王二虎袁泽宇邱松(河南羚锐制药股份有限公司464000)
【摘要】目的研究心可宁胶囊的微生物限度检查方法。方法：通过实验菌在不同试验条件下的试验回收率及微生物的生长研究，确认心可宁胶囊的微生物限度检查方法。结果心可宁胶囊按常规平皿法进行霉菌及酵母菌试验，实验菌的试验回收率均大于70%；按常规法进行控制菌试验，试验组及阴性对照组微生物生长均符合标准要求；按常规平皿法、培养基稀释法进行细菌回收试验时均有相应的试验菌不能通过大于70%的试验回收，按薄膜过滤法进行时，实验菌的试验回收率均大于70%。结论实验确认心可宁胶囊的微生物限度检查方法：细菌计数采用薄膜过滤法（供试液为1：100，冲洗量为400ml/膜）；霉菌和酵母菌计数采用常规平皿法；控制菌采用常规法；按此方法确保试验有效可行、准确、科学。
【关键词】心可宁胶囊微生物限度检查方法培养基适用性检查方法验证回收率培养基稀释法薄膜过滤法。
【中图分类号】R915【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）27-0168-03
心可宁胶囊是我公司与有关专家共同研制的治疗冠心病、心绞痛等症的纯中药胶囊。它以经典名方为基础，结合现代医学研究成果，合理配方，采用现代工艺技术精制而成。其药品成分为丹参、冰片、牛黄、红花、三七、蟾酥、水牛胶粉、人参须；具有活血散瘀，开窍止痛等功能。按中国药典2010年版要求，为建立心可宁胶囊的微生物限度检查方法；结合药品成分特性进行了微生物限度检查方法及方法学验证的试验研究。
1仪器材料与试剂
1.1仪器材料：LMQ.J3260型立式灭菌器(山东新华医疗器械厂)；BC-156A冷藏柜(青岛海尔)；JCE-GPL智能型数显干燥/培养箱(山东维坊医疗器械厂)BSC-1000-II-A2型生物安全柜(苏州华宇净化设备有限公司)；MJ-250-I型霉菌培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；GHP-9270型隔水式恒温培养箱{上海齐欣科学仪器有限公司)；SW-CJ-1F净化工作台(苏净集团安泰空气技术有限公司)；HTY-2000A集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）；TDL-40B离心机（上海安亭科学仪厂）。
1.2培养基及试液营养琼脂培养基（批号100607）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号100514）、胆盐乳糖增菌液（批号1004272）、营养肉汤培养基（批号100624）、改良马丁培养基（批号100403）、曙红亚甲蓝培养基（批号110813）、四硫磺酸钠亮绿培养基（批号100215）、胆盐硫乳琼脂培养基（批号100902）、三糖铁琼脂培养基（批号110224）、MUG培养基（批号110705）、靛基质、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号110523）(上述培养基均为中国药品生物制品检定所监制)
0.9%氯化钠溶液、75%乙醇、碘试液、亮绿试液（按中国药典2010年版一部附录制备[1]）
1.3菌种：大肠埃希菌（Escherichiacoli）〔CMCC（B）44102〕
金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus)〔CMCC（B）26003〕
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）〔CMCC（B）63501〕
白色念珠菌(Candidaalbicans)〔CMCC（F）98001〕
黑曲霉（Aspergillusniger）CMCC(F)98003〕
1.4其它
1.4.1标准对照培养基：营养琼脂培养基（批号135003-201002）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号135005-201002）、胆盐乳糖增菌液（135006-201002）、营养肉汤培养基（135004-201002）。
1.4.2培养器皿、辅助材料试验前均为121℃湿热灭菌20min,备用。
1.5样品心可宁胶囊（河南羚锐制药股份有限公司），批号分别为120528、120529、120610。
2方法
2.1菌液的制备
2.1.1取经35℃培养22小时金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌的肉汤培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100CFU的菌悬液，做活菌计数用。
2.1.2取经25℃培养24小时的白色念珠菌液体培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液[4]制成每1ml含菌数为50～100CFU的菌悬液，做活菌计数用。
2.1.3接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5天，加入适量0.9％无菌氯化钠溶液洗脱孢子，用0.9％无菌氯化钠溶液[4]制成每1ml含孢子数为50～100的孢子悬液。
