导读:本文包含了低氧耐药论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:肿瘤,低氧耐药,血红蛋白,阿霉素
低氧耐药论文文献综述
杨捷[1]（2019）在《氧传递联合化疗药物克服肿瘤低氧耐药的研究》一文中研究指出癌症作为全球公共卫生问题,目前仍是亟待克服的疾病。肿瘤低氧微环境是肿瘤的重要特征之一,它会导致肿瘤增殖,侵袭与转移,对化疗、放疗及光动力治疗等的耐受。化疗药物是治疗肿瘤的最常用及有效的手段,现阶段的化疗药物大多存在耐药问题,主要由肿瘤低氧微环境所导致,此外肿瘤部位药物累积受限也会抑制化疗药物的治疗效果。因此缓解肿瘤低氧以及增加肿瘤部位药物累积是增强化疗效果的重要因素。目前已有许多策略用于肿瘤低氧靶向治疗,如低氧激活的前体药物以及低氧响应的纳米载体,产生氧气或递送氧气的纳米系统等。其中携氧载体可以有效地缓解肿瘤低氧,目前研究的携氧载体主要包括全氟化碳(perfluorocarbon,PFC)、人工红细胞、修饰的血红蛋白等。PFC虽然有很高的氧气溶解度,但是只能通过氧浓度梯度释放并扩散氧气,效率比较低。与之不同,血红蛋白(Hemoglobin,Hb)在高氧条件下可以有效地结合氧气,在低氧条件下的快速释放氧气,效率较高,同时血红蛋白脂质体是较成熟的临床血液替代品。本论文在此基础上,制备了化疗药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)与携氧载体血红蛋白共载的脂质体(DOX-Hb-lipo,DHL)。对比不同的处方及制备方法,最终确定采用硫酸铵梯度法,最佳处方为E80磷脂与胆固醇摩尔比2:1。制得的脂质体粒径均一,大小为130 nm左右,具有较好的血清稳定性及放置稳定性。由于血红蛋白有自供氧的特性,DHL可以在肿瘤低氧部位释放氧气,克服肿瘤低氧耐药。通过溶氧仪及哌莫硝唑低氧探针、HIF-1α蛋白表达在体外水平检测脂质体缓解肿瘤低氧的能力,结果表明DHL可以持续释放氧气,有效地改善肿瘤低氧。此外,由于Hb与磷脂之间存在疏水作用,脂质体DHL表面结合有一定的血红蛋白,粒径及透射电镜图均验证了这一点。我们惊喜地发现脂质体表面血红蛋白具有一定地肿瘤靶向作用,采用多种肿瘤细胞及正常细胞系考察摄取情况,同时采用活体分布在体内水平进行进一步验证。结果发现相比于阿霉素脂质体(DOX-lipo,DL),DHL可以更多地被肿瘤细胞摄取,累积到肿瘤部位。根据相关的文献及实验探究,肿瘤细胞倾向于摄取铁,初步推测该靶向作用与血红蛋白中的铁有关。细胞毒性实验及药效学实验均说明DHL可以缓解肿瘤低氧,克服低氧导致的耐药,从而增强化疗药物阿霉素的抗肿瘤效果。药效学实验中,利用HIF-1α、VEGF及哌莫硝唑低氧探针考察肿瘤低氧水平,结果表明DHL也可以有效地在体内水平改善肿瘤低氧。此外,采用活性氧检测试剂盒证明了脂质体显着地增加了在缺氧环境中活性氧(Reactive oxygen spieces,ROS)的产生并促进了 ROS介导的阿霉素细胞毒性作用。综上所述,本研究制备了共载携氧血红蛋白和化疗药物阿霉素的纳米载体,通过脂质体表面血红蛋白的肿瘤靶向作用,增加肿瘤部位药物累积,同时血红蛋白释放氧气,克服低氧导致的肿瘤耐药,从而提高化疗药物的抗肿瘤效果。(本文来源于《浙江大学》期刊2019-01-01）
谢文涛[2]（2018）在《低氧微环境对脑胶质瘤耐药株MGMT蛋白表达的影响》一文中研究指出[目的]神经胶质瘤是颅内最常见的肿瘤,手术、放疗及辅以替莫唑胺TMZ为主的化疗已成为I临床的一线治疗措施。TMZ的抗癌作用主要是由06-meG介导的,但肿瘤细胞DNA修复系统中MGMT可以修复06-meG介导的化疗作用而导致TMZ的疗效降低,而产生耐药性[1]。TMZ在治疗胶质瘤的过程中存在很大的个体差异,固有的或获得性耐药限制了 TMZ在临床的运用。特别是随着使用化疗药物的数量和次数的增加,逐渐由对药物敏感的细胞转向耐药的肿瘤细胞系。随着首次证明了肿瘤细胞内存在低氧的情况并且诱导其生物学行为的改变加速了肿瘤恶性转变,如抑制细胞增殖、加强了耐药基因表达、抗凋亡促进肿瘤生长、下调DNA修复基因启动及增加基因的不稳定等。在低氧微环境的条件下使胶质瘤对化疗药物的敏感性逐渐降低甚至完全耐药。因此在低氧条件下MGMT的表达是否受影响?TMZ的敏感性是否随之改变?以及其耐药机制是本实验所需要探索的。本研究主要采取T98 G、U251、HAC叁种细胞在不同的低氧浓度及不同浓度的TMZ作用下研究化疗药物敏感性、使用TMZ通过大剂量冲击法逐步诱导胶质瘤细胞系建立耐药细胞株、以新的耐药脑胶质细胞系进行低氧条件下培养筛选出与化疗药物耐受相关的MGMT蛋白相互比较,证实其表达同时分析蛋白变化情况并探索期耐药机制。[方法]利用叁气培养箱效仿胶质瘤所需低氧微环境建立梯度低氧微环境。将T98G、U251、HAC叁种细胞分别在0.5%、1%、3%、21%(常氧)条件下,即前叁个条件为实验组,常氧条件为对照组。用完全培养基(DMEM88%+10%FBS+0.5%P/S+0.5%HEPES)培养,记录每个阶段的变化,同时模拟TMZ的临床用药程序,采取恒定药物浓度(0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625 g/L)、周期性作用的方式(1、3、5、7、9天)进行诱导;在处于对数生长期,按常规培养待细胞恢复生长,间断性按照倍数给予加药,不断进行诱导,最终获得抗药性稳定的耐药株,依据培养基的颜色变化、细胞生长的速度、密度及时更换新鲜的已配制的完全培养基,筛选出耐药株,以MTT实验观察细胞生长曲线、细胞生长抑制率以及细胞形态学的变化情况,将建立的耐药细胞株命名为 T98G/TMZ、U251/TMZ、HAC/TMZ。