvra SR)及基因回补株(CΔvra SR),采用q RT-PCR验证构建是否成功。(2)生物表型研究:用分光光度计检测金黄色葡萄球菌的生长情况,绘制生长曲线;E-test方法检测万古霉素MIC值;稀释法定量检测溶血素活力和凝固酶活力;通过电子显微镜观察细菌细胞壁厚度;与人宫颈癌上皮细胞共培养观察细菌粘附能力;微孔板成膜法和激光共聚焦显微镜法检测细菌的生物膜形成能力;体外中性粒细胞吞噬及杀伤实验检测细菌抗吞噬及抗杀菌能力。q RT-PCR的方法检测粘附相关基因(fnb A,fnb B,clf A,ebps,sbi)、细胞壁合成相关基因(cap5K,cap5N,nan A,tag A,mur D)的转录水平。结果1.成功构建vraSR基因敲除株及其回补株,q RT-PCR证实ΔvraSR中vraSR基因的转录完全缺失,对Δvra SR的质粒回补回复了vra SR基因的转录。2.Mu3中vra SR基因的缺失对金葡菌生物表型的影响:(1)与Mu3相比,Δvra SR对金葡菌的生长未造成明显影响;(2)Mu3、Δvra SR和CΔvra SR万古霉素MIC值分别为1.5μg/ml、0.38μg/ml、1.5μg/ml,与Mu3相比,Δvra SR菌株万古霉素MIC值下降了3.95倍。CΔvra SR株能回复万古霉素的MIC值;(3)Δvra SR与Mu3相比溶血素活力和凝固酶活力无统计学差异(P>0.05);(4)Δvra SR菌株细胞壁合成能力下降,Mu3和Δvra SR细胞壁平均厚度分别为18.53±2.84 nm和26.64±3.07nm(p<0.01).CΔvra SR株能回复细胞壁合成能力,其细胞壁平均厚度为23.32±3.59 nm(p<0.01);(5)与Mu3相比,Δvra SR粘附He La细胞的能力降低(LOG10 CFU/ml,5.75±0.43 Vs 3.53±0.71,p<0.01),CΔvra SR能回复对Hela细胞的黏附能力(LOG10CFU/ml5.20±0.36,p<0.05)。(6)Δvra SR菌株生物膜合成能力下降,Mu3和Δvra SR生物膜平均厚度分别为7.38±1.4μm Vs 14.44±1.65μm,(p<0.001)。CΔvra SR能回复生物膜的合成能力(9.35±1.37μm,p<0.01)(7)与Mu3相比,Δvra SR更易被中性粒细胞吞噬和杀伤,Mu3与Δvra SR吞噬率分别为47.75±2.56%和71.29±2.55%(p<0.001),吞噬指数分别为1.65±0.16和3.11±0.32(p<0.01),在中性粒细胞中细菌的存活量分别为5.56±0.63 Vs 2.73±0.50(LOG10 CFU/ml)(p<0.001)。(8)与Mu3相比,Δvra SR菌株中粘附相关基因fnb A,fnb B,clf A,ebps,sbi和细胞壁合成相关基因cap5K,cap5N,nan A,tag A,mur D的转录水平均表现为下调,且差异有显着性(p<0.05),CΔvra SR株能回复黏附基因和细胞壁合成相关基因的表达。结论二元调控系统Vra SR在h VISA/VISA致病性中发挥重要作用。Vra SR可以增加金葡菌对万古霉素的耐药,促进金葡菌粘附上皮细胞及合成细胞壁、增强生物膜形成。增强金葡菌抵抗人中性粒细胞的吞噬及杀菌,协助金葡菌逃避人免疫系统的攻击,有利于其在体内的生存。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2019-03-01）
刘瑞,祁克宗,薛媚[3]（2017）在《PhoP/Q二元调控系统对APEC抗AMPs侵袭的相关基因调控研究》一文中研究指出研究目的:禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是禽类大肠杆菌病的主要病原微生物,也是人兽共患病的潜在病原体。PhoP/Q二元调控系统调控大多参与脂多糖(LPS)结构修饰的基因,以免受宿主抗菌肽的侵袭。为了进一步探究PhoP/Q二元调控系统调控APEC抗抗菌肽侵袭的作用机制。材料方法:本实验研究了PhoP/Q基因缺失对APEC抗抗菌肽侵袭能力的影响,并应用基因芯片技术筛选出PhoP/Q可能调控APEC抗抗菌肽的相关基因。结果:结果显示,以差异倍数绝对值在2倍及以上为标准,筛选出差异表达基因2200个。GO分类结果显示,有810个差异基因得到GO分子功能注释,其中这些基因中502个是涉及到催化活性过程的差异基因,主要富集到水解酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、裂解酶活性、连接酶活性等催化活性功能。