导读:本文包含了全长抗体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:大肠杆菌,基因编辑,氧化还原环境,抗体表达
全长抗体论文文献综述
李琼[1]（2017）在《大肠杆菌中二硫键形成相关基因改造和导入糖基化作用的基因编辑及其用于全长人源工程抗体的表达》一文中研究指出近年来基因工程抗体成为现代生物学及医学领域的研究热点,具有不可估量的市场前景。如何经济高效地表达具有活性的抗体分子,成为基因工程抗体研究中亟需解决的问题。目前CHO表达系统发展较成熟,在抗体表达中应用广泛,然而该系统培养要求精细、操作复杂、容易污染,具有较高的生产成本。E.coli表达系统具有遗传背景清楚、生长繁殖快、表达量高、工艺简单、节约成本等诸多优点。但是全长抗体分子需要依靠二硫键正确配对形成完整的结构,而E.coli细胞质内的高度还原状态使其应用于抗体表达时无法形成稳定的二硫键,不能进行正确的氧化折迭。此外,E.coli缺乏有效的糖基化系统,不能对抗体进行糖基化修饰。因此基于大肠杆菌表达系统,构建一种可促进二硫键正确配对,且能够对外源蛋白进行糖基化修饰的新型表达系统具有重要的意义。Red同源重组系统利用Exo、Beta、Gam 3种同源重组酶以及含有短同源臂的线性DNA打靶片段,通过简单的操作即可在E.coli基因组上实现精确的基因敲除或敲入。CRISPR-Cas9基因编辑系统是近年来迅速发展并得到广泛应用的一种高效基因编辑系统,该系统靶点分布频率高、设计简单、操作简单,可在原核及真核细胞基因组的任何位置进行高效、特异、多种形式的基因编辑。本研究旨在对E.coli基因组进行基因改造,获得一种可在细胞质中形成二硫键的表达菌株;利用该菌株进行全长抗体表达并验证其性质;在可促进细胞质中二硫键形成菌株的基础上,进行E.coli糖基化系统构建的初步尝试。首先,利用Red同源重组系统,先后敲除编码硫氧还蛋白还原酶的trxB基因及编码谷胱甘肽还原酶的gor基因;利用CRISPR-Cas9基因编辑系统,将去掉信号肽的DsbC编码区及T7表达调控元件整合至E.coli基因组,在细胞质中过表达具有分子伴侣活性的二硫键异构酶DsbC,使细胞质呈高度还原状态并促进二硫键正确配对,获得了可在细胞质中形成二硫键的E.coli蛋白表达菌株TGD。其次,以含有双表达框的pET-duet为载体,构建了两种抗乙肝病毒表面抗原的抗体23E7和HUE6F6的轻重链共表达质粒;利用本研究构建的菌株TGD、NEB公司可促进细胞质中二硫键形成的菌株SHuffle以及本研究出发菌株ER2566,分别进行抗体23E7和HUE6F6的表达;叁种抗体表达菌株菌体形态相似,生长状况无明显差异;表达所得抗体经protein A亲和层析后达到较高纯度;抗体23E7在TGD菌株中表达量为SHuffle和ER2566菌株的6.4倍,抗体HUE6F6在TGD菌株中的表达量为SHuffle和ER2566菌株的4.1倍,TGD菌株中的两种抗体的表达量明显提高。第叁,利用SDS-PAGE、Western blot、分子排阻色谱、分析型超速离心、抗原结合活性评价、病毒中和活性评价等多种方式,对TGD菌株、CHO细胞、SHuffle菌株及ER2566菌株表达的两种抗体进行了性质检测与比较。与SHuffle和ER2566菌株相比,TGD菌株表达的抗体可形成四聚体形式的完整抗体,组分单一,纯度较高,抗原结合活性及中和活性均强于SHuffle和ER2566菌株表达的抗体。最后,利用Red同源重组系统,对E.coli中编码O-抗原连接酶的waaL基因进行敲除;将空肠弯曲菌中编码寡糖转移酶的pglB基因构建至pTO-T7载体,使其在E.coli中表达;利用该糖基化改造菌株表达的抗体可检测到明显的寡糖信号,可能含有初步的糖基化修饰,为E.coli中N-连接糖基化系统的建立提供了参考。综上所述,本研究构建的细胞质呈氧化状态且能促进二硫键形成的E.coli菌株可高效表达全长抗体,为利用E.coli进行全长抗体表达的相关研究奠定了基础;空肠弯曲菌N-连接糖基化系统的引入为E.coli中糖基化系统的建立提供参考,有望构建出一种既可促进二硫键正确配对又能进行糖基化修饰的新型原核表达系统。(本文来源于《厦门大学》期刊2017-04-01）