利用 Western blotting 检测不同氧浓度条件下MGMT的表达及含量分析比较。[结果]T98G/TMZ、U251/TMZ、HAC/TMZ耐药细胞株的建立采用恒定浓度的TMZ浓度、周期性作用的方式,经过反复总共6次的用药过程,历时6个月,成功地建立了对TMZ具有稳定抗药性的T98G/TMZ、U251/TMZ、HAC/TMZ叁种细胞的耐药指数分别为:T98G/TMZ(RF)=10.84、U251/TMZ(RF)=8.41、HAC/TMZ(RF)=11.11,即的耐受程度约为11倍、8.5倍、11倍。叁种新的耐药株分别在0.5%氧浓度、1%氧浓度、3%氧浓度条件下培养,以第七天、TMZ浓度为0.2g/L时为观察点,可见细胞形态主要发生了胞体、胞核变大,异型性增加,更加显着的变化表现为细胞向各个方向伸出多个细长伪足形态学的改变,经MTT实验检测得出叁种细胞在不同的氧浓度条件下均存在差异,尤其以1%氧浓度条件下抑制率减小、存活率增加。经Western blotting检测发现MGMT蛋白的含量各组间有差异,T98G和U251细胞在1%氧浓度条件下较强,T98G在0.5%氧浓度条件下MGMT蛋白表达最弱,HAC在不同氧浓度条件下MGMT蛋白表达情况无明显差异。[结论]不同的低氧条件下同一耐药株耐药性无差异,即存在肿瘤异质性;适度的低氧(1%氧浓度)条件下MGMT可能与其它耐药机制存在协同作用,产生耐药性。(本文来源于《昆明医科大学》期刊2018-05-01）
关吉斌[3]（2017）在《GAPDH siRNA与紫杉醇共载于内含正电荷的长循环脂质体中协同治疗低氧耐药肿瘤细胞》一文中研究指出低氧环境会诱导肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性,其中一个主要原因是细胞自噬的抑制和ATP药物外排转运蛋白的高表达。针对以上两点,我们通过ATP检测和蛋白免疫印迹实验发现3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)表达的抑制会下调细胞自噬以及降低肿瘤细胞中ATP的水平。因此,我们设计了一种同时载有GAPDHsiRNA和化疗药紫杉醇的膜不对称纳米脂质体,借助该药物传递系统来达到下调GAPDH的克服肿瘤的耐药性和提高化疗药物的敏感性。该脂质体制剂由低温-内外双反相乳剂制备技术制备,对GAPDH siRNA和紫杉醇具有很好的载药能力。体外释放实验结果显示该制剂对紫杉醇具有良好的缓释作用,同时证明在pH7.4时能够有效防止药物在传递过程中的泄露。通过动态光散射法(DLS)测得该脂质体的平均粒径为250.5 nm,分散度指数(PDI)值为0.210,经透射电子显微镜照片核实,说明粒子均匀度良好。该脂质体虽然内层结构中具有带正电荷的脂质材料DOTAP,但由于不对称脂质体表面PEG水化层具有屏蔽电荷作用,因此纳米脂质体的Zeta电位为0.699 mV,几乎为电中性。在体外抗肿瘤细胞(HeLa和MCF-7)活性研究中,siRNA脂质体对GAPDH基因表现出很高的特异性下调作用。在低氧条件肿瘤细胞耐药性提高的情况下,将siRNA和紫杉醇同时传递至细胞展现出显着的协同治疗作用,大大提高了肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性。流式细胞摄取实验结果显示表面高度PEG化的脂质体是以网格蛋白和小窝蛋白共同介导的能量依赖型内吞途径进入肿瘤细胞的,同时荧光强度分析结果显示脂质体的摄取效率明显高于具有等量药物的溶液剂。与此同时,人宫颈癌荷瘤裸鼠为模型证明了 GAPDH siRNA-紫杉醇纳米脂质体不但能够提高肿瘤内药物浓度和滞留时间,而且成功地提高了紫杉醇的化疗效果(通过GAPDH siRNA的协同治疗作用)。紫杉醇通过与GAPDH siRNA长循环脂质体共同传递到肿瘤细胞后成功提高其敏感性,同时降低细胞对肿瘤的耐药性。本课题在GAPDH siRNA纳米靶向脂质体方面的创新研究为临床癌症治疗提供了一种针对克服肿瘤多药耐药性的研究策略,同时为传统抗肿瘤化疗药和siRNA的联用提供了 一个新思路。(本文来源于《沈阳药科大学》期刊2017-06-01）
Jian-zhen,SHAN,Yan-yan,XUAN,Qi,ZHANG,Jian-jin,HUANG[4]（2016）在《熊果酸在低氧状态下通过抑制低氧诱导因子1α(HIF-1α)和多药耐药基因1(MDR1)对结肠癌细胞化疗药物增敏的实验研究（英文）》一文中研究指出目的:探索在低氧状态下熊果酸对结肠癌细胞化疗增敏的作用及其机制。创新点:首次发现了熊果酸对结肠癌细胞株有化疗增敏作用,这种效果与抑制HIF-1α和MDR1相关。熊果酸在低氧条件下还能抑制肿瘤新生血管生成。方法:分别在常氧和乏氧状态下,在叁种结肠癌细胞株RKO、Lo Vo和SW480对5-FU和奥沙利铂的细胞增殖和凋亡实验中,观察熊果酸对提高结肠癌细胞化疗的敏感性(图1和2)。通过定量实时聚合酶链反应和免疫印迹评估HIF-1α、MDR1和血管内皮生长因子(VEGF)的基因转录和蛋白表达水平(图3和4)。通过体外血管形成实验来评价熊果酸对新生血管抑制作用(图5)。结论:熊果酸在乏氧状态下抑制HIF-1α的积累和MDR1的基因和蛋白表达,并抑制新生VEGF的表达,同时对结肠癌细胞化疗有增敏作用。(本文来源于《Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology)》期刊2016年09期）
