一、sIL-16在大肠杆菌中的表达及活性分析（论文文献综述）
战帅帅[1]（2021）在《小麦阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基转移酶基因TaBAHD的克隆与功能鉴定》文中指出小麦是我国最重要的粮食作物之一。阿魏酰阿拉伯木聚糖（Feruloyl arabinoxylan,FAX）大分子构架中的阿魏酰基团与阿拉伯木聚糖（Arabinoxylan,AX）产生氧化交联最终形成凝胶,对面制品的加工品质及其营养品质均能产生重要影响。FAX在阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基转移酶（Arabinoxylan feruloyl transferase,AFT）催化作用下合成,而FAX含量的高低则对小麦AX的分子结构和性质起到关键作用。因此,克隆FAX含量的关键酶（AFT）基因,开发功能标记并进行基因的表达机理分析是对小麦加工品质进行改良的有效途径。本研究利用253份来自黄淮冬麦区、北部冬麦区的国内外小麦品种（系）及124份新疆小麦品种（系）作为供试材料,同源克隆小麦3B、3D染色体上的TaBAHD基因,基于序列的差异性开发功能标记并验证,最后通过基因编辑对TaBAHD-A1和TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因进行分析鉴定,明晰小麦籽粒FAX含量相关的分子基础。主要结果如下:1.通过同源克隆的方法,以TaBAHD-A1基因序列为探针,分别克隆了位于3 BL和3 DL上的AFT基因TaBAHD-B1和TaBAHD-D1。TaBAHD-B1和TaBAHD-D1基因全长序列分别为1450 bp和1469 bp,各都包含一个1266 bp完整的开放阅读框（Open reading frame,ORF）,一个内含子及两个外显子,内含子的剪接位点结构则符合GT-AG经典类型。不同材料间的TaBAHD-B1基因在1425bp位置有1处SNP位点,2个等位变异序列之间相似度为98.08%,共编码氨基酸422个,预测其分子量是45.1k Da。不同材料的TaBAHD-D1基因等位变异序列之间相似度为99.73%,具有4个单核苷酸多态性位点,且具有20 bp的5′非翻译区（Untraslated region,UTR）和44 bp的3′UTR。TaBAHD-A1和TaBAHD-B1、TaBAHD-D1基因存在10个氨基酸非同义突变,相同结构域是乙酰转移酶催化机制重要组分。基于TaBAHD-B1基因的等位变异序列SNP位点开发了一对显性互补型标记AFT 97/AFT 85。AFT 97标记与高FAX含量相关,在具有TaBAHD-B1a类型的材料中能扩增出539 bp片段,在黄淮冬麦区材料间不同基因型的FAX含量差异达显着水平（P<0.05）。基于TaBAHD-D1基因19 bp SNP处开发了2个互补显性标记AFT 19和AFT 27。AFT 27可分辨出的等位变异TaBAHD-D1a材料中能扩增出908 bp片段,与高FAX含量相关。总体分析表明,具有不同基因型小麦品种的FAX含量差异达到显着水平（P<0.05）。TaBAHD-A1a/TaBAHD-B1a/TaBAHD-D1a基因型组合,在北部冬麦区、黄淮冬麦区及总体材料中,其FAX含量在不同麦区间差异达显着水平（P<0.05）,且TaBAHD-B1基因对FAX含量催化合成的功能作用相对较小。2.通过实时荧光定量PCR（Quanti-ficational,PCR）的方法,对12份基因型与表型值相符合的小麦材料,其开花后5个周期麦穗籽粒中的TaBAHD-A1、TaBAHD-B1、TaBAHD-D1基因表达量进行统计分析,结果表明TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因均在21 d时期表达量最高且稳定,且与其他7 d、14 d、28 d、35 d时期的相对表达量有显着差异（p<0.05）,与小麦籽粒处于面团期特征表现一致。TaBAHD-A1a的相对表达量约为TaBAHD-B1a等位变异相对表达量的1.3倍,TaBAHD-D1a等位变异相对表达量的2倍,TaBAHD-B1b等位变异相对表达量的5倍。12份材料分为两类,I类为高FAX含量品种,II类为低FAX含量品种。农大212（TaBAHD-A1a/TaBAHD-B1a/TaBAHD-D1a）、小偃54（TaBAHD-A1a/TaBAHD-B1a/TaBAHD-D1b）是优异等位变异组合类型的高FAX含量材料,与淮麦18（TaBAHD-A1b/TaBAHD-B1b/TaBAHD-D1b）、济麦21（TaBAHD-A1b/TaBAHD-B1b/TaBAHD-D1b）、陕354（TaBAHD-A1b/TaBAHD-B1b/TaBAHD-D1a）低FAX含量的材料在不同发育时期相对表达量差异显着（p<0.05）,且相对表达量与前期研究的FAX含量表型特征相符合,以上结果表明第3染色体组的TaBAHD-A1、TaBAHD-B1、TaBAHD-D1基因可能参与催化合成小麦籽粒发育过程中FAX含量的交联反应,且不同基因型参与调控作用的功能程度存在差异,在转录水平上分析了TaBAHD基因表达机理。3.通过双酶切法构建p ET-28a（+）-TaBAHD-A1,p ET-28a（+）-TaBAHD-B1,p ET-28a（+）-TaBAHD-D1原核表达载体;37℃,215 rpm条件下,加入IPTG至终浓度为1 m M,恒温培养2 h,全菌蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,所得结果与前期预测结果一致,初步验证TaBAHD蛋白已被成功诱导。重组蛋白表达条件进一步优化表明,p ET-28a（+）-TaBAHD均在37℃表达最高,而p ET-28a（+）-TaBAHD-A1及p ET-28a（+）-TaBAHD-B1重组载体分别在1.0 m M、1.5 m M IPTG浓度条件下,p ET-28a（+）-TaBAHD-D1重组载体在诱导8 h时表达条件下最优。4.以中间载体pMETa U 6.1为模板成功构建双g RNA基因编辑载体。高通量测序结果表明37株基因编辑植株突变类型主要为Bi和He,主要在PAM识别序列为TaBAHD-222靶点上游3 bp、4 bp处以4 bp、5 bp的删除突变及下游2 bp处单碱基替换为主。主要在PAM识别序列为TaBAHD-322靶点下游4 bp处以2 bp的删除突变及单碱基插入为主,且主要为TaBAHD-A1及TaBAHD-B1发生基因编辑。3个染色体TaBAHD基因同时发生基因编辑的植株籽粒FAX含量为3.57×10-5mol/L,低于受体Fielder品种(4.07×10-5mol/L)。初步验证了TaBAHD基因可能与胚乳细胞壁FAX含量存在相关性。
侯亚男[2]（2021）在《高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究》文中研究表明生物组织有一个光学“透明窗口”,这个区域的光谱范围在650-900 nm之间,由于血红蛋白、水、脂质和黑色素等细胞成分在这个区域吸收最小,导致光对组织的穿透力更强,同时该区域还具有较低的自发背景荧光和光散射率,所以发射光谱处于这个区域的荧光蛋白特别适合深层组织成像。目前胆素蛋白已经将荧光蛋白的光谱范围扩展到远红光（FR,650-700 nm）和近红外（NIR,700-770 nm）区域。远红光和近红外区域的荧光蛋白对于生物成像和多重标记非常重要。然而,随着荧光蛋白发射波长的增加,荧光量子产率和荧光强度也会相应的降低,所以在保持近红外区域发射光谱红移的基础上,同时保证荧光蛋白的高亮度和单体状态依旧是个挑战。在远红光光适应的蓝藻中,我们发现了两个藻胆体核心亚基ApcE2和ApcF2,其中ApcE2来自于Synechococcus sp.PCC7335,ApcF2来自于Chroococcidiopsis thermalis sp.PCC7203。我们首先以ApcE2为模板,分子进化出一个可溶的藻胆蛋白,命名为北斗荧光蛋白BDFP3,它与植物光敏色素PФB非共价结合得到BDFP3.1,吸收峰在708 nm,荧光峰在720 nm。其中色素PФB是通过外部添加与BDFP3结合产生荧光的,游离色素PФB可通过先对BDFP3.3酸性尿素变性,再氯仿萃取的方式获得。随后我们将两个BDFP1.1与一个BDFP3进行融合,设计了一个三联嵌合体,命名为BDFP1.1:3.1:1.1,它的发射波长达722 nm,以单体形式存在,在哺乳动物细胞内的有效亮度是i RFP720的2.7倍。其中BDFP1.1是由ApcF2衍生而来,可以共价结合胆绿素BV,荧光峰在710 nm。本实验将BDFP1.1共价结合BV的荧光亮度和BDFP3非共价结合PФB的红移光谱有效结合,利用荧光共振能量转移（FRET）,将BDFP1.1-BV（作为供体）的能量传递给BDFP3.1（作为受体）,从而提高720 nm处的荧光亮度。同时将嵌合体BDFP1.1:3.1:1.1融合不同目的蛋白进行荧光标记,无论在原核细胞还是真核哺乳动物细胞中都能产生明亮的荧光。在BDFP1.1:3.1:1.1三联嵌合体的启发下,紧接着我们又设计了两个新的三联嵌合体,分别是BDFP1.2:3.3:1.2和BDFP1.6:3.3:1.6。它们的发射波长在670 nm,在哺乳动物细胞中表达时荧光亮度极高,而且以单体形式存在。BDFP3.3是由BDFP3非共价结合色素PEB得到的,它是一个明亮的红色荧光蛋白,吸收峰在608 nm,荧光峰在619 nm,且荧光量子产率可达到66%。因为哺乳动物细胞中只存在胆绿素BV,所以在动物细胞中表达时,色素PEB需要外部添加才能与BDFP3结合产生荧光。对于色素PEB的获取,可采用胰蛋白酶水解BDFP3.3的方式来替代色素PEB的萃取。BDFP1.2和BDFP1.6是由ApcF2衍生而来,可共价结合胆绿素BV。对于BDFP1.2:3.3:1.2来说,本实验将BDFP1.2共价结合BV的红移光谱和BDFP3非共价结合PEB的荧光亮度有效结合,利用荧光共振能量转移（FRET）,将BDFP3.3（作为供体）的能量传递给BDFP1.2-BV（作为受体）,从而提高670 nm处的荧光亮度。BDFP1.6:3.3:1.6的设计理念与之相同。BDFP3.3和BDFP1.2/1.6:3.3:1.2/1.6与目的蛋白融合进行荧光标记,可以进行很好的超分辨SIM成像。作为藻胆蛋白荧光探针,首次实现了红光与远红光的双色成像,同时利用嵌合方式增加细胞亮度的方法也为开发更多优良的荧光蛋白提供了新思路。BDFPs是由远红光诱导的蓝藻Chroococcidiopsis thermalis sp.PCC7203的别藻蓝蛋白β亚基ApcF2进化而来的,它们可以共价结合胆绿素BV产生远红光和近红外两种类型的荧光。其中远红光BDFPs的最大发射波长在670 nm,近红外BDFPs的最大发射波长为710 nm。BDFPs具有分子量小、可溶性高且光谱红移等优点,是开发出优良近红外荧光探针的理想模板。以N端缺失20-31aa的BDFP1.2为分子进化模板,我们获得了一个远红光荧光蛋白突变体并得到了解析。它的晶体结构显示一个BV发色团与Cys72和Cys82双共价结合。基于晶体结构,我们进一步优化了一系列新的单体化远红光和近红外荧光蛋白BDFPs,这些新开发的单体化BDFPs比之前报道的远红光和近红外单体荧光蛋白要亮得多,更适合作为荧光探针用于生物标记。