从中筛选出5个可能在PhoP/Q二元调控系统调控脂多糖的结构修饰增强APEC抵抗AMPs能力中具有重要影响的相关基因。讨论:以上结果表明二元调控系统PhoP/Q在APEC抗AMPs中起着重要作用。研究禽致病性大肠杆菌PhoP/Q二元调控系统与抗菌肽之间的关系,不仅有利于研究禽致病性大肠杆菌的致病性和抗宿主防御的作用机制,更对开发抗生素替代品、养禽业和人类公共卫生都具有重要意义。(本文来源于《中国兽医病理学2017年学术研讨会暨兽医病理学分会第九次全国会员代表大会论文集》期刊2017-07-28）
蔡文通[4]（2017）在《尿路致病性大肠杆菌中一个新的二元调控系统的鉴定及其调控机理和生物学功能的研究》一文中研究指出尿路感染是人类最常见的细菌感染之一。它的定义为:病原生物入侵尿路引起的尿路炎症反应。被感染的部位一般包括尿道、膀胱、输尿管、肾脏肾盂等。临床数据表明:高达90%的尿路感染是由尿路致病性大肠杆菌(UropathogenicEscherichia coli,UPEC)引起的。到目前,很多毒力因子被确定在UPEC感染的过程中起到不可或缺的作用。与肠道内共生的和致腹泻的大肠杆菌相比,尿路致病性大肠杆菌的生活环境非常特殊,如尿液对于UPEC来说是营养贫瘠、有胁迫的环境。UPEC如何感应特殊的宿主环境并启动适合的应对机制在当前仍然是一个不太清楚的问题。由于二元调控系统是细菌适应环境的重要机制,本文着重研究UPEC内的二元调控系统,具体内容分为以下叁部分:1与尿路致病型相关的KguS/KguR的调控机理研究及其对UPEC致病性的影响二元调控系统(Two-component signaling systems,TCS),又被称为双组份调控系统,是细菌适应环境的重要机制。因此,二元调控系统对于病原菌适应宿主环境应该起到至关重要的作用。于是,我们通过生物信息学的方法对UPEC的多个菌株的基因组进行分析,预测得到UPEC基因组内所有的TCS,以期待可以发现新的未研究过的TCS系统。结果显示:除了 30个大肠杆菌菌株共有的TCS外,还发现c3564/c3565、c4545/c4546和c5041/c5040为非致病性大肠杆菌菌株中很少存在的。最终,我们选择了c5041/c50 0进行下一步、深入的研究。通过对预测得到的C5041/C5040的叁维结构和各结构域的分析,我们在肾盂肾炎分离株UPEC CFT073中鉴定了一个新的二元调控系统 C5041/C5040,并命名为 KguS/KguR(KguS:α-ketoglutarate utilization sensor;KguR:α-ketoglutarate utilization regulator)。通过双重PCR对多种致病型的大肠杆菌的菌种库进行检测发现:kguS/kguR与尿路致病性的大肠杆菌关联紧密,而在非致病性和肠道致病的大肠杆菌中却鲜有发现。利用小鼠尿路感染模型,体内竞争试验显示缺失kguS/kguR造成UPEC在小鼠膀胱和肾脏内定殖显着下降,暗示KguS/KguR具有增加UEPC在体内的适应力的能力。利用比较蛋白组学方法我们找到了 KguS/KguR的多个靶基因,如外膜蛋白(OmpA、OmpW、OmpF)、木糖异构酶XylA、铁结合蛋白SitA以及假定的α-酮戊二酸代谢酶C5035。我们进一步研究发现上调表达KguR可以激活c5035的表达。序列分析发现kguS/kguR和其靶基因c5032到c5039编码在一个基因岛上,而这个基因岛并不存在于肠道致病性大肠杆菌中,暗示这个基因簇很有可能是通过基因水平转移获得的,同时,再次说明其对UPEC的重要性。而且,缺失这个基因岛也会导致UPEC在体内竞争力的下降,说明KguSR影响UPEC的定殖很有可能是由c5032到c5039基因簇介导的。反转录-PCR结果显示上述提到的基因岛编码3个操纵元,分别为:c5032-c5037、c5038-c5039、c5040-c5041。靶基因的表达特异的被α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)所诱导。这些基因与α-KG作为唯一碳源的无氧利用有关。通过凝胶阻滞试验(EMSA),我们发现KguS/KguR直接正调控c5032到c5039靶基因簇,并参与到α-KG的无氧利用中。最后,进化发育分析表明:kguS/kguR很有可能是通过基因水平转移的方式获得的,而且这个基因位点(loci)具有横向转移的潜力。