郭晓川[5]（2016）在《甲苯磺酸索拉非尼治疗晚期原发性肝细胞癌患者的临床病理特征、生存预后分析及低氧诱导其耐药机制研究》一文中研究指出目的：回顾性收集并研究于我院口服甲苯磺酸索拉非尼片的晚期原发性肝细胞肝癌患者的临床及病理资料,统计分析与甲苯磺酸索拉非尼片临床疗效相关的预后因素：探索低氧环境诱发的甲苯磺酸索拉非尼耐药机制。材料与方法：回顾性收集了2005年1月至2013年1月期间于我院口服甲苯磺酸索拉非尼片的晚期HCC患者的临床病理资料,收集这些患者的肝癌组织蜡块标本并切片,应用SPSS19.9统计软件对生存预后进行单因素分析及多因素分析;培养肝癌细胞系,进行Western Blot、PCI、CCK8毒性检测、HIF1SiRNA转染、免疫荧光染色等。结果：(1)74例患者口服甲苯磺酸索拉非尼,中位随访时间为535天；其中64例为男性患者,10例为女性患者(6.4：1),中位年龄62岁,丙型肝炎既往史、较高的KPS评分、无肿瘤家族史的患者中位PFS相对较长;丙型肝炎既往史、AFP<400, KPS评分≥90,高分化癌,不伴有吸烟史、饮酒史及肿瘤家族史的患者中位生存期较长;肿瘤家族史、乙型肝炎、KPS评分70-80、低分化癌是生存的不良预后因素;饮酒既往史、乙型肝炎、KPS评分70-80是与甲苯磺酸索拉非尼片疗效相关的不良预后因素；(2)口服甲苯磺酸索拉非尼片疗效较差的临床晚期HCC患者,免疫荧光染色显示组织标本中HIF 1α及YAP在细胞核内聚集,胞核阳性率较高,而临床获益明显的患者肝癌组织中,HIF 1α及YAP主要集中在细胞质;(3)在正常培养的肝癌细胞中,HIF1α及YAP均有少量表达,但重合率较低且主要集中在细胞质,细胞核阳性率低;(4)肝癌细胞在常氧环境下加用甲苯磺酸索拉非尼,HIF 1α及YAP主要集中在细胞质,细胞核阳性率进一步降低;(5)肝癌细胞在低氧环境下加用甲苯磺酸索拉非尼,HIF 1α及YAP共同向核内迁移,细胞核阳性率升高;(6)低氧环境下,YAP、HIF、1α表达升高且主要集中在细胞核,提示低氧环境可能促成肝癌细胞对甲苯磺酸索拉非尼产生抵抗力,促使产生耐药；(7)当YAP主要集中在肝癌细胞核时,EMT相关指标E-钙粘附减少,N-钙粘附素、波形蛋白表达水平相应增多,预示着YAP向细胞核内迁移现象与肝癌细胞的恶性程度及侵袭性密切相关;(8)正常培养的肝癌细胞中,细胞毒性检测提示低氧状态可能抵抗甲苯磺酸索拉非尼抗肿瘤效应,逆向促进肿瘤细胞增殖生长;(9) HIF1SiRNA转染肝癌细胞,当HIF la表达下调后,对其进行低氧及甲苯磺酸索拉非尼的处理,YAP的表达水平及向细胞核的迁移现象同前无明显变化,但是细胞毒性检测实验显示,肝癌细胞对索拉非尼的耐受性有所下降；(10) HIF 1α及YAP蛋白在低氧诱导的甲苯磺酸索拉非尼耐药机制中起到了一定的协同作用。结论：(1)通过对口服甲苯磺酸索拉非尼片的晚期HCC患者的临床病理资料及生存预后分析,我们发现肝炎病史、KPS评分、肿瘤家族史等临床因素与患者的生存及甲苯磺酸索拉非尼片的疗效存在密切关系,对该类临床患者的治疗及预后具有一定的指导意义;(2)低氧环境能够抵抗甲苯磺酸索拉非尼部分抗肿瘤效应,诱导其耐药的产生;(3)低氧环境下,YAP向细胞核内迁移迁移现象与耐药及预后有着重要关系;(4)HIF1SiRNA转染的肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性有所增加；(5) HIF la及YAP在低氧诱导的甲苯磺酸索拉非尼耐药机制中可能起到了一定的协同作用。(本文来源于《中国人民解放军医学院》期刊2016-05-31）
寇蓬,徐勤,杨丽华[6]（2015）在《Twist在低氧微环境中对宫颈癌Hela细胞顺铂耐药的作用及可能机制》一文中研究指出目的耐药是影响宫颈癌患者的化疗效果及预后的主要原因。探讨Twist在低氧微环境中宫颈癌Hela细胞顺铂耐药的作用及可能机制。方法将Hela细胞分无药对照组、常氧A组(不含Co Cl2)、低氧A组(加入含终浓度为150μmol/L Co Cl2的培养基),6 h后分别向常氧A组、低氧A组加入不同浓度梯度顺铂(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L),24 h后加MTT,测IC50及生长抑制率。以二氯化钴(Co Cl2)处理Hela细胞模拟低氧微环境;MTT法筛选低氧条件下顺铂的最适作用浓度及时间;设置常氧B组、顺铂组、低氧B组、低氧顺铂组,免疫荧光法和Western blot法检测Twist、MDR1的表达情况。结果 MTT结果示:常氧A组顺铂IC50为10-5.3mol/L,低氧A组顺铂IC50为10-4.5mol/L。当顺铂浓度≥10-5mol/L时,常氧A组、低氧A组对Hela细胞抑制率较0 mol/L顺铂差异具有统计学意义(P<0.05),且常氧A组与低氧A组抑制率差异有统计学意义(P<0.05)。当作用时间≥24 h时,常氧A组、低氧A组对Hela细胞抑制率较0 h时差异具有统计学意义(P<0.05),且常氧A组与低氧A组抑制率差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光结果示:顺铂组、低氧B组、低氧顺铂组Hela细胞中Twist蛋白表达(20.81±2.07、24.25±4.51、33.14±4.24)较常氧B组(13.08±2.39)显着增高(P<0.05),MDR1蛋白表达(35.26±8.41、60.13±22.32、76.00±9.96)亦较常氧B组(29.57±12.80)增高(P<0.05);低氧B组及低氧顺铂组Twist与MDR1表达呈正相关(r=0.639,P<0.05)。