郑莎[3]（2021）在《桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究》文中提出自从1958年耶鲁大学的科学家Lerner从牛的松果体中首次分离出褪黑素以及1995年Dubbels和Hattori等学者率先从高等植物番茄、牵牛花等植物中鉴定到褪黑素以来,褪黑素在动植物中的功能受到了科学家们的广泛关注和研究。大量研究表明:褪黑素能够参与到植物生长发育的各个阶段,参与调控植物的各种生理活动;在动物体内,褪黑素起着重要的时间生物学作用,调节昼夜节律,维持节律稳定,具有改善睡眠、治疗神经衰弱和提高免疫等功效。因此,褪黑素在日常生活中作为睡眠调节药物被广泛使用,常用于调整由飞行时差或其他睡眠失调导致的生物钟紊乱,从而改善人的睡眠觉醒周期和昼夜节律。随着我国经济的全球化和快速发展,人们由于频繁时差切换和高强度轮班工作等无规律生活节奏而导致其体内褪黑素分泌合成失调并引起昼夜节律失调的现象也越来越多。许多研究表明通过经常进食高褪黑素含量的动植物食药材能有效补充人体内褪黑素含量并维持其代谢稳态而改善昼夜节律失调。因此,寻找和研究褪黑素高含量的动植物食药原料,特别是高褪黑素含量的大众植物食药原料具有重要现实价值。桑树（Morus alba L.）原产于中国,一直作为家蚕饲料而被大量种植,自古以来便是中国主要经济作物之一。以往对桑树的研究,主要集中在桑树品种选育、桑树栽培和病虫害防治等方面,其目的是为家蚕提供高产、优质的桑叶饲料。随着对桑树的深入研究,发现桑树不同部位富含多种营养成分和活性物质,使得其营养价值和药用价值也受到人们的关注,因而被国家卫生部列为“药食同源”的植物资源。最近研究表明与其他许多中药材和水果相比,桑叶和桑葚都属于高褪黑素含量植物资源,被认为是补充褪黑素最佳原材料之一。有研究表明同一植物物种内不同栽培品系或种质间褪黑素含量差异巨大,我国是桑树种质资源最丰富的国家,不同桑树种质资源圃收集并保存着大量的种质资源。因此,从大量桑种质资源中筛选出高褪黑素含量的桑品种或种质不但可作为人们日常生活中褪黑素补充合适的植物原料,也能为研究桑树高效褪黑素分子合成机理提供研究材料,具有重要的现实和科学意义。目前为止,为数不多的桑树褪黑素研究报道主要集中在其鉴定和含量测定方面,而桑树种质资源褪黑素及其异构体种类的系统鉴定、含量测定、高含量种质筛选及其生物合成分子机制尚未见报道,极大阻碍了桑树作为高效补充人体褪黑素大众原料的应用及其深度开发和多元利用。综上所述,本研究首先利用UPLC-MS/MS检测技术鉴定不同桑树品种/种质的褪黑素,并对50个不同桑树品种/种质褪黑素含量做定量分析筛选出褪黑素含量最高的桑树品种/种质。其次,利用生物信息学方法,从褪黑素含量最高桑种质—川桑（M.notabilis）全基因组数据库中鉴定出参与褪黑素生物合成相关基因,并开展表达谱分析,筛选参与褪黑素高效合成关键基因并开展体外酶活实验,阐明川桑高效合成褪黑素的分子机制。在桑树褪黑素鉴定实验中意外鉴定到桑树中存在天然褪黑素异构体并对不同品种桑树褪黑素异构体进行了定量分析。为了获得桑叶最佳收获部位和季节,对影响桑树中褪黑素和异构体总含量的非遗传因素也做了初步探究。由于本研究首次在植物组织中鉴定到天然褪黑素异构体,加上有关褪黑素异构体生物合成途径从未见报道过,故选取四个桑树品种不同组织为材料,用UPLC-MS/MS鉴定其不同组织中的褪黑素和异构体。同时利用qRT-PCR分析褪黑素生物合成相关候选基因的表达量,并筛选出可能参与褪黑素异构体生物合成的靶标基因,开展其体外酶活功能的验证分析,拟阐明桑树褪黑素异构体生物合成分子途径,为进一步解析其生物合成分子机理奠定了良好的基础。所获得的结果如下:1.不同桑树品种/种质褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选利用UPLC-MS/MS在鉴定不同桑树品种/种质叶片中褪黑素的含量过程中,鉴定到桑树中存在天然褪黑素异构体。在50个不同的桑树品种中,1个桑树品种/种质仅含有褪黑素,42个桑树品种仅含有褪黑素异构体MI-1,而其余7个既含有褪黑素又含有MI-1。为了探究不同桑树品种/种质之间褪黑素含量的差异,分析了50个不同桑树品种/种质叶片中褪黑素的含量。结果表明桑树中褪黑素含量为0.26至0.83 ng/g,相差3倍,最高五个桑种质依次是川桑、西农6071、神农架长穗桑、嘉陵16号和嘉陵20号。褪黑素及其异构体的总含量为0.23至20.58ng/g,相差89倍,最高五个桑种质依次是策沙、神农架长穗桑、小花叶皮桑、印度桑和甘洛6号。根据测定结果表明川桑、西农6071、神农架长穗桑可作为最佳补充褪黑素的原材料。为了探究环境条件对桑树褪黑素及异构体的影响,利用UPLC-MS/MS检测了不同采摘时间和不同成熟度的桑叶中褪黑素及异构体含量。结果表明褪黑素及其异构体总含量随着采摘时间的先增加后降低,随着叶片成熟度的增加逐渐增加。以上研究结果表明,在6月28日,第20叶位采摘策沙、神农架长穗桑、小花叶皮桑、叶片可获得最高褪黑素和异构体含量的桑叶原料。2.川桑（Morus notabilis）褪黑素高效生物合成分子机制解析褪黑素含量最高桑种质为川桑,在川桑基因组数据库中鉴定到37个褪黑素生物合成相关候选基因。以“川桑”为模板成功克隆到37个褪黑素生物合成相关的候选基因,即:一个色氨酸脱羧酶基因（MnTDC）,7个色胺5-羟化酶基因（MnT5H1-7）,6个5-羟色胺N-乙酰基转移酶基因（MnSNAT1-6）基因,20个N-乙酰5-羟色胺甲基转移酶基因（MnASMT1-20）和3个咖啡酸-氧-甲基转移酶基因COMT（MnCOMT1-3）。生物信息学分析表明桑树中褪黑素合成相关候选基因的结构特征与已经报道的褪黑素生物合成相关基因基本一致。结构域预测和多序列比对分析表明这些蛋白质都具有各蛋白家族催化活性所需的结构域和活性位点。利用qRT-PCR技术研究了褪黑素生物合成相关基因在川桑根、茎、叶和皮中的表达情况,结果表明这些基因在各组织中的表达模式不一,同一家族的不同基因表达量差异较大。MnTDC基因在川桑叶中的表达量是最高的。T5H1和T5H2相比较其他5个T5H基因在根、茎、叶和皮中的表达量较高,T5H7在四个组织多种的表达较低。SNAT1-SNAT5这5个基因的表达模式一致,但SNAT5基因在茎中的表达量是SNAT1的在茎中表达量的20倍。而SNAT6在4个组织中几乎不表达。20个ASMT基因中,ASMT12基因的在根和皮中的表达量是最高的,ASMT3基因在4个组织均不表达,除此之外其他的18个ASMT基因在4个组织中的表达量差异较大。MnCOMT1在茎中的表达最高。构建原核表达载体pCold TF-MnTDC、pCold TF-MnT5H2、pCold TF-MnSNAT5、pCold TF-MnASMT12和pCold TF-MnCOMT1,转入大肠杆菌,分别表达这5个重组蛋白并获得相应可溶的重组蛋白。体外酶活表明MnTDC重组蛋白与底物色氨酸在缓冲液中共孵育鉴定到产物色胺。MnT5H2重组蛋白与底物色胺在缓冲液中共孵育鉴定到产物5-羟色胺。MnSNAT5重组蛋白与底物5-羟色胺、乙酰辅酶A在缓冲液中共孵育鉴定到产物N-乙酰5-羟色胺。MnSNAT5重组蛋白与5-甲氧基色氨、乙酰辅酶A在缓冲液中共孵育鉴定到褪黑素。MnASMT12重组蛋白分别与底物5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物5-甲氧基色胺。MnASMT12重组蛋白分别与底物N-乙酰5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物褪黑素。MnCOMT1重组蛋白与底物5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物5-甲氧基色胺。MnCOMT1重组蛋白分别与底物N-乙酰5-羟色胺、S-腺苷-L-甲硫氨酸在缓冲液中共孵育都能鉴定到产物褪黑素。前人关于ASMT蛋白家族的研究表明,ASMT蛋白家族被分为三个亚家族（I,II,III）,但仅有一个亚家族的成员编码的蛋白表现ASMT蛋白酶的活性。在川桑中MnASMT12属于MnASMT蛋白家族的第I亚族,催化N-乙酰5-羟色胺转化为褪黑素,5-羟色胺转化为5-甲氧基色胺。为了探究MnASMT蛋白家族第II亚家族和第III亚家族成员的功能,我们根据MnASMT各亚家族基因的表达量,选择MnASMT第II亚家族的MnASMT16和第III亚家族的MnASMT20进行进一步研究。将重组的载体pCold TF-MnASMT16和pCold TF-MnASMT20在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,分别获得MnASMT16和MnASMT20重组蛋白。将N-乙酰5-羟色胺和S-腺苷-L-甲硫氨酸与分别含有MnASMT16和MnASMT20重组蛋白的反应缓冲液混合和孵育,用UPLC-MS/MS对产物进行分析,结果表明MnASMT16和MnASMT20都具有将N-乙酰5-羟色胺转化为褪黑素的能力。此外,将5-羟色胺和S-腺苷-L-甲硫氨酸与分别含有MnASMT16和MnASMT20重组蛋白的反应缓冲液进行共孵育,并使用UPLC-MS/MS对产物进行分析,结果表明只有MnASMT20重组蛋白将5-羟色胺转化为5-甲氧基色胺。总而言之,酶动力学和体外偶联测定结果表明桑树的褪黑素生物合成不但有多条不同途径,而且所有条途径都能有效地催化色氨酸转化为终产物褪黑素。此外,ASMT基因家族中三个亚家族基因编码的蛋白都有ASMT蛋白酶活性。以上结果表明,川桑可通过多途径、多基因能高效地催化色氨酸向褪黑素转化,可能是其保持丰富褪黑素含量的关键分子机制。3.桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析我们使用相同的桑树品种的不同的组织为实验材料,并利用相同提取和检测方法开展了褪黑素及其异构体的鉴定和定量分析。研究结果表明4个桑树品种褪黑素异构体的种类也有差异。4个桑树品种叶片中都含有褪黑素和两种褪黑素异构体（MI-2和MI-3）,果中仅含有褪黑素和异构体（MI-2）,其中“大十”叶和果中褪黑素及其异构体总含量都是最高的。利用qRT-PCR分析了褪黑素合成相关基因在两个桑树品种“大十”和“白玉皇”的叶、果中的表达情况。结果表明,除MaASMT4和MaASMT20都具有桑叶特异性高表达的模式外,其他参与褪黑素生物合成的基因在两个品种和两个器官的表达模式均不一致。为了进一步确认MaASMT4和MaASMT20两个基因桑叶特异高表达的模式,利用qRT-PCR分析结果表明MaASMT4和MaASMT20在“嘉陵30陵和“中桑5801MT都具有桑叶特异性高表达的模式,这种表达模式与MI-3特异存在叶中的模式一致。因此,将MaASMT4和MaASMT20两个基因作为合成褪黑素异构体MI-3的关键基因进行进一步的分析。以“大十”为模板克隆了MaASMT4和MaASMT20基因并构建原核表达载体pCold TFMaASMT4和pCold TF-MaASMT20,转入大肠杆菌表达其蛋白。外源表达的MaASMT4和MaASMT20重组蛋白体外酶活分析结果表明:属于ASMT基因家族第III亚家族的MaASMT4和MaASMT20在体外都能催化底物N-乙酰5-羟色胺转化成褪黑素异构体MI-3。为了探究MaASMT蛋白家族第I和第II亚家族成员的功能,基于其他两个亚家族不同基因的表达量,以“大十”员为模板克隆了ASMT基因家族第I和第II亚家族的MaASMT9和MaASMT16基因。构建原核表达载体的pCold TF-MaASMT9和pCold TF-MaASMT16转入大肠杆菌表达其重组蛋白。体外酶活结果表明ASMT蛋白家族第I亚家族的MaASMT9和第II亚家族的MaASMT16两个重组蛋白都能催化N-乙酰5-羟色胺转化成褪黑素。这些结果表明褪黑素异构体生物合成分子途径与褪黑素相似,白桑能用特定亚群的ASTM成员实现其体内褪黑素异构体的合成,为进一步植物褪黑素异构体生物合成分子机理解析打下了良好的基础。