α-KG是哺乳动物肾脏肾小管细胞中高度积累的物质,用于和有机阴离子进行跨膜交换,进而将它们以尿液的形式排出体外,是肾脏生理功能重要的一部分。所以,上述试验结果暗示了 α-KG的利用对UPEC的重要性,而这个能力促进了 UPEC在肾脏的定殖。综上所述,这一部分内容第一次描述了 一个与UPEC关联紧密的TCS;这个TCS与它的靶基因一起参与在无氧条件下对a-KG利用,进而增加UPEC在体内的适应能力。2 α-酮戊二酸转运蛋白C5038和KgtP在UPEC中的作用α-酮戊二酸广泛存在于宿主细胞,尤其是肾小管细胞中,并且很容易被UPEC利用。这一部分探究了两个转运蛋白C5038和KgtP在利用α-KG上起到的作用、它们的转录调控以及它们对UPEC体内适应性的影响。与UPEC密切相关的c5038很可能是通过基因水平转移获得的,C5038属于DASS(Divalent anion sodium symporter)家族。它与柠檬酸转运蛋白CitT具有49%的氨基酸序列相似性,TMHMM算法预测它含有13个跨膜区域。它含有的SAT序列很可能与α-KG的转运直接相关。kgtP则是相对保守的、广泛存在于致病性和非致病性大肠杆菌中的基因位点,KgtP蛋白属于MFS(Major facilitator superfamily)家族,具有12个跨膜区域。c5038的表达被低氧分压诱导,而kgtP的表达被低氧分压所抑制。无氧条件下,c5038被FNR和ArcA正调控,c5038在α-KG的无氧利用中担当重要角色;而KgtP对于α-KG的有氧利用是必需的,但是它的表达在无氧条件下被FNR和ArcA严重抑制。c5038通过二元调控系统KguSR直接或间接感应低氧分压:kguSR的表达在无氧条件下升高,而低氧分压对c5038的诱导需要kguSR的参与。c5038能被α-KG特异的诱导表达,而kgtP的表达对外界添加的KG没有反应。但是kgtP的表达在M9基本培养基中、以甘油为唯一碳源的时候最高,其次为葡萄糖,最低的是在LB中。与碳源利用有关的CRP蛋白正调控kgtP的表达。此外,我们发现c503和和kgtP的表达受不同的sigma因子控制:分别为σ54(RpoN)和a38(RpoS)。当被相同的组成型启动子驱动时,C5038在无氧环境中效率更高而KgtP在有氧条件时效率更高。在尿路感染的小鼠模型上,当共同感染野生型和c5038突变株或kgtP突变株时,结果显示c5038影响而kgtP并不影响UPEC在体内的适应能力;这种影响是可以被质粒上表达的c5038所恢复的。综上所述,转录水平调控的不同使得C5038和KgtP在KG的利用上发挥的作用不同,进而导致它们在体内的作用不同。所以,这一部分的研究加深了我们对尿路致病性大肠杆菌生理和毒力的理解。3 KguR调控的分子机理初探本部分试图找出KguR在转录水平直接调控的更多靶基因(由于KguR是转录调控因子),从而对KguR的调控方式作更全面的了解。我们首先对c5038的启动子区域进行了分析,然后利用逐渐缩短启动子并测定启动子活性的方法找到了最短的有活性的启动子Pc5038F3R。接着,在Pc5038F3R区域我们找到了一个反向重复序列TGTGCG-N8-CGCACA。EMSA、启动子-报告基因融合和β-半乳糖苷酶活性测定试验 ·发现反向重复序列区域是被KguR直接结合的,并且极大的影响启动子的活性。但是,缺失反向重复序列区域并没有完全破坏KguR的诱导作用。此外,我们在c5032和kguS的启动子区域也发现了类似的序列,分别为TGTGTG-N13-CGCGCA和TGTGCG-N6-CACACA。缺失相应的区域都大幅的降低了 KguR对DNA探针的结合。KguR可以自调控kguSR操纵元,这种自调控很可能依赖于结合到上述的位点上。而且,这些结合位点在大肠杆菌中都非常保守。所以,我们利用这些序列生成了结合的通用序列,进一步利用生物信息学的方法,在CFT073的基因组内进行搜索、匹配。结果显示,有20个位点被筛选出来;有的在基因的编码区,有的在基因间区,即可能为启动子区。总之,本文系统性的阐述了二元调控系统KguSR的鉴定,通过揭示KguSR及其靶基因的功能,解释了这套系统增加UPEC体内适应性的机制。(本文来源于《南京农业大学》期刊2017-06-01）