陈薇,张晶,刘强,华玲,刘蕴慧[2]（2014）在《血管内皮生长因子全长抗体在毕赤酵母中的表达与活性鉴定》一文中研究指出目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL,评价其在毕赤酵母中的表达产物与抗原的结合特性,及其抑制细胞增殖的活性。方法:利用基因合成分别获得VEGF抗体CL和CH序列,分别构建pPICZαA-CH和pPICZαA-CL重组质粒,再利用同尾酶特性构建双启动子表达盒的重组pPICZαA-CH-CL载体,用Westen印迹对其进行表达鉴定后将VH和VL序列插入该载体,获得VEGF的全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL;通过膜筛和ELISA进行菌株筛选,并对VEGF抗体表达阳性菌株进行小量表达和纯化,采用CCK-8法对其抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性进行初步评价。结果:获得表达轻、重链的VEGF抗体表达载体,ELISA实验证明pPICZαA-VH-CH-VL-CL具有一定的VEGF抗原结合特性;体外增殖实验表明,该抗体可以以剂量依赖性抑制HUVEC增殖。结论:在毕赤酵母中表达、纯化了具有一定功能活性的VEGF全长抗体,为后续比较研究酵母糖基化改造对VEGF抗体的药效学和药代学的影响提供了基础。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2014年04期）
刘强,张晶,张小爱,杨小盼,华玲[3]（2014）在《分泌型毕赤酵母人全长抗体库的构建与鉴定》一文中研究指出目的基于N-糖基化部分改造毕赤酵母构建表达分泌型人全长抗体库。方法基于酵母分泌型表达载体pPICZαA构建双启动子串联表达重链和轻链恒定区基因的载体pPICZαA-C H-C L,经基因序列分析和Western blot分析验证。设计44对简并引物经逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增获得轻链可变区V L和重链可变区V H基因库。通过PCR将其插入上述恒定区表达载体构建全长抗体表达库pPICZαA-V H-C H-V L-C L。将该库电转化N-糖基化部分改造后宿主菌株GS115Y。随机挑取20个平板克隆进行菌液PCR鉴定、基因分析,并提交IgBLAST-imgt数据库鉴定抗体库正确性与多样性。结果获得表达重链和轻链恒定区的表达载体pPICZαA-C H-C L,并在此基础上初步获得全长抗体表达库pPICZαA-V H-C H-V L-C L,库容量为105。结论成功构建了分泌型N-糖基化毕赤酵母人全长抗体库。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2014年01期）
温扬明,蓝开健,王俊洁,余晶仪,屈娅荣[4]（2013）在《应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库》一文中研究指出目的应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库。方法采集登革确诊患者恢复期外周血,分离外周血淋巴细胞并提取其总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库;将抗体基因库转染CHO细胞、用流式细胞仪分析抗体在CHO细胞表面的表达。结果以1.2μg总RNA为模板,用6套引物扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,轻链基因库容量为1.45×104,重链基因库容量为1.8×105;随机挑选的10个轻链克隆和10个重链克隆,经过测序鉴定,轻链有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列,重链有7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析含有正确阅读框架的单克隆和抗体基因库,均检测到全长抗体在CHO细胞表面的表达,抗体库中可表达的抗体多样性达到109。结论以1.2μg总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,成功构建可表达库容量达到109的登革病毒特异性全长人抗体基因库。(本文来源于《南方医科大学学报》期刊2013年06期）