常晨[4]（2021）在《树莓酮合成途径分析及其在微生物中异源高效表达》文中研究表明树莓酮,又名覆盆子酮,是一种存在于树莓中的香气化合物,具有重要的生理功能,广泛应用于食品、化妆品、农业、医药等领域。然而树莓酮的天然提取不仅产量低,而且受到季节和地域影响,无法满足市场需求。树莓酮的化学合成虽然产量高,但是存在污染环境、设备腐蚀严重、副产物多等问题。近年来通过微生物代谢工程合成天然产物中的活性物质研究引起了极大关注,脂肪酸作为一类高度还原的物质,经过β氧化可以产生重要的代谢前体乙酰辅酶A,并释放大量还原力。因此用脂肪酸作为生产树莓酮的碳源,提供充足的前体和能量。本文构建了能够利用甘油、脂肪酸等多种碳源生成树莓酮的大肠杆菌细胞工厂,通过构建并优化树莓酮合成途径;利用基因工程技术对大肠杆菌的代谢途径进行改造以积累中间产物丙二酸单酰辅酶A;同时结合脂肪酸高效利用模块,实现在大肠杆菌细胞工厂中树莓酮及其他四种聚酮类化合物的高水平合成。主要研究内容如下:（1）树莓酮的合成途径分析及表征。将来源于Arabidopsis thaliana的4-香豆酰辅酶A连接酶（At4CL1）、Rheum palmatum的苯亚甲基丙酮合酶（RpBAS）、Rubus idaeus的树莓酮合成酶（RiRZS1）基因在大肠杆菌BW25113中构建并优化树莓酮合成途径。采用中拷贝单质粒依次表达RiRZS1、RpBAS、At4CL1,得到菌株CR4;对合成途径中关键酶苯亚甲基丙酮合酶（BAS）进行分析,通过氨基酸序列比对和构建系统发育树,最终确定仍然是Rheum palmatum来源的BAS树莓酮产量最高,达到13.1 mg/L;在基因组上过表达curA（编码二氢姜黄素还原酶）以加强合成途径,得到菌株CR5,树莓酮产量达到16.2 mg/L。（2）丙二酸单酰辅酶A途径的改造。敲除代谢旁路基因poxB（编码丙酮酸氧化酶）、fabF（编码β-酮酰基-ACP合酶Ⅱ）,减少碳损失,使代谢流尽可能流向树莓酮合成方向;在基因组上过表达acs（编码乙酰-CoA合成酶）,加强乙酰辅酶A的生成;基因上过表达accBCDA（编码乙酰辅酶A羧化酶复合体）,加强丙二酸单酰辅酶A的生成;在基因组上过表达来自谷氨酸棒状菌的cgPPC（编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）和阿维链霉菌的BCDH（编码支链α-酮酸脱氢酶）,加强草酰乙酸以及丙二酸单酰辅酶A的生成;乙酰辅酶A羧化合成丙二酸单酰辅酶A、磷酸烯醇式丙酮酸缩化合成草酰乙酸为固碳反应,因此在基因组上过表达来源于聚球藻的碳酸氢盐转运蛋白BT和来源于藻青菌的碳酸酐酶CA以提高HCO-3的含量,最终树莓酮产量提高至59.3 mg/L。（3）树莓酮细胞工厂的性能优化。为了提高菌株稳定性和树莓酮产量,需要将多个基因整合至染色体,因此优化了 Nigri重组酶介导的连续整合大片段方法（Nigri recombinase mediated integration,NRMI）,使用该方法可以减少抗性消除过程中质粒的转入和消除,将119accBCDA和119bt-ca连续整合至fadR位点,阳性率可达到100%,且操作周期从7 d缩短到3d。同时对nox进行突变和筛选,可实现染色体多位点连续整合。并通过筛选和截短获得了脂肪酸诱导型frd3启动子,可应用到后续补充脂肪酸作为碳源时相关基因的微调。（4）脂肪酸利用模块的整合。引入脂肪酸高效利用模块,补充脂肪酸作为碳源之一为树莓酮合成提供大量前体和能量;敲除SthA（编码可溶性吡啶核苷酸转氢酶）,同时加强PntAB（编码膜结合吡啶核苷酸转氢酶）,实现NADH向NADPH的转换;树莓酮小试水平最佳的培养基成分与工艺条件为:培养基中脂肪酸1%、甘油3%、酵母粉1%、4-香豆酸5mM;诱导温度30℃;诱导剂L-阿拉伯糖0.01%,树莓酮达到98.6 mg/L。在1L发酵罐上扩大培养测试,并采取分批补料发酵法合成树莓酮,树莓酮产量达到192.57 mg/L,比小试培养提高了93.97 mg/L。（5）应用高产丙二酰辅酶A底盘合成其他四种聚酮类化合物。在前期构建的高产乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A的底盘细胞CC13中分别引入间苯三酚、Flaviolin、TAL和芦荟酮合成途径。PHL01间苯三酚产量达到18.48mg/L,与对照BW-PHL相比,产量提升了约4倍。FLA01菌株可产生的flaviolin相对含量是对照菌株BW-FLA的7倍。TAL01菌株可产生的TAL产量为1.06 mg/L,与对照BW-TAL相比,产量提升了约5倍。菌株ALS01产生的芦荟酮相对含量是对照BW-ALS的5倍。本研究通过在大肠杆菌中构建树莓酮合成途径,并对丙二酸单酰辅酶A合成途径和脂肪酸利用途径进行改造,实现了树莓酮的高效合成,并应用该底盘合成了四种聚酮类化合物,为聚酮类化合物的生产提供新的思路和研究依据。
吴铭洁,夏霖亚,王蕾,张宁,罗国良,殷玉和,吴丛梅[5]（2021）在《水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及病毒样颗粒制备》文中研究表明试验旨在制备水貂肠炎病毒（Mink enteritis parvovirus,MEV）可溶性VP2蛋白及其病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）。优化并合成MEV VP2基因,克隆至原核表达载体pET-30a（+）,将重组质粒pET-30a-VP2与分子伴侣pTf16共同转化到宿主菌ER2566中,以不同培养温度、L-阿拉伯糖浓度和IPTG浓度进行诱导表达,收集样品进行SDS-PAGE和Western blotting分析。通过硫酸铵沉淀结合蔗糖密度梯度离心法对表达产物进行纯化,由SDS-PAGE进行鉴定,透析去除蔗糖,通过动态光散射技术（DLS）和透射电子显微镜（TEM）观察不同组装条件下VLPs的粒径和形态。用制备的MEV VLPs疫苗免疫水貂评价其免疫原性。结果显示,以2 g/L L-阿拉伯糖、0.2 mmol/L IPTG、25℃培养16 h为诱导条件时,VP2蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,分子质量约为65 ku。经Western blotting鉴定VP2蛋白具有良好的抗原特异性。将此表达产物利用硫酸铵沉淀结合蔗糖密度梯度离心法纯化后,纯度可达90%以上。在pH 8.0,150 mmol/L NaCl的透析液中,VP2经自组装可形成与天然MEV形状和粒径相似且具有血凝特性(1∶214)的VLPs。VLPs疫苗免疫水貂21 d后,测得水貂血清中的血凝抑制（HI）抗体水平均相对最高,可达1∶211,说明该VLP疫苗有较好的免疫原性,能有效预防MEV的感染。本试验结果表明,将pET-30a-VP2与pTf16在原核表达系统中共表达,可获得具有高免疫原性的VLPs,为后期MEV VLPs疫苗的研发奠定基础。
史理陇[6]（2020）在《大肠杆菌中木酮糖裂解途径的构建和应用研究》文中提出木糖是自然界中储量第二的单糖,具有储量大、绿色环保和可再生的优点。但是相对葡萄糖来说,能够天然利用木糖的微生物较少,这大大制约了木糖通过微生物转化为高附加值产物的研究。本论文对大肠杆菌天然的木糖代谢途径进行改造,引入乳酸菌的木酮糖裂解途径,提高大肠杆菌对木糖的利用效率,利用该途径实现了聚-3-羟基丁酸酯（poly-3-hydroxybutyrate,PHB）的合成。论文首先利用Red重组的基因敲除方法,将大肠杆菌木糖代谢途径中编码核酮糖-5-磷酸异构酶的rpe基因进行敲除,阻断大肠杆菌中原有的木糖代谢途径,rpe突变体不能利用木糖生长。接下来,筛选得到两个来自乳酸菌的能够在大肠杆菌中具有正常功能的磷酸戊糖酮解酶基因ptk和xfp,迫使rpe基因缺失的大肠杆菌使用木酮糖裂解途径代谢木糖进行生长。敲除rpe并且分别表达ptk和xfp基因的重组菌能够在96h内完全消耗10g/L木糖,分别有2.43 g/L和3.12 g/L的乙酸生成。大量乙酸的积累阻碍了重组菌对木糖的高效利用,抑制大肠杆菌的生长。本论文接下来对大肠杆菌中乙酸生产相关的分支代谢途径进行了改造,敲除了编码丙酮酸氧化酶poxB和编码乙酸激酶ackA的基因。poxB和ackA基因缺失的突变体在发酵过程中仅有微量的乙酸积累,产量仅为0.07 g/L。最后,本论文在上述重组菌中表达了 PHB合成操纵子phaCAB,实现以木糖为碳源利用木酮糖裂解途径生产PHB。PHB合成是一个NADPH依赖的过程,重组菌在木糖代谢中生产的NADPH可能不足以支撑有效的PHB生产。论文尝试了表达NADP依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapC、NAD激酶基因yfjB和转氢酶基因pnt等,调控细胞内辅酶的供给。表达gapC、yfjB和pnt基因的重组菌成功在胞内积累了 PHB,产量分别为0.84 g/L、0.09g/L和0.55 g/L,最高产量是对照菌株PHB产量的10倍。
孙亚维[7]（2020）在《致病杆菌重组系统的建立和次级代谢产物基因簇的研究》文中提出致病杆菌属（Xenorhabdus sp.）是肠杆菌科一类与斯氏线虫属（Steinernema sp.）互利共生的革兰氏阴性细菌,能产生大量具有杀虫、抑菌、抗肿瘤等生物活性的次级代谢产物。基于对致病杆菌HNxs01基因组测序以及生物信息学分析,发现基因组中存在大量的隐性基因簇,而目前对致病杆菌次级代谢产物的研究缺乏有效的基因编辑方法,从而阻碍了新天然产物的发现。Red/ET同源重组技术通过短同源臂以及重组酶能够高效的促进双链断裂修复和瞬间重组,重组效率高,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。本研究旨在以Red/ET同源重组原理为基础,基于致病杆菌全基因组测序结果,应用致病杆菌自身噬菌体的重组酶在致病杆菌HNxs01中建立和优化新型重组酶系统,以便高效快捷地进行次级代谢产物的挖掘。主要研究结果如下:（1）致病杆菌和气单胞菌重组系统的研究。通过将致病杆菌和杀鲑气单胞菌的基因组及噬菌体基因与Red/ET同源重组蛋白进行Blast比对,在致病杆菌中获得了Redα、Redβ的同源蛋白,在气单胞菌中获得了RecE、Rec T、Redγ的同源蛋白,由此构建了致病杆菌和气单胞菌重组系统表达质粒,并在大肠杆菌中进行了重组效率的验证和比较。（2）电转化方法的建立。本研究测定了致病杆菌的生长曲线,探究了最佳电转缓冲液,以及电击时电压和培养基对电转化的影响。获得了致病杆菌最佳的电转条件是:在LB培养基中30℃振荡培养4 h（OD600为0.81.0）,制备感受态细胞时使用溶液A电转缓冲液（0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇、10%甘油）并添加蛋白酶K处理20 min,电压为1200 V,可以获得最佳的转化效率。（3）次级代谢产物的挖掘。基于同源重组双交换使HNxs01菌株cluster1失活,通过与野生型菌株的次级代谢产物比较,借助生物分子快速纯化系统和高效液相色谱分离,结合高分辨质谱和核磁共振技术,获得16 min差异峰（M16）和19 min差异峰（M19）。鉴定M16为白色无定型粉末,其特征吸收峰λmax（MeOH）为230 nm和260nm,相对分子质量是843,化学式为C45H61N7O9,由7个氨基酸（脯氨酸1-苏氨酸2-苯丙氨酸3-脯氨酸4-脯氨酸5-亮氨酸6-缬氨酸7（phe 1-Thr 2-phe 3-Pro 4-Pro 5-Leu 6-Val 7））和1个带脂肪链的氨基酸连接形成的环脂肽类化合物。鉴定M19为黄褐色油状物,其特征吸收峰λmax（MeOH）为240 nm和274 nm,相对分子质量为148。生物活性测定发现,M16和M19对白色念珠菌和枯草芽孢杆菌均表现出一定的抑菌效果,其中M16可致使肿瘤细胞HeLa和昆虫细胞CF-203皱缩变圆,贴壁性减弱,数量减少,并以剂量依赖性方式抑制两种细胞的增殖。上述结果表明,本研究不仅为致病杆菌基因编辑和遗传操作提供了有效的方法,也为其他细菌重组系统的构建和转化提供了新思路。同时,该研究方法也丰富了次级代谢产物库,为挖掘更多具有生物活性的天然产物奠定了基础。