Western blot结果示:顺铂组、低氧B组、低氧顺铂组Hela细胞中Twist蛋白表达(0.777±0.066、0.786±0.010、0.990±0.052)较常氧B组(0.631±0.015)增高(P<0.05),MDR1蛋白表达(0.923±0.038、0.896±0.015、1.049±0.037)亦较常氧B组(0.661±0.085)增高(P<0.05;低氧B组及低氧顺铂组Twist与MDR1表达呈正相关(r=0.686,P<0.05;r=0.546,P<0.05)。结论低氧条件下Hela细胞对顺铂的敏感性下降,可能是低氧激活Twist,上调MDR1表达从而引起宫颈癌Hela细胞耐药。(本文来源于《医学研究生学报》期刊2015年08期）
寇蓬,徐勤,魏洁,杨静,肖肖[7]（2015）在《低氧微环境与宫颈癌耐药的关系》一文中研究指出目的通过检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、多耐药基因1(MDR1)在人宫颈癌组织、He La细胞中的表达及两者间的关系,探讨低氧微环境与宫颈癌耐药的关系。方法应用免疫组化法检测78例中、晚期宫颈癌组织微阵列芯片组织标本中HIF-1α、MDR1的表达;以二氯化钴(Co Cl2)处理He La细胞模拟细胞低氧微环境,设置低氧组、常氧组。细胞免疫荧光法检测HIF-1α、MDR1蛋白在He La细胞中表达。结果 HIF-1α、MDR1在宫颈癌组织中的阳性表达率分别为69.2%、85.6%,且表达呈正相关(r=0.348,P<0.05)。低氧组He La细胞HIF-1α、MDR1表达分别为34.76±7.09、57.61±57.61,显着高于常氧组的19.46±3.57、29.57±12.85(P<0.05),低氧组HIF-1α与MDR1表达呈正相关(r=0.315,P<0.05)。结论低氧微环境与宫颈癌耐药发生有关,可能的机制是HIF-1α促进MDR1的表达从而导致耐药的发生。(本文来源于《广东医学》期刊2015年13期）
寇蓬[8]（2015）在《Twist在低氧微环境中宫颈癌顺铂耐药的作用及机制研究》一文中研究指出目的：探讨Twist在低氧微环境中宫颈癌顺铂耐药的作用及可能机制,为提高宫颈癌化疗效果提供理论依据。方法：免疫组化法检测中、晚期宫颈癌微阵列芯片78例组织标本中HIF-1α、Twist、MDR1表达,探讨其与宫颈癌临床病理特征的关系及叁者之间的相关性。用二氯化钴(CoC12)处理Hela细胞模拟低氧微环境,设置常氧组及低氧组,用不同浓度梯度的顺铂处理两组Hela细胞、顺铂处理后分别于12、24、48、72 h测定细胞增殖能力,MTT法检测低氧及常氧下顺铂对Hela细胞的抑制率、筛选顺铂的最适作用浓度及时间,并采用细胞免疫荧光法检测两组细胞中HIF-1α、Twist、MDR1蛋白的表达变化；设置常氧组、顺铂组、低氧组、低氧顺铂组,Western blot检测HIF-1α、Twistt、MDR1的表达情况。结果：(1)78例宫颈癌组织中HIF-1α、Twist及MDR1的阳性表达率分别为69.2%、71.8%和85.6%。随着淋巴转移的出现、分化程度的降低、FIGO分期的变晚,HIF-1α、Twist及MDRl的阳性表达率逐渐增高,差异有显着性(P<0.05),且HIF-1α与Twist、MDR1表达之间呈正相关(r=0.430, p<0.05) (r=0.348, P<0.05), Twist与MDR1表达亦呈正相关(r=0.378,p<0.05)。(2)M'IT结果示：常氧、低氧状态下顺铂对Hela细胞均具有明显的生长抑制作用,且呈浓度、时间依赖性。顺铂的最适浓度为10-5mol/L,最适培养时间24h；常氧组顺铂IC50值为10-5.2mol/L、低氧组为10-4.5mol/L,二者间差异有显着性(P<0.05)。(3)免疫荧光结果示：低氧组Hela细胞HIF-1α、Twist及MDR1蛋白表达较常氧组显着增高(P<0.05),且HIF-1α与Twist、MDR1蛋白表达呈正相关(r=0.343,P<0.05)、(r=0.315,P<0.05),Twist与MDRl蛋白表达亦呈正相关(r=0.273,P<0.05)。(4)Western blot结果示：与常氧组相比,顺铂组、低氧组、低氧顺铂组Hela细胞中HIF-1α、Twist、MDR1蛋白表达均显着增高(P<0.05),低氧顺铂组表达量最高(P<0.05),低氧组及低氧顺铂组中HIF-1α与Twist、MDR1表达呈正相关(P<0.05),Twist与MDR1表达亦呈正相关(p<0.05)。结论：低氧微环境与宫颈癌顺铂耐药有关,可能的机制是低氧微环境中HBF-1α/Twist通路激活,上调MDRl表达,促进宫颈癌顺铂耐药的发生。(本文来源于《昆明医科大学》期刊2015-05-01）