柯少林[5]（2017）在《石墨烯非厄米系统中的表面等离激元调控》一文中研究指出表面等离激元(surface plasmon polaritons,SPPs)是在金属和电介质交界面上传播的电磁波。因其能够突破衍射极限和实现局域场增强,所以得到了广泛的研究,是实现集成光子器件小型化的重要解决方案。以贵金属如金银为载体的表面等离激元,只能工作在可见光和近红外波段,并且结构加工完成之后难以调节。在寻求新的能够支持表面等离激元材料的过程中,人们发现在红外到太赫兹波段,石墨烯都能够支持表面等离激元。相比于金属,石墨烯表面等离激元具有更强的模场局域性,可以将光束缚在深亚波长;高质量的石墨烯具有更小的材料损耗,并且石墨烯的表面电导率可以通过电学或者化学掺杂的方法进行调节。在亚波长尺度对结构折射率进行排布,是调控表面等离激元及其传播的重要途径。在以往的结构的设计中,主要集中于对折射率的实部进行调制,忽略了材料折射率的虚部,即损耗和增益。当材料具有损耗或者增益时,系统的能量不再守恒,为非厄米系统。在非厄米系统的研究中,人们同时对折射率的实部和虚部进行调控,发现了很多新奇的光学现象,为表面等离激元器件的设计提供了新思路。由于电子在运动过程中会受到晶格的散射,石墨烯具有材料损耗;通过光学泵浦等方法可以实现粒子数反转进而实现石墨烯的材料增益。因此,研究损耗和增益对石墨烯表面等离激元的影响具有重要的意义。本文的研究内容包括以下四个方面:(1)提出了利用十字形石墨烯周期阵列实现对远红外和太赫兹波增强吸收的方案。周期阵列和入射光可以产生表面等离激元共振,能形成很强的局域电磁场,进而增强石墨烯的吸收率。研究表明,当十字形臂宽增大时,即使石墨烯占有率低,石墨烯阵列的吸收率也可以远远超过单层连续的石墨烯。吸收会随着石墨烯化学势和电子动量弛豫时间的增大进一步地提高。互补结构的吸收率比原结构更大。此外,增加石墨烯阵列的层数也可以显着地增加吸收,利用双层结构还可以实现双带和宽带吸收。(2)基于绝热通道(adiabaticpassage),研究了间距缓变的叁层石墨烯波导中表面等离激元的耦合,并重点分析了非厄米的影响。当不考虑石墨烯损耗时,表面等离激元的传播遵循绝热定理,能量可以从初始波导完全转移到目标波导中,并且能保持整个过程中中间层石墨烯不被激发。而考虑石墨烯的损耗时,会导致绝热定理破缺,能量不能稳定地转移。通过在初始波导和目标波导中引入一定大小的损耗或者增益,提出了叁种可以抵消非绝热过程的方法,实现了能量在边界波导的高效转移并且能够缩短绝热通道所需要的传播距离。(3)提出了利用非厄米系统中的奇异点(exceptional points,EPs)实现双层石墨烯波导中模式转换的新方法。双层石墨烯波导中存在两个表面等离激元模式。通过调节两层波导之间的距离和石墨烯化学势,可以使两个模式的传播常数的实部和虚部同时相等,形成EP。当间距和化学势缓慢变化并且在参数空间形成包含奇异点的闭合路径时,可以观察到几何相位。进一步地,我们研究了表面等离激元在调制波导中的传播,波导间距和化学势在传播方向变化。当参数变化等效于在参数空间形成包含EP的闭合路径时,可以实现具有手征特性的表面等离激元模式转换:顺时针和逆时针变化的闭合路径会导致不同的输出模式。这种模式转换的方法可以抗波导参数的扰动。(4)研究了具有损耗和增益的双周期石墨烯波导阵列中的表面等离激元的拓扑边界模式。周期性石墨烯波导阵列在参数空间中存在两个时空对称(Parity-Time symmetry,PT symmetry)区域,这两个区域被EP分隔开。在两个PT对称区域,阵列具有不同的拓扑不变量。拓扑边界态出现在具有不同拓扑的两个波导阵列的分界面。而当PT对称被打破时,拓扑边界态会消失。由于PT对称破缺范围可以通过化学势调节,因此拓扑边界态也可以通过化学势控制。当结构支持拓扑边界态时,光束可以稳定地在界面传播;而不存在边界态时,表面等离激元传播过程中会发生离散衍射。拓扑边界态也可以存在于没有增益只有损耗的石墨烯波导阵列中。该结果有望实现能够抗环境扰动的光束传播,并应用于纳米尺度下的光开关中。(本文来源于《华中科技大学》期刊2017-05-01）
葛琳,郭大伟,何方,黄金虎,王丽平[6]（2016）在《PmrA-PmrB二元调控系统介导大肠杆菌对黏杆菌素耐药的机制研究》一文中研究指出已报道PmrA-PmrB二元调控系统在革兰阴性菌对多黏菌素B耐药过程中起重要作用,基于此认识,作者拟从基因突变和mRNA表达两个方面探讨PmrA-PmrB介导大肠杆菌对黏杆菌素耐药的可能性。首先检测了临床分离的52株禽致病性大肠杆菌对黏杆菌素的敏感性,筛选出耐药菌株;然后采用step-wise方法对黏杆菌素敏感菌株进行诱导,获得人工诱导的耐药菌株;最后通过PCR扩增所有耐药菌株的pmrA-pmrB后采用Mega软件进行突变位点分析,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测所有耐药菌株中pmrA-pmrB的mRNA转录水平的变化,拟阐明PmrA-PmrB二元调控系统对禽致病性大肠杆菌黏杆菌素耐药性产生的作用。