雷欢[8]（2020）在《貉细小病毒样颗粒的研究》文中进行了进一步梳理貉细小病毒（Raccoon Dog Parvovirus,RDPV）属于细小病毒科,细小病毒属,通常会引起的一种急性,高接触性传染病,具有较高的病发率和致死率。自RDPV被发现以来,我国各地先后均有貉细小病毒性肠炎的报道,严重养危害貉业养殖的发展。目前国内RDPV的预防主要采用犬细小病毒弱毒疫苗或水貂肠炎病毒灭活疫苗,但保护率低,免疫效果一般。因此,研制特异性针对RDPV的安全,高效疫苗势在必行。为了利用大肠杆菌系统可溶性表达RDPV VP2蛋白,获得RDPV病毒样颗粒（Virus-like Particles,VLPs）。本研究首先根据大肠杆菌对密码子的偏爱性,对RDPV VP2基因序列进行优化并合成,构建重组表达质粒pET30a-VP2,转化E.coli ER2566感受态细胞。SDS-PAGE检测显示,VP2蛋白主要以包涵体形式表达;为了提高VP2蛋白可溶性表达,将重组表达质粒pET30a-VP2与分子伴侣pTf16共同转入E.coli ER2566感受态细胞进行诱导表达,通过Western-Blot鉴定RDPV VP2蛋白,并对表达条件进行优化。结果表明,RDPV VP2蛋白得到了大量表达,并且大部分以可溶性形式,最佳诱导条件为30℃,0.1 mmol/L IPTG,2 g/L L-阿拉伯糖;犬细小单克隆抗体可以特异性识别RDPV VP2蛋白。然后对纯化条件进行了优化。首先通过硫酸铵沉淀进行初级纯化,SDS-PAGE检测显示,30%硫酸铵沉淀去除了大量分子伴侣蛋白Tf16。然后分别采用分子筛层析,蔗糖密度梯度离心,疏水层析作为第二步纯化。结果显示:运用疏水层析在0.2 mol/L（NH4）2SO4的盐浓度下,大量RDPV VP2蛋白可以通过流穿穿出,其中目的蛋白的浓度可达485.5μg/mL,回收率可达90%,优于分子筛层析和蔗糖密度梯度离心。动态光散射和透射电镜分析显示:当组装液条件为50mmol/L Tris,250 mmol/L NaCl,pH 8.0时,VP2蛋白可自行组装成均一的,大小为24 nm左右的RDPV VLPs,其形态学结构与天然RDPV相似,血凝效价为216。用RDPV VLPs刺激免疫幼貉,对其体液免疫评估后发现可诱发高水平的血凝抑制抗体。在长达三个月的免疫中,当RDPV VLPs浓度≥20μg时血凝抑制抗体都保持在1︰80以上,达到了攻毒免疫保护的水平。说明本研究获得的RDPV VLPs具有良好的免疫原性。本研究通过分子伴侣与目的蛋白共表达的策略得到的VLPs具有高产量和高免疫原性的优势,这将可能成为RDPV疫苗的潜在候选者。
毛旭丹[9]（2020）在《类组蛋白StpA对大肠杆菌I-E型CRISPR-Cas系统调控机制研究》文中研究指明为了适应外界压力,细菌或古菌往往会通过水平转移的方式获取外源基因。与此同时,细菌或古菌也需要防止外源有害基因入侵,为此,它们进化出了CRISPR-Cas系统介导的适应性免疫机制。CRISPR-Cas系统可以特异性高效地切割外源侵入的DNA。目前对CRISPR-Cas系统作用机制的研究较为透彻,但对其调控机制的了解并不深入。文献报道大肠杆菌中存在I-E型CRISPR-Cas系统,类组蛋白H-NS抑制CRISPR-Cas系统,但其同源蛋白Stp A对大肠杆菌CRISPR-Cas系统的调控尚未有报道。本文主要探究Stp A对I-E型CRISPR-Cas系统的调控机制。首先,本论文建立了检测cas启动子活性的荧光报告体系和检测CRISPR-Cas系统切割靶标DNA功能的实验体系,发现在hns缺失的情况下Stp A可以激活cas启动子,促进cr RNA含量的增加,从而增强I-E型CRISPR-Cas系统切割靶标质粒的能力。其次,为了鉴定H-NS和Stp A在cas启动子上的结合位点,本论文通过突变预测的H-NS结合位点,证实H-NS的确通过与该位点结合抑制cas操纵子转录,Stp A通过结合H-NS的结合位点调控cas启动子活性。进一步的研究表明hns突变株中高水平表达Stp A对cas基因表达具较弱的抑制作用;而低水平表达Stp A可激活cas基因表达,提高CRISPR-Cas系统活性。文献报道镁离子可在体外影响H-NS和Stp A与DNA的结合。本论文探索了镁离子对Stp A调控cas基因表达的影响,发现在M9基本培养基中添加镁离子显着提高Stp A调控cas启动子的稳定性,使其在更广的p H值范围内均可激活cas基因表达。综上所述,Stp A不仅可以激活CRISPR-Cas系统的cas基因表达,而且还可以促进cr RNA的产量,进而提高CRISPR-Cas系统的防御外源DNA入侵的能力;Stp A通过结合cas启动子上H-NS结合位点调控cas基因表达;Stp A表达水平影响其对cas基因表达的调控作用:高水平表达Stp A抑制cas基因表达,而低水平表达Stp A激活cas启动子。此外,本论文初步研究结果显示镁离子可以提高Stp A调控cas启动子的稳定性。
何猛超[10]（2020）在《基于ARTP诱变的耐酸/碱谷氨酸棒杆菌的筛选及其pH智能调节系统的构建》文中认为谷氨酸棒杆菌是一种从土壤中分离的、食品安全级的革兰氏阳性细菌,被广泛应用于氨基酸等产品的生产。近年来,随着合成生物学的发展,以谷氨酸棒杆菌为底盘的人工细胞工厂用于合成多种生物能源和精细化学产品越来越受到广泛关注。然而在发酵过程中会面临诸如高温、pH、有机溶剂、有毒副产物和机械损伤等多种不良因素,这些不良因素的胁迫会影响微生物细胞的正常生理功能,进而导致微生物细胞的转化效率降低和工业产品的产量降低。其中pH是影响微生物生长的重要因素。发酵过程中,pH调控不当会引起发酵体系pH的急剧波动,进而造成酸碱胁迫,极大影响到微生物细胞的生长及目标产物的积累。本文主要通过非理性的ARTP诱变和理性的合成生物学技术两个方面来实现谷氨酸棒杆菌对酸碱耐受和自我调控性并提高其鲁棒性,具体研究结果如下:（1）对谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum ATCC13032）进行ARTP诱变,然后通过高通量筛选得到能够耐受pH 5.0的菌株18株,耐受pH 11.0的菌株25株,通过实验室摇瓶复筛和传代稳定性的验证,最终得到一株可在pH 5.0条件下生长情况较好且较稳定的菌株icgTAC02,一株在pH 11.0条件下生长情况较好且较稳定的耐碱菌株icgTAI02。（2）在谷氨酸棒杆菌中,利用β-半乳糖苷酶对本课题组之前挖掘到的并在大肠杆菌（E.coli.k12）中进行了验证的酸碱响应型启动子P-asr、P-atp2进行了酸碱相应及强度表征,结果表明P-asr在pH 6.5时强度最高;P-atp2在pH 10.0时强度最高。（3）通过KEGG、NCBI等数据库挖掘了来自谷氨酸棒杆菌内源的产酸基因PQO、aceE、Idh和课题组已经验证过的产碱基因glsA、gad,通过合成生物学手段在谷氨酸棒杆菌中构建了pH智能调节基因线路。通过在不同pH条件下发酵结果可知,在具有碱性调控线路的工程菌株中,当pH为10.0时,Patp2-PQO、Patp2-aceE、Patp2-Idh能够迅速响应碱性环境并及时产酸来中和环境中的碱;在具有酸性调控线路的工程菌株中,当pH在6.5时,Pasr-glsA、Pasr-gadA能够迅速响应酸性环境并能够及时产碱来中和环境中的酸,来实现pH的自我智能调控。（4）为了验证这两条酸碱调控线路的的相容性,通过构建双质粒系统将酸碱调控线路整合到谷氨酸棒杆菌中,通过菌体生长情况及谷氨酸的产量来表征该调控线路的调控能力。结果表明,当不人为控制培养基的pH时,野生菌L-谷氨酸的产量为6.1 g/L,氨水的用量为15.0 mL;工程菌株的L-谷氨酸的产量为7.1 g/L,比野生菌提高了16.4%;氨水的用量11.0 mL,比野生菌减少了26.6%。说明构建的pH调控线路在发酵过程中有一定调控能力。
二、sIL-16在大肠杆菌中的表达及活性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、sIL-16在大肠杆菌中的表达及活性分析（论文提纲范文）
（1）小麦阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基转移酶基因TaBAHD的克隆与功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩略语中英文对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 小麦品质重要性状及其影响因素 |
| 1.2 小麦籽粒阿魏酰阿拉伯木聚糖的结构及其功能特性 |
| 1.3 小麦籽粒阿魏酰阿拉伯木聚糖与BAHD基因密切相关 |
| 1.4 小麦籽粒TaBAHD基因的克隆及功能标记开发 |
| 1.5 表达分析、基因编辑技术在农业中的应用 |
| 1.6 研究意义及目的 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 小麦TaBAHD-B1及TaBAHD-D1 基因的克隆及功能标记开发 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因表达模式分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因重组蛋白表达及条件优化 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1 基因编辑及突变体鉴定 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 全文总结与展望 |
| 6.1 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因的克隆及功能标记开发 |
| 6.2 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1 基因表达模式分析 |
