本文主要研究内容
作者刘珊珊（2019）在《抗牛PD-1抗体制备及PD-1多抗阻断对BVDV感染PBL细胞增殖和凋亡的影响》一文中研究指出：牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV)可感染世界范围内的反刍动物,每年可造成约20亿美元的经济损失。BVDV主要在淋巴细胞群中复制,导致动物体内白细胞的数量严重减少,引起免疫抑制,并且淋巴细胞衰竭程度与BVDV毒株的毒力有关,具有可逆性。已知程序性细胞死亡蛋白-1(Programmed cell death protein-1,PD-1)参与机体外周免疫耐受和抗原特异性免疫抑制,导致T细胞耗尽。PD-1在慢性病毒感染的T细胞上高度表达,并且阻断PD-1与PD-L1的结合,能够恢复T细胞功能。然而在BVDV急性感染期间,阻断PD-1/PD-L1途径是否可以恢复淋巴细胞的水平尚不明确。本研究通过克隆表达牛PD-1胞外区蛋白,制备多抗和单克隆抗体,确定抗体阻断对BVDV感染PBL细胞增殖和凋亡的影响。首先,本研究通过PCR技术克隆牛PD-1胞外区基因,插入pET-28a原核表达载体,构建重组质粒pET-28a-PD-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE和Western-blot检测IPTG诱导的蛋白表达情况。结果表明,序列比对发现与NCBI上发布的牛PD-1序列同源性为100%,成功构建了牛pET-28a-PD-1重组质粒。在37℃、0.8 mmol·L-1IPTG条件下诱导获得大量约19 kDa牛PD-1蛋白,能够与抗His标签的单克隆抗体反应,具有良好的反应原性。其次,纯化牛PD-1重组蛋白与等量弗氏佐剂乳化制备免疫原,免疫BALB/C小鼠制备抗牛PD-1多抗。分离牛PBL细胞,体外感染CP和NCP型BVDV,加入多抗阻断PD-1/PD-L1通路,检测BVDV病毒拷贝数、淋巴细胞增殖和凋亡情况。结果表明,牛PD-1多抗能够识别牛PD-1胞外区蛋白,PD-1多抗阻断恢复了淋巴细胞增殖,抑制细胞凋亡,降低了BVDV病毒拷贝数。多抗阻断对CP型BVDV感染诱导的细胞增殖比NCP型具有更显著的恢复作用。最后,应用杂交瘤细胞融合技术制备牛PD-1单克隆抗体,通过有限稀释法筛选单克隆细胞株,使用SDS-PAGE、ELISA、蛋白印迹和间接免疫荧光检测抗牛PD-1单克隆抗体的效价和特异性。结果表明,单克隆抗体效价达到1:2~6,并且获得的单克隆抗体能够识别外源性牛PD-1蛋白。综上所述,成功获得了牛PD-1胞外区重组蛋白,研制了针对牛PD-1胞外区的多克隆抗体和单克隆抗体,证实了抗牛PD-1多抗阻断能够恢复BVDV体外感染淋巴细胞的增殖能力,减少了细胞凋亡,提高了淋巴细胞清除BVDV病毒的能力,为探索PD-1抗体在急性BVDV感染中的作用机制奠定了基础。
Abstract
niu bing du xing fu xie bing du (Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV)ke gan ran shi jie fan wei nei de fan chu dong wu ,mei nian ke zao cheng yao 20yi mei yuan de jing ji sun shi 。BVDVzhu yao zai lin ba xi bao qun zhong fu zhi ,dao zhi dong wu ti nei bai xi bao de shu liang yan chong jian shao ,yin qi mian yi yi zhi ,bing ju lin ba xi bao cui jie cheng du yu BVDVdu zhu de du li you guan ,ju you ke ni xing 。yi zhi cheng xu xing xi bao si wang dan bai -1(Programmed cell death protein-1,PD-1)can yu ji ti wai zhou mian yi nai shou he kang yuan te yi xing mian yi yi zhi ,dao zhi Txi bao hao jin 。PD-1zai man xing bing du gan ran de Txi bao shang gao du biao da ,bing ju zu duan PD-1yu PD-L1de jie ge ,neng gou hui fu Txi bao gong neng 。ran er zai BVDVji xing gan ran ji jian ,zu duan PD-1/PD-L1tu jing shi fou ke yi hui fu lin ba xi bao de shui ping shang bu ming que 。ben yan jiu tong guo ke long biao da niu PD-1bao wai ou dan bai ,zhi bei duo kang he chan ke long kang ti ,que ding kang ti zu duan dui BVDVgan ran PBLxi bao zeng shi he diao wang de ying xiang 。