MIC结果显示,52株大肠杆菌中,虽然大多数菌株(88.5%,46/52)仍对黏杆菌素敏感,但也分离到少数耐药菌株(为11.5%)。突变位点分析表明人工诱导成功的5株耐药菌(9R、36R、53R、91R和107R)pmrA未发生突变,而pmrB均有不同程度的突变,其中耐药菌株9R、36R和53R各在G55A(G19R)、T500C(L167P)和T263A(V88E)发生点突变,而91R和107R在229位和478位各插入长为30和189bp的序列。但临床分离的6株耐药菌株(MIC=4~8μg·mL~(-1))的pmrA-pmrB均未发生突变。qRT-PCR结果显示发生点突变的叁株人工诱导耐药菌pmrA-pmrB转录量均极显着(P<0.01)或显着(P<0.05)上升,发生插入突变的两株耐药菌pmrA-pmrB转录量虽有上升趋势,但变化不显着(P>0.05),而临床耐药菌株(n=6)的pmrA-pmrB转录量均无变化。进一步检测人工诱导不同MIC的耐药菌株中pmrA-pmrB的突变位点,发现菌株MIC达16μg·mL~(-1)时pmrA-pmrB才会发生突变。PmrA和PmrB介导了大肠杆菌对黏杆菌素的高度耐药,其中PmrB的点突变伴随PmrA-PmrB的高表达或者PmrB的组氨酸激酶-腺苷酰环化酶-甲基结合蛋白-磷酸化酶(HAMP)结构域的插入突变是导致禽致病性大肠杆菌对黏杆菌素高度耐药的机制之一。(本文来源于《畜牧兽医学报》期刊2016年04期）
李爽,李志强,张辉,付强,史慧君[7]（2016）在《二元调控系统中的TcfSR在布鲁菌胞内存活过程中的作用及其调控基因的转录分析》一文中研究指出为分析二元调控系统TcfSR在布鲁菌胞内存活中的调控作用,本研究采用同源重组和抗性替换的方法,利用卡那基因替换TcfSR启动子,构建布鲁菌16M株的突变株16MΔTcfSR,并利用亲本株和突变株侵染小鼠巨噬细胞,比较两者在宿主细胞内的生存能力及其胞内存活相关毒力基因的转录情况。同时在各种逆环境下刺激亲本株和突变株,比较两者在逆环境中的存活能力。结果显示16MΔTcf SR在小鼠巨噬细胞和逆环境中的存活能力均比亲本株下降,并且突变株的胞内存活相关毒力基因的转录水平较亲本株具有差异。表明TcfSR在布鲁菌胞内存活过程中具有重要的调控作用。本研究初步阐明了TCRS Tcf SR的调控机制,为进一步研究TCRS在布鲁菌致病过程中的作用奠定了基础。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2016年01期）
祁克宗,涂健,王曼[8]（2015）在《PhoP/Q二元调控系统的原核表达及对APEC致病性的影响》一文中研究指出禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)能够引起禽类高死亡率,给养禽业的发展造成重大危害。存在于APEC中的Pho P/Q二元调控系统在该菌毒力基因表达、参与上皮细胞侵袭和抵御抗菌肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)抗感染等环节中可能发挥关键的调控作用,本论文即证明上述观点,具体研究内容如下:(1)构建表达禽致病性大肠杆菌Pho P/Q蛋白的工程菌根据NCBI中报道的APEC基因pho P/Q编码区序列,利用Premier 5.0分别设计pho P和phoQ引物,把扩增得到的基因片段克隆到PMD19-T-Vector simple载体上,经酶切和测序验证后将PMD19-T-phoP/Q和p ET32a进行双酶切后连接并转化致大肠杆菌BL21(DE3)。(2)禽致病性大肠杆菌Pho P/Q蛋白的表达、纯化及鉴定将测序正确的E.coli BL21(DE3)/p ET32a-pho P/Q接种于LB液体培养基,经IPTG诱导表达出His-Pho P/Q重组蛋白。选择30℃经0.5 mmol/L IPTG诱导过夜后离心取菌体沉淀,冰浴超声破碎取上清过Ni-NTA亲和层析柱纯化Pho P蛋白,将Pho P重组蛋白进行SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS质谱分析。经37℃0.5 mmol/L IPTG诱导过夜后取LB上清进行纯化并验证得到Pho Q蛋白的胞外功能区,为后续实验做准备。