| 6.3 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因基因重组蛋白表达及表达条件优化 |
| 6.4 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1 基因编辑及突变体鉴定 |
| 6.5 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 2021年5月作者简历 |
（2）高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 序言 |
| 1.1 蓝细菌的光合作用 |
| 1.1.1 藻胆体及其能量传递机制 |
| 1.1.2 藻胆蛋白 |
| 1.1.3 胆色素及其生物合成 |
| 1.1.4 藻胆蛋白的生物合成 |
| 1.1.5 连接蛋白 |
| 1.2 光敏色素 |
| 1.3 荧光蛋白的研究进展 |
| 1.3.1 绿色荧光蛋白家族 |
| 1.3.2 橙红色荧光蛋白家族 |
| 1.3.3 结合胆绿素的近红外荧光蛋白 |
| 1.4 超分辨显微技术 |
| 1.5 本课题研究目的与意义 |
| 2 基于7335ApcE2与7203ApcF2嵌合的近红外荧光探针研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 培养基与试剂 |
| 2.2.3 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 定点诱变和缺失诱变 |
| 2.3.2 制备感受态细胞 |
| 2.3.3 蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.4 吸收和荧光光谱的测定 |
| 2.3.5 摩尔消光系数、荧光量子产率及分子亮度的测定 |
| 2.3.6 序列比对 |
| 2.3.7 三维结构的模拟 |
| 2.3.8 色素的萃取 |
| 2.3.9 荧光寿命的测定 |
| 2.3.10 融合基因表达质粒的构建 |
| 2.3.11 融合基因标记质粒的构建 |
| 2.3.12 动物细胞的复苏、培养与转染 |
| 2.3.13 荧光蛋白在动物细胞内亮度的测定 |
| 2.3.14 蛋白浓度和色素浓度的测定 |
| 2.3.15 蛋白pH稳定性的测定 |
| 2.3.16 蛋白热稳定性的测定 |
| 2.3.17 蛋白聚集态的体外分析 |
| 2.3.18 蛋白聚集态的体内分析 |
| 2.3.19 正置荧光显微镜对色素蛋白的成像 |
| 2.3.20 蛋白标记细胞的SIM成像 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 由ApcE2进化的可溶性藻胆蛋白BDFP3的获得 |
| 2.4.2 色素PФB制备产量的提高 |
| 2.4.3 7335ApcE2与7203ApcF2三联嵌合体的获得 |
| 2.4.4 BDFP1.1/1.2: BDFP3.1: BDFP1.1/1.2的荧光寿命的研究 |
| 2.4.5 FRET提高融合蛋白在细胞内有效亮度的研究 |
| 2.4.6 融合蛋白聚集态的分析 |
| 2.4.7 融合蛋白稳定性的分析 |
| 2.4.8 融合蛋白在哺乳动物细胞中超分辨成像 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 3 基于7335ApcE2与7203ApcF2嵌合的远红光荧光探针研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 主要材料 |
| 3.2.2 培养基与试剂 |
| 3.2.3 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.2 吸收和荧光光谱的测定 |
| 3.3.3 蛋白光谱参数的计算 |
| 3.3.4 圆二色光谱的测定 |
| 3.3.5 荧光寿命的测定 |
| 3.3.6 SDS-PAGE和染色 |
| 3.3.7 融合基因表达质粒的构建 |
| 3.3.8 融合基因标记质粒的构建 |
| 3.3.9 动物细胞的复苏、培养与转染 |
| 3.3.10 细胞内亮度的测定 |
| 3.3.11 蛋白浓度和色素浓度的测定 |
| 3.3.12 色素蛋白的酶解 |
| 3.3.13 蛋白pH和热稳定性的测定 |
| 3.3.14 蛋白聚集态的体外分析 |
| 3.3.15 蛋白聚集态的体内分析 |
| 3.3.16 融合蛋白的SIM超分辨成像 |
| 3.3.17 高分辨率激光共聚焦扫描显微成像 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 可溶性BDFP3非共价结合PEB的研究 |
| 3.4.2 极亮的红色荧光蛋白BDFP3.3的获得 |
| 3.4.3 7335ApcE2与7203ApcF2三联嵌合体的获得 |
| 3.4.4 BDFP1.2/1.6: BDFP3.3: BDFP1.2/1.6的荧光寿命的研究 |
| 3.4.5 FRET提高融合蛋白在细胞内有效亮度的研究 |
| 3.4.6 用BDFP3.3的酶解液代替游离的色素PEB |
| 3.4.7 BDFP3.3及其融合蛋白的聚集态分析 |
| 3.4.8 BDFP3.3及其融合蛋白的稳定性分析 |
| 3.4.9 BDFP3.3及其融合蛋白在哺乳动物细胞中标记成像 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 4 基于ApcF2的远红光单体高亮度荧光蛋白的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 主要材料 |
| 4.2.2 培养基与试剂 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 诱变体库的构建方法 |
| 4.3.2 诱变体的蛋白表达与纯化 |
| 4.3.3 诱变体的序列鉴定 |
| 4.3.4 蛋白的聚集态分析 |
| 4.3.5 蛋白的序列比对 |
| 4.3.6 三维结构的模拟 |
| 4.3.7 诱变体的结晶 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 远红光单体BDFPs的随机诱变筛选结果 |
| 4.4.2 诱变体的亮度分析 |
| 4.4.3 诱变体v9的晶体筛选 |
| 4.4.4 诱变体v9的晶体结构的分析 |
| 4.4.5 smURFP晶体结构的分析 |
| 4.4.6 基于诱变体v9晶体结构的BDFPs的优化 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 5 论文总结 |
| 5.1 本文小结 |
| 5.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 褪黑素及异构体的概述 |
| 1.1.1 褪黑素的概述 |
| 1.1.2 褪黑素异构体的概述 |
| 1.2 褪黑素及异构体的分布 |
| 1.2.1 褪黑素的分布 |
| 1.2.2 褪黑素异构体的分布 |
| 1.3 褪黑素及异构体的生理功能 |
| 1.3.1 褪黑素在动物体中的功能 |
| 1.3.2 褪黑素在植物中中的功能 |
| 1.3.3 褪黑素异构体的功能 |
| 1.4 植物褪黑素及异构体的生物合成 |
| 1.4.1 褪黑素生物合成路径 |
| 1.4.2 色氨酸脱羧酶(TDC) |
| 1.4.3 色胺5-羟化酶(T5H) |
| 1.4.4 5-羟色胺N-乙酰基转移酶(SNAT) |
| 1.4.5 N-乙酰5-羟色胺甲基转移酶(ASMT) |
| 1.4.6 咖啡酸-氧-甲基转移酶(COMT) |
| 1.5 桑树中褪黑素研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究的目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 不同桑树品种/种质褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选 |
| 2.2.2 川桑褪黑素高效生物合成分子机制解析 |
| 2.2.3 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析 |
| 2.3 研究路线 |
| 第三章 不同桑树品种褪黑素及异构体的鉴定和定量分析 |
| 3.1 材料的数据 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 3.1.3 主要使用仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同桑树品种资源中褪黑素检测与鉴定 |
| 3.2.2 不同桑树品种资源褪黑素及其异构体总含量变化 |
| 3.2.3 不同采摘季节的桑叶褪黑素及其异构体含量变化 |
| 3.2.4 不同发育程度的桑叶褪黑素及其异构体含量变化 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 3.3.1 本章讨论 |
| 3.3.2 本章小结 |
| 第四章 川桑褪黑素生物合成相关基因的鉴定、克隆与生物信息学分析 |
| 4.1 材料及主要试剂 |
| 4.1.1 生物材料 |
| 4.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 4.1.3 主要使用仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 桑树褪黑素生物合成相关基因的鉴定 |
| 4.2.2 RNA提取及质量检测 |
| 4.2.3 川桑褪黑素生物合成相关基因的克隆 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 川桑中褪黑素生物合成相关基因的的序列鉴定 |
| 4.3.2 MnTDC基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.3 MnT5H基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.4 MnSNAT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.5 MnASMT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.3.6 MnCOMT基因家族的序列比对和进化分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 本章讨论 |
| 4.4.2 本章小结 |
| 第五章 川桑褪黑素生物合成相关基因表达分析和亚细胞定位 |
| 5.1 材料及主要试剂 |
| 5.1.1 生物材料 |
| 5.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 5.1.3 主要使用仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实时荧光定量PCR检测褪黑素合成相关基因在川桑不同组织的表达量 |