2.2供试液的制备
2.2.1供试液的制备取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，于45水浴保温溶解胶囊，用适宜的方法混匀，作为1：10的供试品溶液；取1：10的供试液10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml，混匀，作为1：100的供试品溶液。
2.3培养基适用性检查[1]
2.3.1将试验用营养琼脂培养基（批号100607）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号100514）与标准对照培养基营养琼脂培养基（批号135003-201002）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号135005-201002）同法制备；分别加相应试验菌对比其菌回收，其结果均大于70；本批次培养基符合适用性要求。
2.3.2将试验用胆盐乳糖增菌液（批号1004272）、营养肉汤培养基（批号100612）与标准对照培养基胆盐乳糖增菌液（135006-201002）营养肉汤培养基（135004-201002）同法制备；分别加相应试验菌对比其促生长及抑制能力，其结果均符合检验性能，本批次培养基符合适用性要求。
2.4回收率[1]的计算
(1)试验组：取供试品(液)加入30-100cfu试验菌，注皿，培养，计数。
(2)菌液组：直接加入30-100cfu试验菌，注皿，培养，计数。
(3)供试品对照组：供试品(液)注皿，培养，计数。
2.5细菌、霉菌和酵母菌数计数方法验证[2]
2.5.1常规平皿法取2.2.1制备的供试液1ml加15～20ml菌落计数用琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养规定的时间后观察结果计数，测定菌回收率。
2.5.2培养基稀释法取2.2.1制备的供试液同一稀释级的供试液1ml，按培养基稀释法0.5ml/皿、0.2ml/皿操作，置规定温度培养规定的时间后观察结果计数，测定菌回收率。
2.5.3薄膜过滤法取2.2.1制备的1；100供试液各1ml，按薄膜过滤法进行操作，冲洗量按400ml/膜，取出滤膜置规定温度培养规定的时间后观察结果计数，测定菌回收率。
2.6控制菌检查方法验证
2.6.1大肠埃希菌检查方法验证
2.6.1.1常规法
（1）试验组：取1:10的供试液10ml和1ml大肠埃希菌（约30～100cfu）加入100ml的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。
（2）阴性对照组：取1:10的供试液10ml和1ml金黄色葡萄球菌（约30～100cfu）加入100ml的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。
（3）阳性对照组：取1ml大肠埃希菌（约30～100cfu）加入100ml的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。
检验按中国药典2010年版控制菌检验方法进行[1]
2.6.2大肠菌群检查方法验证
2.6.2.1常规法
（1）试验组：取1:10的供试液1ml和1ml大肠埃希菌（约30～100cfu）加入10ml的乳糖胆盐培养基中，培养18～24小时。
（2）阴性对照组：取1:10的供试液1ml和1ml金黄色葡萄球菌（约30～100cfu）加入10ml的乳糖胆盐培养基中，培养18～24小时。
检验按中国药典2010年版控制菌检验方法进行[1]
3结果
3.1心可宁胶囊的微生物限度检查方法计数方法验证(常规法)结果见表。
表1试验次数菌回收率金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉
16%79%18%98%76%
210%73%16%92%85%
39%74%19%102%79%
（备注：表中菌回收率项下1.2.3.分别指三次试验序号、各试验菌项下百分数为相应三次的试验回收率。）
心可宁胶囊采用常规平皿方法检验时，人工污染5株代表菌株,该供试品试验结果大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉回收率高于70%、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有抑制作用，供试品平均回收率分别8%、18%均低于70%。故常规平皿法不适用该样品细菌数的测定，而霉菌及酵母菌计数可采用规法平皿法。
现用培养基稀释（0.5ml/皿）对该样品进行大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率测定,结果如表2。
表2心可宁胶囊微生物限度检查方法验证(培养基稀释法0.5ml/皿)
表2
试验次数
菌回收率金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌
147%87%45%
259%85%65%
344%94%62%