(3)凝胶迁移实验(EMSA)筛选Pho P蛋白调控的宿主菌DNA选择文献报导的大肠杆菌致病相关基因,在Genebank上查找基因序列。利用凝胶迁移实验(EMSA)验证Pho P蛋白能够结合的基因启动子,最终筛选出Pho P调控的宿主菌外膜蛋白、内毒素等相关靶基因分别为iss血清毒力基因、mgt A镁离子转运相关基因、chu A外膜血红蛋白受体基因、usp A应激反应蛋白、slyB外膜脂蛋白基因、hlyF溶血基因。以上结果表明,Pho P/Q二元调控系统对E.coli的毒力有着关键的调控作用。本研究为进一步探究Pho P/Q二元调控系统对E.coli的调控作用提供了理论参考。(本文来源于《中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十一次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第二十次学术研讨会论文集》期刊2015-07-24）
丁峰山,何时义,王爱妍,付鑫,杨东君[9]（2015）在《鸟分枝杆菌二元调控系统PhoP基因的克隆与分析》一文中研究指出目的:对鸟分枝杆菌调控因子Pho P的基因序列和氨基酸序列进行生物信息学分析。方法:利用PCR技术扩增鸟分枝杆菌HIV/AIDS临床分离株Pho P基因,与p EASY-T1载体连接后测序,运用生物信息学工具对其序列进行分析。结果:PCR产物显示一条约为720bp的条带,测序结果与Gen Bank数据库中鸟分枝杆菌104株Pho P基因序列完全一致。该分离株Pho P的基因和氨基酸序列与结核分枝杆菌H37Rv比对,同源性分别为86%和94%。分离株Pho P基因编码的氨基酸数目为239个氨基酸,其中从136到239位氨基酸为DNA结合区。结论:成功克隆出鸟分枝杆菌HIV/AIDS临床分离株的Pho P基因。该分离株Pho P的氨基酸序列与结核分枝杆菌具有高度的同源性。(本文来源于《世界最新医学信息文摘》期刊2015年17期）
李志强[10]（2015）在《布鲁氏菌二元调控系统TceSR和TcfSR的生物学功能研究》一文中研究指出布鲁氏菌病是由感染人和动物的布鲁氏菌造成的对社会安全有严重危害的疾病,在世界上广泛流行,尤其是在发展中国家,造成更为严重的经济损失。布鲁氏菌是一类兼性胞内寄生菌,其毒力主要依赖于在宿主细胞内的生存和繁殖的能力。二元调控系统(two-component regulatory system,TCS)能够对环境信号感受应答、传递以及处理的信号进行转导、调节和控制。布鲁氏菌有15对TCS,已有研究表明,位于染色体I的TCS与布鲁氏菌的毒力密切相关,但位于染色体II的TCS的毒力表型及其调控机制还尚不清楚。本研究以布鲁氏菌TCS TceSR和TcfSR为研究对象,通过探讨TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌毒力表型、相关基因表达和胞内生存繁殖的影响,及其在小鼠体内的毒力和免疫保护力,为揭示布鲁氏菌感染宿主细胞的分子机制提供线索,也为新疫苗的研发、相关疫病的预防、控制和抗病育种工作提供依据。目的:本研究以羊种布鲁氏菌参考株16M为研究对象,探讨TCS TceSR和TcfSR的功能及其在布鲁氏菌致病过程中的作用机制。(1)构建TCS TceSR和TcfSR启动子失活的突变株,并对其进行鉴定。(2)分析TCS TceSR和TcfSR突变株相关毒力基因的胞内外转录水平,比较突变株和亲本株毒力基因表达的差异,根据差异基因的功能及其在突变株中的转录变化,解释突变株相关毒力表型的变化。(3)分析比较突变株和亲本株胞内生存相关表型的差异,确定TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌胞内存活的作用。(4)分析突变株在小鼠体内的毒力,探讨TCS TceSR和TcfSR对布鲁氏菌在小鼠体内建立慢性感染的作用。方法:(1)利用同源重组和抗性替换的方法,构建了TCS TceSR和TcfSR启动子失活的突变株;对获得的基因突变株进行PCR鉴定和遗传稳定性检测。(2)布鲁氏菌侵染巨噬细胞RAW264.7,qRT-PCR检测布鲁氏菌相关毒力基因(主要包括脂多糖合成相关蛋白、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系统、转运系统、鞭毛系统、调控系统、压力蛋白/泛素相关蛋白、氮源代谢分子)的胞内转录水平;亲本株和突变株在体外刺激环境中培养30min。