温扬明[5]（2013）在《应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库》一文中研究指出抗体(antibody)是人类免疫系统的重要组成部分,为机体提供有效的免疫防护。近二十年来,抗体在许多领域的应用越来越广泛,包括环境监测,临床检测及疾病治疗等。随着现代生物学技术的不断发展,所获得的单克隆抗体种类大大增加、临床应用的副作用有了显着改善。单克隆抗体制备技术出现于上世纪七十年代。通过杂交瘤技术获得的抗体是鼠源性的抗体,用于临床治疗时会存在诱发人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody, HAMA)的可能性,并且安全性较差。其应用价值在一段时间里一直备受讨论。随着现代生物学技术的不断发展,所获得的单克隆抗体种类大大增加、副作用有了显着改善。抗体越来越广泛的被利用,包括临床治疗及检测、环境监测等。单克隆抗体的制备技术先后经历了杂交瘤技术、抗体库技术、抗体展示及筛选技术等多个发展阶段。目前较为常用的噬菌体展示等技术,有着实验过程简单,库容量大等优点。但是由于噬菌体展示技术一般只能筛选抗原结合片段(Fragment of antigen binding, Fab)或单链可变区抗体片段(single chain variable Fragment, scFv)等小分子,所以不能通过噬菌体展示技术筛选得到全长的人源抗体；另外,展示系统所使用的宿主细胞为原核细胞,原核细胞在表达蛋白过程中的密码子与真核细胞不同,因此大噬菌体展示技术筛选获得的全长抗体很难在哺乳动物系统中获得高表达。而利用现有的哺乳动物细胞表面展示技术所建立的全长抗体库的库容量仅为106,不足以满足筛选出高特异性抗体的需求；若能够提升抗体库的构建效率,建立大容量的哺乳动物细胞表面展示全长抗体库,将有利于从中筛选获得高特异性、高亲和力的抗体,从而推动抗体研究的进步。登革病毒感染可引起登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合症(DSS)。DHF/DSS病情严重,致死率高。因为其感染机制较为复杂,目前尚未行之有效的临床针对性治疗。又因为其由蚊媒传播难以控制,同时缺乏有效的登革疫苗。因此,对筛选出高特异性的登革抗体,不仅是运用于临床治疗药物的开发还是用于疫苗的研制,都有非常重要的作用。甚至对其发病机理的发现,都将大有帮助。本研究使用课题组前期构建成功的哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,通过将全长抗体基因插入载体中,再展示在哺乳动物CHO细胞表面,为以后筛选较理想高特异性登革抗体做铺垫。通过流式分析得到的结果,8个轻链克隆、7个重链克隆均可检测到抗体的表达,细胞阳性率2.8%-41.3%,这与抗体库基因测序结果相一致。理论上获得的抗体多样性达到1.46×109[(1.45×104×80%)×(1.8×105×70%)]。从流式分析结果来看,在没有转染质粒的阴性对照组,CHO细胞背景阳性率只有0.2%,而转染有高效表达的载体阳性对照组,CHO细胞表达达到37.7%,这说明CHO细胞可以作为很好的展示平台。随后将轻链抗体基因和重链抗体基因同时插入到哺乳动物细胞表达载体pDGB4中,构建登革病毒全长人源二级抗体基因库,库容量为2.4×105,背景克隆的比例为1.2%。将其瞬时转染CHO细胞,流式细胞仪检测发现,阳性组为12%,而本研究所建立的登革病毒全长人源二级抗体基因库中有最高有19%的细胞表面成功展示全长抗体并被检查到。一、登革病毒特异性全长人源抗体库的构建目的：应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库方法：1.外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取采集确诊的登革热患者恢复期静脉血20ml,置于抗凝管中,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,加入适量Buffer RLT,裂解细胞,—80℃冰箱保存备用或者直接用于提取总RNA。2. cDNA第一链的合成以提取的总RNA为模板,使用轻链全长引物和重链可变区引物,逆转录合成cDNA第一条链。3.全套IgG1重链可变区基因和轻链K型全长基因的扩增以合成的cDNA为模板,用相应的特异性引物扩增全套IgGl轻链K型全长基因及全套IgGl重链可变区基因(3套轻链引物,3套重链引物)。PCR条件为：94℃预变性5min,然后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min),随后在延长温度下反应7min,以确保全长目的片段的合成。4.PCR扩增产物的分离纯化PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。然后将回收得到的PCR扩增产物,再次经1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段备用。并用同样方法处理3组轻链PCR扩增产物。5.重链抗体基因库及轻链基因库的构建及鉴定以BsmBI对重链基因扩增产物及载体pDGB-HC-TM进行酶切,电泳分离纯化目的片段,将回收的载体片段和抗体基因片段用T4DNA连接酶按1：1比例混合连接,在16℃反应24h后导入化学转化感受态大肠杆菌DH-5α,构建重链基因库。