| 5.2.2 亚细胞定位引物设计及载体的选择 |
| 5.2.3 亚细胞定位载体的构建 |
| 5.2.4 亚细胞定位载体转化农杆菌 |
| 5.2.5 褪黑素生物合成相关基因的亚细胞定位 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 川桑褪黑素生物合成相关基因在不同组织表达分析 |
| 5.3.2 川桑褪黑素生物合成相关基因的亚细胞定位 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 本章讨论 |
| 5.4.2 本章小结 |
| 第六章 川桑褪黑素生物合成机制研究 |
| 6.1 材料及主要试剂 |
| 6.1.1 生物材料 |
| 6.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 6.1.3 主要使用仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 原核表达载体的构建 |
| 6.2.2 纯化靶标蛋白 |
| 6.2.3 靶标蛋白酶活测定 |
| 6.2.4 影响酶活因素 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 MnTDC重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.2 MnT5H2重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.3 MnSNAT5重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.4 MnASMTs重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.3.5 MnCOMT1重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 6.4.1 本章讨论 |
| 6.4.2 本章小结 |
| 第七章 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径解析 |
| 7.1 材料及主要试剂 |
| 7.1.1 生物材料 |
| 7.1.2 主要试剂及溶液配制方法 |
| 7.1.3 主要使用仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 RNA提取及质量检测 |
| 7.2.2 实时荧光定量PCR检测褪黑素合成相关基因在桑树不同组织的表达量 |
| 7.2.3 桑树MaASMT4、MaASMT9、MaASMT16和MaASMT20基因的克隆 |
| 7.2.4 原核表达载体的构建 |
| 7.2.5 纯化靶标蛋白 |
| 7.2.6 靶标蛋白酶活测定 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 桑树不同组织中褪黑素和异构体的检测与鉴定 |
| 7.3.2 褪黑素生物合成相关基因在桑树组织特异性表达分析 |
| 7.3.3 MaASMT4和MaASMT20在桑树中克隆分析 |
| 7.3.4 MaASMTs重组蛋白的功能验证和活性分析 |
| 7.4 讨论与小结 |
| 7.4.1 本章讨论 |
| 7.4.2 本章小结 |
| 第八章 全文总结 |
| 8.1 不同桑树品种褪黑素及异构体的鉴定和定量分析以及高含量种质筛选 |
| 8.2 川桑褪黑素高效生物合成分子机制 |
| 8.3 桑树褪黑素异构体生物合成分子途径 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的文章及参研的课题 |
| 致谢 |
（4）树莓酮合成途径分析及其在微生物中异源高效表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 树莓酮概述 |
| 1.1.1 树莓酮的结构与理化性质 |
| 1.1.2 树莓酮的生理功能及应用 |
| 1.2 树莓酮的生产方法 |
| 1.2.1 天然提取法生产树莓酮 |
| 1.2.2 化学合成法生产树莓酮 |
| 1.2.3 生物法合成树莓酮的研究进展 |
| 1.2.4 树莓酮生物合成途径 |
| 1.3 碳源对树莓酮生物合成的影响 |
| 1.3.1 以脂肪酸、甘油、葡萄糖为底物的对比 |
| 1.3.2 大肠杆菌的脂肪酸代谢 |
| 1.4 大肠杆菌代谢途径的改造工具和策略 |
| 1.4.1 大肠杆菌作为代谢工程的宿主 |
| 1.4.2 基因编辑工具 |
| 1.4.3 启动子和RBS工程 |
| 1.4.4 代谢通量的优化 |
| 1.5 研究目的意义、主要内容、创新点 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 主要创新点 |
| 1.5.4 主要技术路线 |
| 2 树莓酮的合成途径分析及表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 试剂与耗材 |
| 2.2.3 培养基及各种试剂配置 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 基因合成 |
| 2.3.2 引物设计 |
| 2.3.3 PCR扩增 |
| 2.3.4 PCR产物回收纯化及切胶回收 |
| 2.3.5 化转感受态细胞制备 |
| 2.3.6 质粒构建 |
| 2.3.7 双酶切质粒 |
| 2.3.8 质粒提取 |
| 2.3.9 质粒化转 |
| 2.3.10 电转感受态细胞制备 |
| 2.3.11 λ-red重组更换启动子 |
| 2.3.12 抗性消除 |
| 2.3.13 菌落验证PCR |
| 2.3.14 大肠杆菌基因组的提取 |
| 2.3.15 HPLC检测 |
| 2.3.16 发酵生产树莓酮 |
| 2.3.17 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 2.3.18 数据处理与分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 树莓酮合成途径构建及相关酶表达比例优化 |
| 2.4.2 发酵生产树莓酮 |
| 2.4.3 树莓酮合成途径分析 |
| 2.4.4 强化curA表达的影响 |
| 2.5 小结 |
| 3 丙二酸单酰辅酶A途径的改造 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 试剂与耗材 |
| 3.2.3 培养基及各种试剂配置 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 P1噬菌体转导敲除基因 |
| 3.3.3 抗性消除 |
| 3.3.4 λ-red同源重组插入目的基因 |
| 3.3.5 HPLC检测乙酸 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 阻断竞争途径增加乙酰辅酶A供应 |
| 3.4.2 过表达乙酰辅酶A羧化酶增加丙二酸单酰辅酶A供应 |
| 3.4.3 过表达生物素合成酶的影响 |
| 3.4.4 过表达外源磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和支链α-酮酸脱氢酶 |
| 3.4.5 引入蓝藻CCM机制增加胞内HCO_3~- |
| 3.4.6 削弱脂肪酸合成途径减少丙二酸单酰辅酶A消耗 |
| 3.5 小结 |
| 4 树莓酮细胞工厂的性能优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 试剂与耗材 |
| 4.2.3 培养基及各种试剂配置 |
| 4.2.4 仪器与设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 引物设计 |
| 4.3.2 重组质粒构建 |
| 4.3.3 NRMI连续整合方法 |
| 4.3.4 nox位点突变 |
| 4.3.5 绿色荧光蛋白荧光检测和OD600检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 NRMI整合方法的优化 |
| 4.4.2 大片段连续整合的应用 |
| 4.4.3 突变nox位点进行多位点整合 |
| 4.4.4 大肠杆菌脂肪酸诱导型启动子的筛选及截短 |
| 4.5 小结 |
| 5 脂肪酸利用模块的整合 |
| 5.1 引言 |
| 5.1.1 菌株与质粒 |
| 5.1.2 试剂与耗材 |
| 5.1.3 培养基及试剂配置 |
| 5.1.4 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 培养基成分对树莓酮产量的影响 |
| 5.2.3 诱导剂浓度对树莓酮产量的影响 |
| 5.2.4 4-香豆酸浓度对树莓酮产量的影响 |
| 5.2.5 诱导温度对树莓酮产量的影响 |
| 5.2.6 GC检测脂肪酸 |
| 5.2.7 1L发酵罐高密度培养 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 整合脂肪酸利用模块 |
| 5.3.2 脂肪酸诱导型启动子Pfrd3应用 |
| 5.3.3 培养基成分的优化 |
| 5.3.4 诱导剂浓度的优化 |
| 5.3.5 4-香豆酸浓度的优化 |
| 5.3.6 诱导温度的优化 |
| 5.3.7 1L发酵罐高密度培养 |
| 5.4 小结 |
| 6 其他四种聚酮类化合物的合成 |
| 6.1 引言 |
| 6.1.1 菌株与质粒 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 引物设计 |
| 6.2.2 重组质粒构建 |
| 6.2.3 产物检测方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 HPLC检测间苯三酚和TAL |
| 6.3.2 利用高产丙二酰辅酶A底盘高效合成间苯三酚 |
| 6.3.3 利用高产丙二酰辅酶A底盘高效合成Flaviolin |
| 6.3.4 利用高产丙二酰辅酶A底盘高效合成TAL |
| 6.3.5 利用高产丙二酰辅酶A底盘高效合成芦荟酮 |
| 6.4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（5）水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及病毒样颗粒制备（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 VP2表达载体的构建 |
| 1.2.2 VP2蛋白的表达及可溶性分析 |
| 1.2.3 VP2蛋白表达条件的确定 |
| 1.2.4 重组蛋白的纯化 |
| 1.2.5 VLP组装条件和表征 |
| 1.2.6 MEV VLPs血凝试验(HA) |
| 1.2.7 水貂免疫试验 |
| 2 结 果 |
| 2.1 VP2表达载体的构建 |