周恬伊,庄林翰,朱虹,郑琳,何俏军[9]（2015）在《低氧调控YAP介导肿瘤耐药作用及机制研究》一文中研究指出目的低氧微环境是导致肿瘤耐药的重要原因之一,但其中的机制尚不明确,此外低氧微环境是肝癌的典型特征之一,低氧微环境导致多种药物治疗肝癌后出现耐药。因此,本课题研究在肿瘤低氧微环境下Yes-associated protein(YAP)蛋白的变化情况(去磷酸化、核转位和蛋白稳定性),YAP对低氧肿瘤耐药的贡献,探讨YAP在低氧下对逆转药物耐药的效果及相关机制。旨在探索YAP和肿瘤低氧微环境之间的关系,寻找YAP抑制剂与药物合用从而提高肿瘤药物的疗效,为低氧抗肿瘤研究和治疗方案提供一个更深入的新视角和思路。方法SRB(Sulforhodamine B sodium salt)实验:1.检测在常氧(20%O_2)与低氧(1%O_2)下肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721和Bel-7402对药物SN38的敏感性,siYAP后肝癌细胞株对SN38的敏感性,以及statins与SN38合用对肝癌细胞存活的影响。免疫荧光(Immunofluorescence,IF)实验:1、在肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721和Bel-7402中,采用IF观察肿瘤细胞中的YAP蛋白在常氧和低氧培养条件下的亚细胞定位,并且作计数统计;2、在裸鼠体内皮下注射HepG2细胞构建移植瘤模型,用低氧探针Hypoxyprob~(TM)-1(Pimonidazole Hydrochloride,PIMO)指示移植瘤低氧区域,结合组织冰冻切片和IF观察YAP在体内肿瘤低氧区域的变化情况;软件分析荧光强度。细胞核质分离(Cell Fraction)实验:1、结合蛋白质免疫印迹法(Western Blot)确证低氧下YAP核转位情况。RT-PCR:1、检测常氧和低氧下YAP及其靶基因的mRNA水平变化。2.检测常氧和低氧下HMGCR mRNA水平变化。3.检测低氧下HMGCR抑制剂对YAP靶基因mRNA水平的影响。蛋白质免疫印迹法(Western Blot,WB):1、检测常氧和低氧下YAP磷酸化水平以及总蛋白变化,并进行灰度分析;2、考察常氧、HIF-1α和低氧三种条件作用下,YAP的上游信号通路Hippo pathway的核心激酶级联反应链成员MST和LATS及其磷酸化水平的变化情况;3、用二氯化钴(CoCl_2)和转染pCMV6-HIF-1α质粒两种方法在常氧下累积低氧诱导因子-1(HIF-1),结合IF考察重要的低氧转录因子HIF-1α对YAP去磷酸化、核转位和总蛋白稳定性的影响。4.考察低氧条件下HMGCR抑制剂对YAP去磷酸化、核转位和总蛋白稳定性的影响。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA):1、用YAP siRNA沉默YAP考察YAP对发生低氧耐药的抗肿瘤化合物敏感性的影响;考察YAP对低氧诱导肿瘤细胞耐药作用;2、用HIF-1αsiRNA沉默HIF-1α,考察在缺失HIF-1α的情况下,低氧调控YAP去磷酸化、核转位和蛋白稳定性的作用。3.用HMGCR siRNA沉默MVA,考察HMGCR对YAP的作用。结果1、体外实验表明,低氧可导致肝癌细胞对SN38的敏感性降低;用YAP siRNA沉默YAP之后,具有肿瘤低氧耐性的抗肿瘤化合物在低氧下的作用增强,消除了部分低氧耐药;2、体内外实验均表明,肝癌细胞中的YAP蛋白在低氧下发生核转位,计数统计表明,与常氧相比,具有统计学差异;低氧调控YAP蛋白去磷酸化,导致蛋白稳定性增加;3、低氧下HMGCR活性增强,siHMGCR后YAP总蛋白下降,入核减少,而加入MVA后可逆转YAP蛋白水平的下降,YAP入核增加,表明HMGCR可促进YAP入核,HMGCR抑制剂statins可起到抑制YAP入核的作用;4、常氧下累积的HIF-1α可以使得YAP磷酸化形式减少,但是并不能诱导YAP发生核转位,此时YAP的总蛋白量反而减少;5、用HIF-1αsiRNA沉默HIF-1α之后,YAP在低氧下仍然发生去磷酸化、核转位和蛋白稳定性增加,表明YAP在低氧下的这些变化是HIF-1α非依赖的;在常氧、HIF-1α和低氧刺激下:YAP的上游激酶MST均不发生变化,而LATS仅在低氧下发生磷酸化水平下降,表明LATS的激酶活性降低,提示我们YAP在低氧下去磷酸化和入核可能是由低氧微环境失活LATS激酶而介导的。结论低氧促进YAP去磷酸化从而发生核转位,YAP参与了肿瘤低氧耐药,YAP在低氧下入核是HIF-1α非依赖的。以上结果提示YAP可能作为一个新的低氧抗肿瘤靶点。(本文来源于《2015医学前沿论坛暨第十四届全国肿瘤药理与化疗学术会议摘要汇编》期刊2015-04-24）
庄林翰[10]（2015）在《低氧调控YAP蛋白介导肝癌细胞耐药的作用及其机制研究》一文中研究指出目的：肝癌低氧微环境(Hypoxia)是肝癌发展过程中的重要阶段,将导致肝癌细胞对化疗药物敏感性降低,逃避凋亡,发生侵袭和转移。但是低氧介导肝癌恶性化过程的分子机制并未完全阐明,因此探索肝癌低氧微环境下促使肿瘤细胞恶性化进程的分子生物学事件以及参与的重要信号通路,对于进一步了解低氧生物学特征,挖掘发挥关键作用的分子,并进而寻找可实现干预低氧肿瘤恶性化的新型治疗靶点具有重要意义。我们的前期研究发现低氧能够激活细胞内的致癌因子Yes-associated protein (YAP蛋白),而YAP蛋白在肝癌的发生发展过程中发挥着关键作用。因此,本课题旨在深入研究低氧微环境激活YAP蛋白的作用方式,进一步探索其激活机制和信号通路,并寻找阻断低氧激活YAP蛋白的小分子化合物,进一步寻求通过干扰YAP蛋白逆转低氧肝癌细胞对化疗药物不敏感性的可行性,为受到低氧影响的肝癌治疗提供新的思路和实验依据。