利用qRT-PCR分析毒力基因omp25、virB1、vjbR、gntR、dnaK、Hfq、htrA的转录变化。(3)比较突变株和亲本株的胞内存活相关表型。布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,在侵染后不同时间,检测细菌的黏附侵袭能力和胞内存活能力;亲本株和突变株侵染巨噬细胞RAW264.7,利用荧光定量PCR、流式细胞仪和共聚焦显微镜测定宿主细胞在细菌的侵袭下所引起的凋亡和自噬水平;构建能够表达绿色荧光的布鲁氏菌,侵染巨噬细胞RAW264.7,观察布鲁氏菌与溶酶体的融合情况。(4)用布鲁氏菌疫苗株和突变株分别腹腔接种免疫(106CFU)SPF级4-6周龄雌性BALB/c小鼠;接种后的不同时间点采集免疫小鼠血清,采用间接ELISA测定小鼠体内细胞因子IFN-γ的水平和总的IgG水平;无菌分离脾脏,测定脾脏载菌量,制备病理切片,检测突变株的毒力;用105CFU的16M进行攻毒实验,检测各菌株的保护力;克隆、表达、纯化TCES和TCFS两个蛋白,以纯化的蛋白作为抗原,分别对突变株免疫小鼠的血清进行Western Blot分析。结果:(1)成功构建了TCS TceSR和TcfSR启动子突变株16MΔTceSR和16MΔTcfSR,在15代内遗传性稳定;突变株和亲本株的体外生长趋势一致;体外刺激结果显示,突变株对酸、碱、高盐、热应激、营养缺陷和干燥的抵抗力降低。(2)亲本株和突变株侵染细胞24h后,66个布鲁氏菌相关毒力基因在胞内的转录水平发生了变化,其中在16MΔTceSR突变株中,41个(62.12%)基因高表达,25个(37.88%)基因低表达;在16MΔTcfSR突变株中,47个(71.21%)基因高表达,19(28.79%)个基因低表达;在体外刺激环境下,布鲁氏菌胞内存活相关的基因在突变株中的转录水平均低于在亲本株中的转录水平。(3)突变株对细胞的粘附能力和胞内存活能力是减弱的;细胞凋亡研究发现,突变株与亲本株引起宿主细胞凋亡程度相似;而细胞自噬结果却发现,突变株引起细胞自噬水平低于亲本株;溶酶体融合实验显示,侵染细胞24h时突变株组胞内的布氏小体与溶酶体融合率高于亲本株组。(4)突变株免疫小鼠后,可诱导机体分泌IFN-γ和IgG,小鼠脾脏载菌量低于亲本株,但仍存在一定的毒力;攻毒后,突变株免疫的小鼠对亲本株可产生一定的免疫保护力;布鲁氏菌重组蛋白TCES和TCFS可以作为诊断抗原,鉴别突变株免疫和亲本株免疫的小鼠。结论:(1)TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌抵抗逆环境中有重要的作用。(2)TCS TceSR和TcfSR突变株侵染宿主细胞后,66个毒力基因的表达受到了影响,使布鲁氏菌适应胞内的各种不利环境,以利于布鲁氏菌的胞内存活。(3)TCS TceSR和TcfSR突变株在小鼠体内可诱导细胞免疫和体液免疫,其毒力比亲本株下降明显,但需进一步改造。(本文来源于《石河子大学》期刊2015-06-01）
双元调控系统论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的万古霉素中介金葡菌(VISA)和异质性万古霉素中介金葡菌(h-VISA)通常伴有毒力和生物膜等多个生物学表型特征的改变,这些变化可使细菌在体内长期存活,导致感染反复发作。Vra SR是金葡菌万古霉素耐药相关二元调控系统。有研究显示,vra SR的表达水平在h VISA/VISA中明显上升。通过前期研究,我们发现Vra R蛋白可直接与金葡菌全局调控子agr启动子区域结合,提示Vra SR可能具有广泛的调控作用。本文重点探讨Vra SR在h VISA/VISA致病性中发挥的作用,以期为基于Vra SR的h VISA/VISA感染诊断和临床治疗提供理论依据。方法(1)利用基因敲除及基因回补技术构建异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌标准菌株(Mu3)vra SR基因敲除株(Δvra SR)及基因回补株(CΔvra SR),采用q RT-PCR验证构建是否成功。(2)生物表型研究:用分光光度计检测金黄色葡萄球菌的生长情况,绘制生长曲线;E-test方法检测万古霉素MIC值;稀释法定量检测溶血素活力和凝固酶活力;通过电子显微镜观察细菌细胞壁厚度;与人宫颈癌上皮细胞共培养观察细菌粘附能力;微孔板成膜法和激光共聚焦显微镜法检测细菌的生物膜形成能力;体外中性粒细胞吞噬及杀伤实验检测细菌抗吞噬及抗杀菌能力。