| 2.2 VP2蛋白的表达及可溶性分析 |
| 2.3 VP2表达条件的确定 |
| 2.4 VP2蛋白纯化 |
| 2.5 MEV VLP的组装与表征 |
| 2.5.1 MEV VLP组装条件的确定 |
| 2.5.2 MEV VLPs的电镜观察 |
| 2.6 MEV VLPs血凝试验 |
| 2.7 水貂免疫和攻毒试验 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（6）大肠杆菌中木酮糖裂解途径的构建和应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 木糖简介 |
| 1.2 不同微生物利用木糖的途径 |
| 1.2.1 天然木糖代谢途径 |
| 1.2.2 木糖代谢重组菌 |
| 1.2.3 改造木糖运输途径 |
| 1.3 木糖合成生物基化学品的研研究 |
| 1.3.1 木糖生物转化制备乙醇 |
| 1.3.2 木糖生物转化制备乳酸 |
| 1.3.3 木糖生物转化制备木糖醇 |
| 1.4 论文选题的目的与意义 |
| 第二章 大肠杆菌中木酮糖裂解途径的初步构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 本章中用到的质粒 |
| 2.2.2 本章中用到的菌种 |
| 2.2.3 本章中用到的引物 |
| 2.2.4 基本实验试剂和设备 |
| 2.2.5 基本操作方法 |
| 2.2.5.1 培养基及抗生素配置 |
| 2.2.5.2 无菌操作 |
| 2.2.5.3 高温蒸汽灭菌 |
| 2.2.5.4 摇瓶发酵取样 |
| 2.2.5.5 吸光值测定 |
| 2.2.5.6 高效液相色谱分析 |
| 2.3 rpe基因的敲除及其影响 |
| 2.3.1 rpe基因的敲除 |
| 2.3.2 基因敲除对大肠杆菌的影响 |
| 2.4 磷酸戊糖酮解酶基因的筛选 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 强化乙酰辅酶A合成对木糖代谢的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 本章中用到的质粒 |
| 3.2.2 本章中用到的菌种 |
| 3.2.3 本章中用到的引物 |
| 3.3 质粒pEn-pta的构建 |
| 3.4 质粒pEn-xfp-pta和pEn-ptk-pta的构建 |
| 3.4.1 pEn-ptk-pta的构建 |
| 3.4.2 pEn-xfp-pta的构建 |
| 3.5 重组菌WT△rpe (pEn-ptk-pta)和WT△rpe (pEn-xfp-pta)的构建以及摇瓶实验 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 分支代谢途径缺失对木糖代谢的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 本章中用到的质粒 |
| 4.2.2 本章中用到的菌种 |
| 4.2.3 本章中用到的引物 |
| 4.3 基因poxB的敲除及其影响 |
| 4.3.1 基因poxB的敲除 |
| 4.3.2 验证基因poxB敲除对乙酸生产的影响 |
| 4.4 基因ackA的敲除及其影响 |
| 4.4.1 基因ackA的敲除 |
| 4.4.2 基因ackA敲除的影响 |
| 4.5 基因ackA和poxB双敲除及其影响 |
| 4.5.1 基因ackA和poxB的双敲除 |
| 4.5.2 基因ackA和poxB双敲除的影响 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 利用木酮糖裂解途径合成PHB |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 本章中用到的质粒 |
| 5.2.2 本章中用到的菌种 |
| 5.2.3 本章中用到的引物 |
| 5.2.4 基本操作方法 |
| 5.2.4.1 收集菌体及冷冻干燥 |
| 5.2.5.2 气相色谱测定PHB |
| 5.3 p5En质粒构建以及pEn-xfp-pta载体替换 |
| 5.3.1 p5En质粒的构建 |
| 5.3.2 质粒p5En-xfp-pta的构建 |
| 5.4 PHB生产菌的培养结果和分析 |
| 5.4.1 PHB生产菌株的构建 |
| 5.4.2 WT△RPA(pBHR68+p5En-xfp-pta)和WT (pBHR68)生产PHB结果分析 |
| 5.5 优化PHB生产途径 |
| 5.5.1 gapC基因的过表达及其对PHB产量的影响 |
| 5.5.2 pEn-yfjB、pEn-pnt、p5En-xfp-pta-yfjB和p5En-xfp-pta-pnt质粒的构建 |
| 5.5.3 yfjB和pnt基因与gapC基因共表达 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 结论、创新点及展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表论文 |
| 作者与导师简介 |
| 附件 |
（7）致病杆菌重组系统的建立和次级代谢产物基因簇的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 Red/ET同源重组技术 |
| 1.1.1 Red/ET重组工程作用原理 |
| 1.1.2 Red/ET重组作用元件 |
| 1.1.3 Red/ET重组的应用 |
| 1.1.4 其他细菌的同源重组系统 |
| 1.2 致病杆菌 |
| 1.2.1 致病杆菌研究进展 |
| 1.3 气单胞菌研究背景 |
| 1.4 天然产物的简介 |
| 1.4.1 隐性基因簇的研究方法 |
| 1.5 立题依据和意义 |
| 第二章 致病杆菌重组系统的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 培养基、缓冲液和抗生素 |
| 2.2.3 引物 |
| 2.2.4 主要仪器、试剂和软件 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 PCR扩增以及纯化 |
| 2.3.2 菌落PCR |
| 2.3.3 质粒的提取 |
| 2.3.4 DNA除盐 |
| 2.3.5 酶切与酶连 |
| 2.3.6 大肠杆菌电转化 |
| 2.3.7 致病杆菌电转化 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 致病杆菌重组蛋白表达质粒的构建 |
| 2.4.2 致病杆菌重组系统的验证以及效率的比较 |
| 2.4.3 致病杆菌最佳电转时间的测定 |
| 2.4.4 优化重组系统并转入致病杆菌 |
| 2.4.5 筛选致病杆菌HN_xs01的电转缓冲液 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 气单胞菌重组系统的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养基、缓冲液和抗生素 |
| 3.2.3 引物 |
| 3.2.4 主要仪器与试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 嗜水气单胞菌电转化 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 气单胞菌重组蛋白表达质粒的构建 |
| 3.4.2 气单胞菌重组系统的验证以及效率的比较 |
| 3.4.3 优化重组质粒并转入嗜水气单胞菌 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 致病杆菌HN_xs01次级代谢产物基因簇的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 4.2.2 培养基和缓冲液 |
| 4.2.3 引物 |
| 4.2.4 主要仪器与试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 敲除载体的构建 |
| 4.3.2 野生型菌株HN_xs01和敲除菌株发酵产物的比较 |
| 4.3.3 差异化合物的大量提取,分离纯化及结构鉴定 |
| 4.3.4 细胞毒性实验分析 |
| 4.3.5 抗菌活性分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 生物信息学分析X.stockiae HN_xs01 的基因组 |
| 4.4.2 基因簇cluster1 敲除菌株的构建 |
| 4.4.3 基因簇cluster11 敲除菌株的构建 |
| 4.4.4 敲除菌株△cluster1 和野生型菌株发酵产物的比较 |
| 4.4.5 差异化合物的分离纯化 |
| 4.4.6 差异化合物的结构解析 |
| 4.4.7 差异化合物的生物活性检测 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读硕士学位期间撰写和发表的论文 |
| 课题受资助的项目 |
| 致谢 |
（8）貉细小病毒样颗粒的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词简表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 RDPV的概述 |
| 1.1.1 RDPV的形态与基因结构 |
| 1.1.2 RDPV的理化性质 |
| 1.1.3 RDPV的受体 |
| 1.1.4 RDPV的衣壳蛋白VP2 |
| 1.2 衣壳蛋白VP2在新型疫苗研究中的应用 |
| 1.2.1 衣壳蛋白VP2在基因工程活载体疫苗研制中的应用 |
| 1.2.2 衣壳蛋白VP2在DNA疫苗研制中的应用 |
| 1.2.3 衣壳蛋白VP2在病毒样颗粒疫苗研制中的应用 |
| 1.3 病毒样颗粒的表达系统选择 |
| 1.3.1 酵母表达系统 |
| 1.3.2 杆状病毒/昆虫细胞表达系统 |
| 1.3.3 哺乳动物细胞表达系统 |
| 1.3.4 大肠杆菌表达系统 |
| 1.4 分子伴侣在大肠杆菌可溶性表达中的研究 |
| 1.4.1 TF |
| 1.4.2 DnaK-DnaJ-GrpE |
| 1.4.3 GroEL-GroES |
| 1.4.4 分子伴侣在大肠杆菌可溶性表达中的应用 |
| 1.5 本实验研究意义 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒,载体,菌株及细胞株 |
| 2.1.2 抗体,疫苗及培养基 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 主要溶液及配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组表达质粒pET30a-VP2 构建及鉴定 |
| 2.3.2 重组表达质粒pET30a-VP2 的表达 |
| 2.3.3 分子伴侣质粒pTf16 与重组表达质粒pET30a-VP2 的共表达 |
| 2.3.4 共表达优化条件的确定 |