方法：1)采用人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402,以及HepG2裸小鼠移植瘤模型,确证肝癌低氧微环境能够诱导肝癌细胞中的YAP蛋白发生核转位、增加YAP蛋白的转录反应活性；考察低氧维持YAP蛋白稳定性的作用.(1)采用人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402,以汇合接种的方式(25～30×104cells per 1 mL culture medium,接种36h后细胞长至汇合)分别在常氧条件(20%02)和低氧条件下(1%O2)培养24小时,采用免疫荧光实验观察YAP蛋白在肝癌细胞内的核内外分布,并作计数统计。(2)采用人肝癌细胞HepG2,用上述的接种方式和培养条件培养细胞,收集细胞,采用细胞核质分离实验并结合Western Blot法观察常氧和低氧条件下肝癌细胞核内的YAP蛋白含量。(3)采用人肝癌细胞HepG2,用上述的接种方式和培养条件培养细胞,另外用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)沉默低氧下的YAP,用Trizol法提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,采用Real-time PCR检测细胞中YAP及其靶基因CTGF、AREG的mRNA水平变化。(4)采用HepG2裸小鼠移植瘤模型(瘤体积300～400 mm3),腹腔注射低氧探针PMO用以指示瘤内低氧区域,结合组织冰冻切片技术和免疫荧光实验,观察瘤内低氧对YAP蛋白表达和细胞内分布的影响。(5)采用Western Blot法检测在常氧和低氧条件下YAP蛋白表达随培养时间的变化,并对蛋白条带作灰度分析。(6)采用Western Blot法检测YAP蛋白在常氧和低氧条件下的磷酸化水平变化。(7)采用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)阻断细胞内的蛋白合成,结合Western Blot法检测YAP蛋白在常氧和低氧条件下的降解速率差异。2)采用人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402,考察低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对低氧激活YAP蛋白的影响；深入探索低氧激活YAP蛋白的分子机制；并由此寻找阻断低氧激活YAP的小分子化合物。(1)采用HIF-1累积剂二氯化钻(CoCl2)在常氧下孵育叁株肝癌细胞HepG2, SMMC-7721和Bel-7402,用免疫荧光实验观察YAP蛋白在肝癌细胞内的核内外分布,并作计数统计。(2) CoCl2累积HIF-1之后,采用Western Blot法检测YAP总蛋白及其磷酸化水平的变化。(3)转染HIF-1α质粒高表达HIF-1α后,采用Western Blot法检测YAP总蛋白变化。(4)用siRNA沉默低氧下的HIF-1α,采用免疫荧光实验观察YAP蛋白的核内外分布、用Western Blot法检测YAP总蛋白变化。(5)用蛋白酶体抑制剂MG132阻断YAP蛋白的泛素化途径降解,结合免疫共沉淀实验和Western Blot法检测YAP蛋白在常氧、低氧和CoCl2刺激下YAP泛素化水平的变化。(6)采用Western Blot法检测YAP蛋白的上游激酶MST激酶和LATS1激酶及其磷酸化在常氧、低氧和CoCl2刺激下的变化。(7)采用Real-time PCR和Western Blot法检测YAP的上游信号HMGCR的mRNA水平和蛋白变化。(8)用siRNA沉默低氧下的HMGCR以及加入甲羟戊酸(mevalonic acid, MVA),采用免疫荧光实验观察YAP蛋白的核内外分布、用Western Blot法检测YAP总蛋白变化。(9)在低氧下加入HMGCR抑制剂他汀类化合物(statins)普伐他汀和阿托伐他汀以及MVA,采用免疫荧光实验观察YAP蛋白的核内外分布、用Western Blot法检测YAP总蛋白变化。(10)在低氧下加入阿托伐他汀,采用细胞核质分离实验并结合Western Blot法观察低氧下肝癌细胞核内的YAP蛋白含量。(11)在低氧下加入普伐他汀和阿托伐他汀以及MVA,采用Real-time PCR检测细胞中YAP靶基因CTGF、ABEG的mRNA水平变化。(12)在低氧下加入普伐他汀和阿托伐他汀,采用Western Blot法检测YAP蛋白的上游激酶LATS1激酶及其磷酸化的变化。3)采用人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402,利用siRNA或statins干扰低氧下的YAP蛋白,增加肝癌细胞在低氧下抗肿瘤化合物的敏感性,并对其中的机制进行初步地探索。(1)采用siRNA沉默低氧下的YAP蛋白,并结合SRB染色法测定不同浓度的索拉非尼(sorafenib)、伊立替康的活性代谢物SN38在低氧下对叁株人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402的增殖抑制率的变化,并计算IC50值。(2)采用siRNA沉默低氧下的YAP蛋白,并结合SRB染色法测定不同浓度的多柔比星(Doxorubicin)、顺铂(Cisplatin)和4-HPR在低氧下对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制率的变化,并计算IC50值。