q RT-PCR的方法检测粘附相关基因(fnb A,fnb B,clf A,ebps,sbi)、细胞壁合成相关基因(cap5K,cap5N,nan A,tag A,mur D)的转录水平。结果1.成功构建vraSR基因敲除株及其回补株,q RT-PCR证实ΔvraSR中vraSR基因的转录完全缺失,对Δvra SR的质粒回补回复了vra SR基因的转录。2.Mu3中vra SR基因的缺失对金葡菌生物表型的影响:(1)与Mu3相比,Δvra SR对金葡菌的生长未造成明显影响;(2)Mu3、Δvra SR和CΔvra SR万古霉素MIC值分别为1.5μg/ml、0.38μg/ml、1.5μg/ml,与Mu3相比,Δvra SR菌株万古霉素MIC值下降了3.95倍。CΔvra SR株能回复万古霉素的MIC值;(3)Δvra SR与Mu3相比溶血素活力和凝固酶活力无统计学差异(P>0.05);(4)Δvra SR菌株细胞壁合成能力下降,Mu3和Δvra SR细胞壁平均厚度分别为18.53±2.84 nm和26.64±3.07nm(p<0.01).CΔvra SR株能回复细胞壁合成能力,其细胞壁平均厚度为23.32±3.59 nm(p<0.01);(5)与Mu3相比,Δvra SR粘附He La细胞的能力降低(LOG10 CFU/ml,5.75±0.43 Vs 3.53±0.71,p<0.01),CΔvra SR能回复对Hela细胞的黏附能力(LOG10CFU/ml5.20±0.36,p<0.05)。(6)Δvra SR菌株生物膜合成能力下降,Mu3和Δvra SR生物膜平均厚度分别为7.38±1.4μm Vs 14.44±1.65μm,(p<0.001)。CΔvra SR能回复生物膜的合成能力(9.35±1.37μm,p<0.01)(7)与Mu3相比,Δvra SR更易被中性粒细胞吞噬和杀伤,Mu3与Δvra SR吞噬率分别为47.75±2.56%和71.29±2.55%(p<0.001),吞噬指数分别为1.65±0.16和3.11±0.32(p<0.01),在中性粒细胞中细菌的存活量分别为5.56±0.63 Vs 2.73±0.50(LOG10 CFU/ml)(p<0.001)。(8)与Mu3相比,Δvra SR菌株中粘附相关基因fnb A,fnb B,clf A,ebps,sbi和细胞壁合成相关基因cap5K,cap5N,nan A,tag A,mur D的转录水平均表现为下调,且差异有显着性(p<0.05),CΔvra SR株能回复黏附基因和细胞壁合成相关基因的表达。结论二元调控系统Vra SR在h VISA/VISA致病性中发挥重要作用。Vra SR可以增加金葡菌对万古霉素的耐药,促进金葡菌粘附上皮细胞及合成细胞壁、增强生物膜形成。增强金葡菌抵抗人中性粒细胞的吞噬及杀菌,协助金葡菌逃避人免疫系统的攻击,有利于其在体内的生存。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
双元调控系统论文参考文献
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[2].高彩虹.万古霉素敏感性减低金黄色葡萄球菌二元调控系统VraSR在细菌致病性中的作用研究[D].安徽医科大学.2019
[3].刘瑞,祁克宗,薛媚.PhoP/Q二元调控系统对APEC抗AMPs侵袭的相关基因调控研究[C].中国兽医病理学2017年学术研讨会暨兽医病理学分会第九次全国会员代表大会论文集.2017
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[7].李爽,李志强,张辉,付强,史慧君.二元调控系统中的TcfSR在布鲁菌胞内存活过程中的作用及其调控基因的转录分析[J].中国预防兽医学报.2016
[8].祁克宗,涂健,王曼.PhoP/Q二元调控系统的原核表达及对APEC致病性的影响[C].中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十一次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第二十次学术研讨会论文集.2015
[9].丁峰山,何时义,王爱妍,付鑫,杨东君.鸟分枝杆菌二元调控系统PhoP基因的克隆与分析[J].世界最新医学信息文摘.2015
[10].李志强.布鲁氏菌二元调控系统TceSR和TcfSR的生物学功能研究[D].石河子大学.2015