| 2.3.5 RDPV VP2 蛋白的纯化 |
| 2.3.6 SDS-PAGE检测方法 |
| 2.3.7 Western Blot检测方法 |
| 2.3.8 RDPV VLPs的组装 |
| 2.3.9 RDPV VLPs的形态鉴定 |
| 2.3.10 RDPV VLPs的血凝试验 |
| 2.3.11 蛋白浓度的测定 |
| 2.3.12 动物免疫实验 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 重组表达质粒pET30a-VP2 构建及鉴定 |
| 3.2 重组表达质粒pET30a-VP2 的表达 |
| 3.3 分子伴侣质粒pTf16 与重组表达质粒pET30a-VP2 的共表达 |
| 3.4 Western-blot鉴定 |
| 3.5 共表达优化条件的确定 |
| 3.5.1 不同诱导温度对蛋白表达的影响 |
| 3.5.2 不同IPTG浓度对蛋白表达的影响 |
| 3.5.3 不同L-阿拉伯糖浓度对蛋白表达的影响 |
| 3.6 RDPV VP2 蛋白的纯化 |
| 3.7 RDPV VLPs的体外组装条件优化 |
| 3.8 RDPV VLPs的透射电镜检测 |
| 3.9 RDPV VLPs的血凝试验 |
| 3.10 RDPV VLPs的幼貉免疫反应评价 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 论文中提出的新方法和新思路 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
（9）类组蛋白StpA对大肠杆菌I-E型CRISPR-Cas系统调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号和缩略符 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 细菌免疫机制 |
| 1.2.2 CRISPR-Cas系统的结构 |
| 1.2.3 I-E型 CRISPR-Cas系统的作用机制 |
| 1.2.4 类组蛋白H-NS和 StpA的介绍 |
| 1.2.5 类组蛋白H-NS和 StpA调控机制 |
| 1.2.6 Mg~(2+)对H-NS蛋白和StpA蛋白调控基因转录的影响 |
| 1.2.7 类组蛋白对I-E型 CRISPR-Cas系统的调控机制 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 研究方案 |
| 1.5 预期目标 |
| 第二章 实验部分 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.1.1 实验药品 |
| 2.1.2 实验仪器与设备 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 质粒 |
| 2.2 实验菌株和质粒的构建 |
| 2.2.1 菌株的构建 |
| 2.2.2 质粒的构建 |
| 2.3 实验技术手段 |
| 2.3.1 sRNA的制备和qPCR |
| 2.3.2 Western Blot |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 菌株构建的检测 |
| 3.1.1 通过PCR对不同缺陷株进行检测 |
| 3.1.2 通过形态学对不同缺陷株进行检测 |
| 3.1.3 通过转录水平对不同缺陷株进行检测 |
| 3.1.4 通过Western Blot对不同缺陷株进行检测 |
| 3.2 StpA对 I-E型 CRISPR-Cas系统cas启动子的影响 |
| 3.2.1 StpA在转录水平对I-E型 CRISPR-Cas系统的影响 |
| 3.2.2 StpA对 cas启动子的活性影响 |
| 3.2.3 hns单突菌株和hns stp A双突变菌株回补StpA对 cas启动子的影响 |
| 3.2.4 不同浓度的StpA对 cas启动子的影响 |
| 3.2.5 cas启动子上StpA/H-NS结合位点分析 |
| 3.3 镁离子对StpA调控CRISPR-Cas系统的影响 |
| 3.4 StpA对 I-E型 CRISPR阵列表达的影响 |
| 3.5 StpA对 I-E型 CRISPR-Cas系统的功能影响 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 在hns缺失的情况下,StpA激活I-E型 CRISPR-Cas系统 |
| 4.2 StpA通过作用于H-NS的结合位点激活CRISPR-Cas系统 |
| 4.3 低浓度的StpA激活CRISPR-Cas系统 |
| 4.4 镁离子对StpA调控CRISPR-Cas起到激活作用 |
| 4.5 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 1 作者简历 |
| 2 攻读博士/硕士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文数据集 |
（10）基于ARTP诱变的耐酸/碱谷氨酸棒杆菌的筛选及其pH智能调节系统的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 工业微生物面临的pH胁迫 |
| 1.1.1 谷氨酸棒杆菌的pH胁迫 |
| 1.1.2 微生物一般的pH调控策略 |
| 1.2 在低pH条件下微生物细胞内平衡机制 |
| 1.2.1 质子泵的外排作用 |
| 1.2.2 羧酸酶介导的质子消耗 |
| 1.2.3 产生碱性物质 |
| 1.2.4 细胞膜的修饰 |
| 1.2.5 大分子的保护和修复 |
| 1.2.6 代谢通路的重构 |
| 1.3 在高pH条件下微生物细胞内平衡机制 |
| 1.3.1 质子的获取 |
| 1.3.2 产生酸性物质 |
| 1.3.3 细胞表面层的变化 |
| 1.4 谷氨酸棒杆菌在pH胁迫下的自我调控策略 |
| 1.4.1 谷氨酸棒杆菌在低pH条件下的稳态机制 |
| 1.4.2 谷氨酸棒杆菌在高pH条件下的稳态机制 |
| 1.4.3 利用代谢工程手段来提高谷氨酸棒杆菌的酸碱胁迫 |
| 1.5 研究内容与意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究意义 |
| 1.6 创新点 |
| 第二章 基于ARTP诱变的谷氨酸棒杆菌耐酸/碱的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料、试剂及仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 ARTP诱变谷氨酸棒杆菌及其高通量筛选方法 |
| 2.3.1 培养基的配置 |
| 2.3.2 其他实验溶剂配置 |
| 2.3.3 利用ARTP诱变野生菌谷氨酸棒杆菌 |
| 2.3.4 ARTP诱变致死率的计算 |
| 2.3.5 利用全自动高通量筛选平台筛选突变菌株 |
| 2.3.6 耐酸/碱谷氨酸棒杆菌96孔深孔板筛选 |
| 2.3.7 耐酸/碱谷氨酸棒杆菌摇瓶筛选 |
| 2.3.8 谷氨酸棒杆菌的生长曲线的测定 |
| 2.3.9 抗逆谷氨酸棒杆菌的平板滴定法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 ARTP诱变条件的选择 |
| 2.4.2 高通量筛选耐酸/碱谷氨酸棒杆菌 |
| 2.4.3 耐酸耐碱谷氨酸棒杆菌遗传稳定性测定 |
| 2.4.4 耐受酸/碱谷氨酸棒杆菌的生长情况测定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 酸碱调控基因线路的构建及其表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料、试剂及仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 药品与试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基的配置 |
| 3.3.2 其他实验溶剂配置 |
| 3.3.3 制备大肠杆菌感受态 |
| 3.3.4 谷氨酸棒杆菌感受态的制备 |
| 3.3.5 提取大肠杆菌质粒 |
| 3.3.6 谷氨酸棒杆菌的基因组提取 |
| 3.3.7 目的基因的扩增 |
| 3.3.8 琼脂糖凝胶DNA的回收 |
| 3.3.9 质粒原始启动子的敲除 |
| 3.3.10 基因表达盒的构建 |
| 3.3.11 大肠杆菌热激转化 |
| 3.3.12 大肠杆菌菌落PCR |
| 3.3.13 谷氨酸棒状杆菌的活化与培养 |
| 3.3.14 谷氨酸棒杆菌的电转化法 |
| 3.3.15 谷氨酸棒杆菌的菌落PCR |
| 3.3.16 谷氨酸棒杆菌的Lacz酶活检测 |
| 3.3.17 L-谷氨酸的检测方法 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 pXMJ19质粒上P_(tac)启动子敲除 |
| 3.4.2 酸碱响应型启动子的挖掘和构建 |
| 3.4.3 酸碱响应型启动子的表征 |
| 3.4.4 产酸产碱基因的挖掘 |
| 3.4.5 产酸产碱基因线路的构建及表征 |
| 3.4.6 双质粒系统的构建与表征 |
| 3.4.7 将双质粒进行到谷氨酸棒杆菌转化 |
| 3.4.8 L-谷氨酸的检测 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文与研究成果清单 |
四、sIL-16在大肠杆菌中的表达及活性分析（论文参考文献）
- [1]小麦阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基转移酶基因TaBAHD的克隆与功能鉴定[D]. 战帅帅. 新疆农业大学, 2021
- [2]高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究[D]. 侯亚男. 华中农业大学, 2021(02)
- [3]桑树褪黑素及其异构体生物合成机制研究[D]. 郑莎. 西南大学, 2021(01)
- [4]树莓酮合成途径分析及其在微生物中异源高效表达[D]. 常晨. 东北林业大学, 2021(09)
- [5]水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及病毒样颗粒制备[J]. 吴铭洁,夏霖亚,王蕾,张宁,罗国良,殷玉和,吴丛梅. 中国畜牧兽医, 2021(02)
- [6]大肠杆菌中木酮糖裂解途径的构建和应用研究[D]. 史理陇. 北京化工大学, 2020(02)
- [7]致病杆菌重组系统的建立和次级代谢产物基因簇的研究[D]. 孙亚维. 湖南师范大学, 2020
- [8]貉细小病毒样颗粒的研究[D]. 雷欢. 长春工业大学, 2020(01)
- [9]类组蛋白StpA对大肠杆菌I-E型CRISPR-Cas系统调控机制研究[D]. 毛旭丹. 浙江工业大学, 2020(02)
- [10]基于ARTP诱变的耐酸/碱谷氨酸棒杆菌的筛选及其pH智能调节系统的构建[D]. 何猛超. 延安大学, 2020(12)