本文主要研究内容
作者魏立帆（2019）在《利用转座子插入突变文库研究杀鱼爱德华氏菌代谢和毒力互作机制》一文中研究指出：转座子是存在于染色体上的一段可移动的DNA。基于已经成熟的Mariner家族Himar1转座子pMAR2×T7,我们设计并改造成满足特定需求的转座子pMKGR。pMKGR携带庆大霉素抗性标签和mCherry红色荧光标签,也携带无启动子的EGFP和卡那霉素阅读框,识别TA碱基位点并且插入染色体。以杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）为模式菌,成功构建了包含20,668个插入位点确定的突变株文库。该文库覆盖杀鱼爱德华氏菌全基因组（编码3,599基因）中2,806个基因,覆盖率为78.0%。根据文库的分析数据和中性碱基模型,我们预测杀鱼爱德华氏菌大约有464个必需基因。针对文库不同的筛选目的,在文库的基础上构建了 5个不同的子库,利用5个子库进行了体内外毒力相关基因的筛选。Tn-seq筛选结果显示,杀鱼爱德华氏菌毒力表达与其代谢状态密切相关,尤其是甘露糖代谢和脂肪酸代谢,相关基因的突变导致该菌的体内存活能力显著降低。对于甘露糖代谢,E.piscicida通过ManXYZ催化甘露糖生成甘露糖-6磷酸（Man-6P）,经ManA催化进一步生成果糖-6磷酸（Fru-6P）,参与糖酵解过程。我们发现,甘露糖代谢产物Man-6P可以通过直接结合DeoR家族转录调控因子ETAE2071（EvrA）,调控三型分泌系统（T3SS）以及六型分泌系统（T6SS）表达。实验证实,EvrAR141和EvrAR221是和Man-6P相互作用的关键氨基酸。突变这两个氨基酸后,EvrA不能感受并结合甘露糖,进而关闭esrB的表达。在考察脂肪酸和T3/T6SS表达之间关系时,我们发现E.piscicida体内不饱和脂肪酸含量和T3SS显著负相关（R2=0.981）。实验发现,游离长链单不饱和脂肪酸（UFA）可以直接与EsrC相互作用,使EsrC失去结合DNA的能力,最终关闭T3/T6SS的表达。通过对EsrC蛋白结构的模拟分析,发现EsrC和UFA直接作用的关键氨基酸为EsrCR38。在E.piscicida感染宿主和成功定植过程中,UFA扮演了更为重要的角色。UFA不仅动态调控了杀鱼爱德华氏菌T3/T6SS毒力系统的表达,而且促进了宿主细胞内脂滴（Lipid droplet,LD）的大量形成,进一步介导炎症反应,清除病原菌。在宿主细胞中,多余的脂肪酸主要以甘油三酯和胆固醇酯的形式储存在LD细胞器中。细胞中LD的含量与不饱和脂肪酸含量线性相关。E.pisciciEa感染宿主细胞的过程显著降低了宿主细胞中LD的含量,E.piscicida ΔT3SS感染过程却显著激活了宿主体内SCD1表达,促进了LD形成。E.piscicida T3SS对宿主细胞中UFA/LD合成的抑制不依赖于T3SS针状结构,而依赖于T3SS效应物。UFA显著抑制了EE.piscicida在HeLa细胞中定植,E.piscicida在SCD1-/-细胞中的定植水平显著高于在野生型HeLa细胞中的定植水平。在E.piscicida感染斑马鱼过程中,外加油酸显著提高了斑马鱼的存活率,SCD1-/-斑马鱼显示出对E.piscicida更高的敏感性。UFA/LD既能抑制病原菌毒力表达,又能激活宿主免疫响应,以抵抗和清除外来的病原菌。因此,UFA/LD在抵抗E.piscicida感染宿主方面发挥了重要作用。在自然界中,病原菌利用自身代谢物或者宿主体内代谢物作为信号调控毒力表达是病原菌适应复杂多变体内外环境的一种重要策略。本课题利用转座子插入突变文库为工具,以E.pipscicida为模式菌,研究病原微生物代谢和毒力互作关系。本研究为水产病原防治和水产养殖提供重要的指导。
Abstract
zhuai zuo zi shi cun zai yu ran se ti shang de yi duan ke yi dong de DNA。ji yu yi jing cheng shou de Marinerjia zu Himar1zhuai zuo zi pMAR2×T7,wo men she ji bing gai zao cheng man zu te ding xu qiu de zhuai zuo zi pMKGR。pMKGRxie dai qing da mei su kang xing biao qian he mCherrygong se ying guang biao qian ,ye xie dai mo qi dong zi de EGFPhe ka na mei su yue dou kuang ,shi bie TAjian ji wei dian bing ju cha ru ran se ti 。yi sha yu ai de hua shi jun （Edwardsiella piscicida）wei mo shi jun ,cheng gong gou jian le bao han 20,668ge cha ru wei dian que ding de tu bian zhu wen ku 。gai wen ku fu gai sha yu ai de hua shi jun quan ji yin zu （bian ma 3,599ji yin ）zhong 2,806ge ji yin ,fu gai lv wei 78.0%。gen ju wen ku de fen xi shu ju he zhong xing jian ji mo xing ,wo men yu ce sha yu ai de hua shi jun da yao you 464ge bi xu ji yin 。zhen dui wen ku bu tong de shai shua mu de ,zai wen ku de ji chu shang gou jian le 5ge bu tong de zi ku ,li yong 5ge zi ku jin hang le ti nei wai du li xiang guan ji yin de shai shua 。Tn-seqshai shua jie guo xian shi ,sha yu ai de hua shi jun du li biao da yu ji dai xie zhuang tai mi qie xiang guan ,you ji shi gan lou tang dai xie he zhi fang suan dai xie ,xiang guan ji yin de tu bian dao zhi gai jun de ti nei cun huo neng li xian zhe jiang di 。dui yu gan lou tang dai xie ,E.piscicidatong guo ManXYZcui hua gan lou tang sheng cheng gan lou tang -6lin suan （Man-6P）,jing ManAcui hua jin yi bu sheng cheng guo tang -6lin suan （Fru-6P）,can yu tang jiao jie guo cheng 。