(3)采用siRNA沉默低氧下的YAP蛋白,加入sorafenib或SN38,采用PI单染结合流式细胞术检测HepG2细胞的凋亡发生率。(4)采用siRNA沉默低氧下的YAP蛋白,加入sorafenib或SN38,采用Western Blot法检测细胞凋亡标记物PARP的裂解片段。(5)在低氧下分别将阿托伐他汀和普伐他汀与sorafenib或SN38合用,采用SRB染色法测定sorafenib或SN38对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制率的变化,并计算IC50值。结果：1)肝癌低氧微环境能够诱导肝癌细胞内的YAP蛋白发生核转位与激活,并且通过减少YAP蛋白的降解从而维持YAP蛋白稳定.免疫荧光实验结果显示,在低氧下培养叁株人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402,与常氧对照组相比,低氧能够显着地诱导细胞内的YAP蛋白发生核转位；细胞核质分离实验结合Western Blot发现,低氧条件下的HepG2细胞核内存在大量YAP蛋白。同时,Real-time PCR结果显示,低氧使得YAP靶基因CTGF和AREG的mRNA水平明显上调,通过siRNA沉默低氧下的YAP能够相应地减少CTGF和AREG的mRNA水平。移植瘤组织切片的免疫荧光实验显示,YAP蛋白在肝癌移植瘤内的低氧区域中发生核定位并且呈现高表达。同时,Western blot实验发现常氧下的YAP蛋白随着培养时间延长逐渐减少,而低氧下的YAP蛋白维持相对稳定的蛋白量。YAP的mRNA水平在低氧下没有发生明显变化,Western Blot结果显示,低氧能够使得YAP蛋白Ser127磷酸化减少,加入蛋白合成抑制剂CHX之后,我们发现,与常氧相比,低氧下的YAP蛋白降解更慢。2)低氧微环境诱导肝癌细胞内的YAP蛋白入核与稳定是HIF-1α非依赖的,低氧主要是通过HMGCR/mevalonate-LATS1相关途径发挥激活YAP蛋白的作用；HMGCR抑制剂statins能够阻断低氧激活YAP蛋白.免疫荧光实验发现,HIF-1累积剂二氯化钴(CoCl2)(150μM)在常氧条件下分别孵育叁株肝癌细胞HepG2, Bel-7402和SMMC-7721,并不能像低氧那样诱导YAP蛋白入核。Western Blot结果显示,常氧下CoCl2累积起来的HIF-1α虽然可以减少YAP的磷酸化水平,但是其对YAP总蛋白却不表现出和低氧微环境类似的稳定作用；CoCl2处理组细胞的YAP总蛋白水平甚至比常氧对照组的更低。转染HIF-1α质粒高表达HIF-1α蛋白后,得到了类似的结果。用siRNA在低氧下沉默了HIF-1α,免疫荧光实验和Western Blot结果显示,HepG2细胞中的HIF-1α被敲低后,低氧微环境仍可诱导YAP蛋白入核。缺失HIF-1α时,低氧仍然诱导YAP蛋白磷酸化减少,而总蛋白维持稳定。MG132阻断泛素化的YAP被降解,结合免疫共沉淀实验和Western Blot法发现,YAP在低氧下的泛素化明显低于常氧组,而CoCl2刺激之后,YAP的泛素化水平并未减少,甚至还有些增加。Western Blot实验结果显示,YAP蛋白的上游激酶MST及其磷酸化状态在常氧、低氧以及CoCl2刺激下,并没有发生变化；但是,LATS1激酶的活性形式磷酸化LATS1在低氧条件下急剧减少,而在常氧和CoCl2刺激下,LATS1激酶维持较高的磷酸化水平。Real-time PCR实验发现,与常氧对照组相比,YAP的上游信号HMGCR在低氧下的转录水平显着上调。沉默HMGCR之后,免疫荧光实验发现低氧诱导的YAP蛋白核转位被抑制,Western Blot实验发现低氧下累积的YAP总蛋白明显减少,这些效应可以被甲羟戊酸(MVA)。用阿托伐他汀和普伐他汀作用于低氧的HepG2肝癌细胞,免疫荧光实验结果显示,statins能够阻断低氧诱导的YAP蛋白核转位,这一效应可被MVA所逆转。细胞核质分离实验结合Western Blot实验表明,阿托伐他汀在低氧下确实能够抑制YAP蛋白的核内分布。Western Blot实验结果显示,statins作用后,低氧下的YAP总蛋白明显减少。RT-PCR实验发现,在低氧下用statins处理肝癌细胞能够相应地减少低氧下YAP靶基因CTGF、AREG的转录水平,并且是MVA依赖的。Western Blot实验发现,statins能够逆转低氧对LATS1激酶的抑制,增加LATS1的磷酸化。3)在低氧下用siRNA沉默YAP,可以通过诱发细胞凋亡增加抗肿瘤化合物对肝癌细胞的抑制率；statins可以增加肝癌细胞在低氧下对抗肿瘤化合物的敏感性。细胞增殖抑制实验结合SRB染色法发现,在低氧下,不同浓度的sorafenib或SN38对叁株肝癌细胞的抑制率与常氧相比,明显减小；用siRNA沉默低氧下的YAP蛋白后,能够增加sorafenib或SN38对它们的抑制率。在HepG2细胞上,在低氧下不同浓度的多柔比星(Doxorubicin)、顺铂(Cisplatin)以及4-HPR的抑制率均比常氧减小,通过沉默YAP能够增加HepG2对它们的敏感性。PI单染结合流式细胞术实验发现,与常氧相比,抗肿瘤化合物sorafenib或SN38在低氧下诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的发生率减少；用siRNA沉默低氧下的YAP,能够增加低氧下抗肿瘤化合物sorafenib或SN38诱导凋亡的能力。