shou xian ,ben yan jiu tong guo PCRji shu ke long niu PD-1bao wai ou ji yin ,cha ru pET-28ayuan he biao da zai ti ,gou jian chong zu zhi li pET-28a-PD-1,zhuai hua da chang gan jun BL21(DE3)gan shou tai xi bao ,SDS-PAGEhe Western-blotjian ce IPTGyou dao de dan bai biao da qing kuang 。jie guo biao ming ,xu lie bi dui fa xian yu NCBIshang fa bu de niu PD-1xu lie tong yuan xing wei 100%,cheng gong gou jian le niu pET-28a-PD-1chong zu zhi li 。zai 37℃、0.8 mmol·L-1IPTGtiao jian xia you dao huo de da liang yao 19 kDaniu PD-1dan bai ,neng gou yu kang Hisbiao qian de chan ke long kang ti fan ying ,ju you liang hao de fan ying yuan xing 。ji ci ,chun hua niu PD-1chong zu dan bai yu deng liang fu shi zuo ji ru hua zhi bei mian yi yuan ,mian yi BALB/Cxiao shu zhi bei kang niu PD-1duo kang 。fen li niu PBLxi bao ,ti wai gan ran CPhe NCPxing BVDV,jia ru duo kang zu duan PD-1/PD-L1tong lu ,jian ce BVDVbing du kao bei shu 、lin ba xi bao zeng shi he diao wang qing kuang 。jie guo biao ming ,niu PD-1duo kang neng gou shi bie niu PD-1bao wai ou dan bai ,PD-1duo kang zu duan hui fu le lin ba xi bao zeng shi ,yi zhi xi bao diao wang ,jiang di le BVDVbing du kao bei shu 。duo kang zu duan dui CPxing BVDVgan ran you dao de xi bao zeng shi bi NCPxing ju you geng xian zhe de hui fu zuo yong 。zui hou ,ying yong za jiao liu xi bao rong ge ji shu zhi bei niu PD-1chan ke long kang ti ,tong guo you xian xi shi fa shai shua chan ke long xi bao zhu ,shi yong SDS-PAGE、ELISA、dan bai yin ji he jian jie mian yi ying guang jian ce kang niu PD-1chan ke long kang ti de xiao jia he te yi xing 。jie guo biao ming ,chan ke long kang ti xiao jia da dao 1:2~6,bing ju huo de de chan ke long kang ti neng gou shi bie wai yuan xing niu PD-1dan bai 。zeng shang suo shu ,cheng gong huo de le niu PD-1bao wai ou chong zu dan bai ,yan zhi le zhen dui niu PD-1bao wai ou de duo ke long kang ti he chan ke long kang ti ,zheng shi le kang niu PD-1duo kang zu duan neng gou hui fu BVDVti wai gan ran lin ba xi bao de zeng shi neng li ,jian shao le xi bao diao wang ,di gao le lin ba xi bao qing chu BVDVbing du de neng li ,wei tan suo PD-1kang ti zai ji xing BVDVgan ran zhong de zuo yong ji zhi dian ding le ji chu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自黑龙江八一农垦大学的刘珊珊，发表于刊物黑龙江八一农垦大学2019-07-06论文，是一篇关于牛病毒性腹泻病毒论文,程序性细胞死亡蛋白论文,原核表达论文,多克隆抗体论文,单克隆抗体论文,黑龙江八一农垦大学2019-07-06论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自黑龙江八一农垦大学2019-07-06论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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