wo men fa xian ,gan lou tang dai xie chan wu Man-6Pke yi tong guo zhi jie jie ge DeoRjia zu zhuai lu diao kong yin zi ETAE2071（EvrA）,diao kong san xing fen bi ji tong （T3SS）yi ji liu xing fen bi ji tong （T6SS）biao da 。shi yan zheng shi ,EvrAR141he EvrAR221shi he Man-6Pxiang hu zuo yong de guan jian an ji suan 。tu bian zhe liang ge an ji suan hou ,EvrAbu neng gan shou bing jie ge gan lou tang ,jin er guan bi esrBde biao da 。zai kao cha zhi fang suan he T3/T6SSbiao da zhi jian guan ji shi ,wo men fa xian E.piscicidati nei bu bao he zhi fang suan han liang he T3SSxian zhe fu xiang guan （R2=0.981）。shi yan fa xian ,you li chang lian chan bu bao he zhi fang suan （UFA）ke yi zhi jie yu EsrCxiang hu zuo yong ,shi EsrCshi qu jie ge DNAde neng li ,zui zhong guan bi T3/T6SSde biao da 。tong guo dui EsrCdan bai jie gou de mo ni fen xi ,fa xian EsrChe UFAzhi jie zuo yong de guan jian an ji suan wei EsrCR38。zai E.piscicidagan ran su zhu he cheng gong ding zhi guo cheng zhong ,UFAban yan le geng wei chong yao de jiao se 。UFAbu jin dong tai diao kong le sha yu ai de hua shi jun T3/T6SSdu li ji tong de biao da ,er ju cu jin le su zhu xi bao nei zhi di （Lipid droplet,LD）de da liang xing cheng ,jin yi bu jie dao yan zheng fan ying ,qing chu bing yuan jun 。zai su zhu xi bao zhong ,duo yu de zhi fang suan zhu yao yi gan you san zhi he dan gu chun zhi de xing shi chu cun zai LDxi bao qi zhong 。xi bao zhong LDde han liang yu bu bao he zhi fang suan han liang xian xing xiang guan 。E.pisciciEagan ran su zhu xi bao de guo cheng xian zhe jiang di le su zhu xi bao zhong LDde han liang ,E.piscicida ΔT3SSgan ran guo cheng que xian zhe ji huo le su zhu ti nei SCD1biao da ,cu jin le LDxing cheng 。E.piscicida T3SSdui su zhu xi bao zhong UFA/LDge cheng de yi zhi bu yi lai yu T3SSzhen zhuang jie gou ,er yi lai yu T3SSxiao ying wu 。UFAxian zhe yi zhi le EE.piscicidazai HeLaxi bao zhong ding zhi ,E.piscicidazai SCD1-/-xi bao zhong de ding zhi shui ping xian zhe gao yu zai ye sheng xing HeLaxi bao zhong de ding zhi shui ping 。zai E.piscicidagan ran ban ma yu guo cheng zhong ,wai jia you suan xian zhe di gao le ban ma yu de cun huo lv ,SCD1-/-ban ma yu xian shi chu dui E.piscicidageng gao de min gan xing 。UFA/LDji neng yi zhi bing yuan jun du li biao da ,you neng ji huo su zhu mian yi xiang ying ,yi di kang he qing chu wai lai de bing yuan jun 。yin ci ,UFA/LDzai di kang E.piscicidagan ran su zhu fang mian fa hui le chong yao zuo yong 。zai zi ran jie zhong ,bing yuan jun li yong zi shen dai xie wu huo zhe su zhu ti nei dai xie wu zuo wei xin hao diao kong du li biao da shi bing yuan jun kuo ying fu za duo bian ti nei wai huan jing de yi chong chong yao ce lve 。ben ke ti li yong zhuai zuo zi cha ru tu bian wen ku wei gong ju ,yi E.pipscicidawei mo shi jun ,yan jiu bing yuan wei sheng wu dai xie he du li hu zuo guan ji 。ben yan jiu wei shui chan bing yuan fang zhi he shui chan yang shi di gong chong yao de zhi dao 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自华东理工大学的魏立帆，发表于刊物华东理工大学2019-07-16论文，是一篇关于杀鱼爱德华氏菌论文,转座子论文,突变体文库论文,不饱和脂肪酸论文,三型分泌系统论文,脂滴论文,代谢论文,毒力论文,华东理工大学2019-07-16论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自华东理工大学2019-07-16论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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