（备注：表中菌回收率项下1.2.3.分别指三次试验序号、各试验菌项下百分数为相应三次的试验回收率。）
表2结果表明：心可宁胶囊采用培养基稀释法（0.5ml/皿）检验时，大肠埃希菌的回收率大于70%。而金黄色葡萄球菌、枯草杆菌的试验的回收率均低于70%。故培养基稀释法（0.5ml/皿）不适用该样品细菌数的测定。
现用培养基稀释（0.2ml/皿）对该样品进行金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率测定,结果如表3。
表3心可宁胶囊微生物限度检查方法验证(培养基稀释法0.2ml/皿)
试验次数
菌回收率枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌
177%69%
289%59%
384%62%
（备注：表中菌回收率项下1.2.3.分别指三次试验序号、各试验菌项下百分数为相应三次的试验回收率。）
表3结果表明：养基稀释（0.2ml/皿）消除供试品对人工污染枯草芽孢杆菌的抑制作用，回收率达到70%以上，而金黄色葡萄球菌的回收率仍低于70%。故培养基稀释法（0.2ml/皿）不适用该样品细菌数的测定。
现用薄膜过滤法（冲洗量为400ml/膜)对该样品进行金黄色葡萄球菌回收率测定,结果如表4。
表4心可宁胶囊微生物限度检查方法验证
(薄膜过滤法供试液为1：100，冲洗量为400ml/膜)
菌回收率试验次数金黄色葡萄球菌
187%
296%
392%
（备注：表中菌回收率项下1.2.3.分别指三次试验序号、各试验菌项下百分数为相应三次的试验回收率。）
表4结果表明：薄膜过滤法（供试液为1：100，冲洗量为400ml/膜)消除供试品对人工污染金黄色葡萄球菌的抑制作用，回收率达到70%以上，因此供试品细菌数的测定可采用薄膜过滤法（供试液为1：100，冲洗量为400ml/膜)。
3.2：心可宁胶囊控制菌大肠埃希菌、沙门菌、大肠菌群检查的方法验证结果见表5、表6、表7:（常规法）
表5BLMUG靛基质EMB
实验组变混浊荧光反应玫瑰红色阳性菌落
阳性对照组变混浊荧光反应玫瑰红色阳性菌落
阴性对照组无变化无荧光无色变无菌生长
表5结果表明：常规法检查大肠埃希菌时，实验组检出大肠埃希菌；阴性对照组未检出金黄色葡萄球菌。因此，检查大肠埃希菌可采用常规法。
表6
营养肉汤TTB增菌液DHL平板EMB平板
实验组变混浊变混浊阳性菌落阳性菌落
阳性对照组变混浊变混浊阳性菌落阳性菌落
阴性对照组无变化无变化无菌生长无菌生长
表6结果表明：常规法检查沙门菌时，实验组检出沙门菌；阴性对照组未检出金黄色葡萄球菌。因此，检查沙门菌可采用常规法。
表7
试验组阴性菌对照组（金黄色葡萄球菌）
乳糖胆盐发酵培养基产酸产气未产酸未产气
曙红亚甲蓝琼脂阳性菌落未长菌
表6结果表明：常规法检查大肠菌群时，试验组检出大肠菌群，阴性菌对照组未检出阴性对照菌，因此大肠菌群可采用常规法。
4讨论
4.1微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法[1]。在复方中药制剂中，由于其成份多样性，所制备的供试液本身具有影响部分微生物生长的作用，若不经方法学验证，难以保证采用的方法适合该品种微生物限度检查，难以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。心可宁胶囊是由干浸膏组成，在常规检查时发现其污染微生物生长迟缓，样品有一定的抑菌作用[5]，鉴于此，我们采用了培养基稀释法降低其药物成分浓度，经过试验，微生物生长有所改变，但有试验菌回收率小于70%；通过对产品成分分析确认部分具有抑菌作用，为消除抑菌作用我们采用薄膜过滤法；经过试验，试验菌回收率有很大提高达到70%以上。通过回收实验证实，结果准确、可靠；为此确立心可宁胶囊的微生物限度检查方法：细菌计数采用薄膜过滤法（供试液为1：100，冲洗量为400ml/膜）；霉菌和酵母菌计数采用平皿法；控制菌采用常规法。
4.2中国药典2010年版[1]规定计数验证的菌数50-100cfu的范围在实际操作过程中较难控制，建议菌数为30-100cfu，较为适用。
4.3试验表明；多数中药制剂对霉菌及酵母菌基本无抑制作用，对细菌的抑制作用存在一定的差异；一般按品种特点[5]通过不同的方法设计，各试验菌的回收率达到70%以上，从而确立适宜的微生物检验方法。
4.4在中药胶囊试验时发现：具有较强抑菌作用的胶囊制剂，在使用薄膜过滤法进行细菌检查时，1：10的供试液较难进行过滤；鉴药典规定细菌限度为不大于10000cfu/g，因此试验供试液选用1：100进行操作，从而达到理想的过滤效果。
参考文献
[1]国家药典委员会。中华人民共和国药典（一部）[M]。北京：化学工业出版社，2010：70，附录ⅩⅢ。
[2]许华玉。药品微生物检查法的验证[R]。2005.11.11（海南）。
[3]王知坚，邵惠琴，杜芸等。药品微生物限度检查法有效性验证实验研究[J]中国现代应用医学杂志。2004.21（3）：211
[4]朱会琴，李凯，王建宁等。几种中成药的微生物限度检查法的探讨[J]中成药。2007.29（12）：附4
[5]陶红。中药制剂微生物限度检查方法研究进展[J]中国药房。2010.21（19）：1814