Western Blot结果发现,常氧下用10 μM sorafenib或0.25μM SN38作用于HepG2细胞后,细胞凋亡的标记物PARP裂解片段明显增加；而在低氧下10 μM sorafenib或0.25 μM SN38并不能显着引起PARP的裂解,但是sorafenib或SN38处理的同时沉默YAP,可以增加PARP的切割。细胞增殖抑制实验结合SRB染色法发现,低氧下合用statins能够增加sorafenib或SN38对人肝癌细胞HepG2的抑制率。结论：本课题揭示了肝癌低氧微环境能够通过HMGCR/mevalonate-LATS 1相关途径通过促进核转位激活致癌因子YAP蛋白,并且维持YAP的蛋白稳定性,这一诱导过程不依赖于HIF-1α的功能。statins作为HMGCR抑制剂可有效地阻断低氧激活YAP蛋白,并且下调YAP总蛋白水平。此外,采用siRNA干扰低氧下的YAP蛋白可以通过诱发细胞凋亡从而增加肝癌细胞在低氧下对抗肿瘤化合物的敏感性。在低氧下将statins与sorafenib或SN38合用也能够有效地增加HepG2肝癌细胞对sorafenib或SN38的敏感性。本研究提示YAP有望成为肝癌低氧干预和治疗的新靶点,为肝癌治疗方案的开发和策略选择提供新的思路和理论基础。(本文来源于《浙江大学》期刊2015-01-01）
低氧耐药论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
[目的]神经胶质瘤是颅内最常见的肿瘤,手术、放疗及辅以替莫唑胺TMZ为主的化疗已成为I临床的一线治疗措施。TMZ的抗癌作用主要是由06-meG介导的,但肿瘤细胞DNA修复系统中MGMT可以修复06-meG介导的化疗作用而导致TMZ的疗效降低,而产生耐药性[1]。TMZ在治疗胶质瘤的过程中存在很大的个体差异,固有的或获得性耐药限制了 TMZ在临床的运用。特别是随着使用化疗药物的数量和次数的增加,逐渐由对药物敏感的细胞转向耐药的肿瘤细胞系。随着首次证明了肿瘤细胞内存在低氧的情况并且诱导其生物学行为的改变加速了肿瘤恶性转变,如抑制细胞增殖、加强了耐药基因表达、抗凋亡促进肿瘤生长、下调DNA修复基因启动及增加基因的不稳定等。在低氧微环境的条件下使胶质瘤对化疗药物的敏感性逐渐降低甚至完全耐药。因此在低氧条件下MGMT的表达是否受影响?TMZ的敏感性是否随之改变?以及其耐药机制是本实验所需要探索的。本研究主要采取T98 G、U251、HAC叁种细胞在不同的低氧浓度及不同浓度的TMZ作用下研究化疗药物敏感性、使用TMZ通过大剂量冲击法逐步诱导胶质瘤细胞系建立耐药细胞株、以新的耐药脑胶质细胞系进行低氧条件下培养筛选出与化疗药物耐受相关的MGMT蛋白相互比较,证实其表达同时分析蛋白变化情况并探索期耐药机制。[方法]利用叁气培养箱效仿胶质瘤所需低氧微环境建立梯度低氧微环境。将T98G、U251、HAC叁种细胞分别在0.5%、1%、3%、21%(常氧)条件下,即前叁个条件为实验组,常氧条件为对照组。用完全培养基(DMEM88%+10%FBS+0.5%P/S+0.5%HEPES)培养,记录每个阶段的变化,同时模拟TMZ的临床用药程序,采取恒定药物浓度(0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625 g/L)、周期性作用的方式(1、3、5、7、9天)进行诱导;在处于对数生长期,按常规培养待细胞恢复生长,间断性按照倍数给予加药,不断进行诱导,最终获得抗药性稳定的耐药株,依据培养基的颜色变化、细胞生长的速度、密度及时更换新鲜的已配制的完全培养基,筛选出耐药株,以MTT实验观察细胞生长曲线、细胞生长抑制率以及细胞形态学的变化情况,将建立的耐药细胞株命名为 T98G/TMZ、U251/TMZ、HAC/TMZ。利用 Western blotting 检测不同氧浓度条件下MGMT的表达及含量分析比较。[结果]T98G/TMZ、U251/TMZ、HAC/TMZ耐药细胞株的建立采用恒定浓度的TMZ浓度、周期性作用的方式,经过反复总共6次的用药过程,历时6个月,成功地建立了对TMZ具有稳定抗药性的T98G/TMZ、U251/TMZ、HAC/TMZ叁种细胞的耐药指数分别为:T98G/TMZ(RF)=10.84、U251/TMZ(RF)=8.41、HAC/TMZ(RF)=11.11,即的耐受程度约为11倍、8.5倍、11倍。叁种新的耐药株分别在0.5%氧浓度、1%氧浓度、3%氧浓度条件下培养,以第七天、TMZ浓度为0.2g/L时为观察点,可见细胞形态主要发生了胞体、胞核变大,异型性增加,更加显着的变化表现为细胞向各个方向伸出多个细长伪足形态学的改变,经MTT实验检测得出叁种细胞在不同的氧浓度条件下均存在差异,尤其以1%氧浓度条件下抑制率减小、存活率增加。经Western blotting检测发现MGMT蛋白的含量各组间有差异,T98G和U251细胞在1%氧浓度条件下较强,T98G在0.5%氧浓度条件下MGMT蛋白表达最弱,HAC在不同氧浓度条件下MGMT蛋白表达情况无明显差异。[结论]不同的低氧条件下同一耐药株耐药性无差异,即存在肿瘤异质性;适度的低氧(1%氧浓度)条件下MGMT可能与其它耐药机制存在协同作用,产生耐药性。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
低氧耐药论文参考文献
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