轻链全长基因的扩增产物经SfiI酶切后回收,与同样经SfiI酶切回收的载体pDGB-HC-TM片段用T4DNA连接酶按1：1比例混合连接,在16℃反应24h后导入化学转化感受态大肠杆菌DH-5α,构建轻链基因库。分别从重链抗体库和轻链抗体库中各随机挑取10个单克隆,摇菌培养过夜后抽提质粒,测序分析抗体基因库的质量及多样性。6.抗体在哺乳动物细胞表面的展示将8个轻链克隆与经鉴定可以高效表达重链的载体pDGB-HC-TM共转染CHO细胞,同时将7个重链克隆分别与经鉴定可以高效表达轻链的载体pDGB-Hu-Kappa共转染CHO细胞。然后用流式分析仪检测分析在CHO细胞表面表达抗体的情况。结果与讨论：我们分别构建了登革病毒抗体轻链基因库和重链基因库。重链基因库实验组的连接转化效率为每微克DNA有1.4x106克隆,无插入片段的背景克隆为0.5%；轻链基因库实验组的连接转化效率为每微克DNA有1×106克隆,无插入片段的背景克隆为1.4%。分别用100ng的重链连接产物和100nng的轻链连接产物转化感受态细菌,构建获得的轻链基因库容量为1.45x104,重链基因库容量为1.8x105。在抗体基因库里的重链库和轻链库中各挑取10个单克隆进行测序分析,结果表明重链库的10个单克隆中有8个含有正确的VH编码序列,编码8个特异的氨基酸序列；轻链库的10个单克隆中有7个含有正确的LCκ编码序列,编码7个特异的氨基酸序列。将此重链库和轻链库共转染哺乳动物细胞后,理论上抗体库的多样性可以达到1.46×109[(1.45×104x80%)×(1.8x105×70%)],可以满足筛选高亲和力、高特异性抗体的要求。将抗体库瞬时转染CHO细胞后,在37%的细胞表面可以检测到全长人源抗体的表达。结论：本研究采用哺乳动物细胞展示技术,成功用哺乳动物细胞表面展示载体pDGB-HC-TM构建了库容量大且多样性好的全长人源抗体基因库,可以满足筛选高亲和力、高特异性抗体的要求。二、登革病毒全长人源二级抗体库的构建及展示目的：将第一部分构建好的登革病毒全长人源轻链、重链初级抗体基因库的重链可变区及轻链全长基因通过四片段连接插入哺乳动物细胞表达载体pDGB4,构建一个全长人源的二级抗体库,并将此抗体基因库瞬时转染CHO细胞,全长抗体能够在CHO细胞表面展示。方法：1.双表达载体pDGB4片段的制备用限制酶BsmBI和SfiI对载体pDGB4进行双酶切,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,分离纯化5kb和3kb的两段目的DNA片段。2.抗体库基因的制备以第一部分已经制备的抗体重链基因库的细菌沉淀为来源,进行质粒中提获得抗体重链基因库的质粒DNA；用BsmBI进行酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化0.45kb的目的DNA片段。以第一部分已经制备的抗体轻链基因库的细菌沉淀为来源,进行质粒中提获得抗体轻链基因库的质粒DNA：用SfiI进行酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化0.75kb的目的DNA片段。3.DNA片段的连接及感受态大肠杆菌DH-5a的转化用T4DNA连接酶将获得的抗体轻、重链基因库片段与纯化得到的5kb和3kb的两段载体DNA片段进行连接,获得重组pDGB4。转化化学感受态大肠杆菌DH-5a,构建全长人源二级抗体库。4.抗体库在哺乳动物细胞表面的展示将二级抗体库的质粒DNA瞬时转染CHO细胞,用PE标记的鼠抗人kappa链抗体进行细胞免疫荧光染色,用流式细胞仪进行检测分析。结果与讨论：根据在带有氨苄青霉素抗性LB平皿上长出的克隆数,计算所构建的全长抗体二级基因库库容量为2.4×105,背景克隆的比例为1.2%。用流式细胞仪检测细胞表面可成功展示可被检测的全长抗体。总共挑出来10个克隆,通过瞬时转染CHO细胞,共检测到有4个克隆可以被检测到在细胞表面表达抗体,阳性细胞比例从1.5%到19%不等,说明在同等实验条件下,不同的抗体分子在CHO细胞表面的表达强度不同。这可能是因为不同的抗体分子的氨基酸序列不同引起的表达差异,也可能是由于宿主细胞的活性有微小差异导致。结论：成功将第一部分构建好的初级抗体库基因通过四片段连接插入哺乳动物细胞双表达载体pDGB4,构建了全长人源二级抗体库,并将基因库转染哺乳动物细胞CHO,获得能够哺在乳动物表面展示的全长人源抗体的抗体库,为登革病毒特异性抗体的筛选奠定了基础。(本文来源于《南方医科大学》期刊2013-05-31）
李闯[6]（2013）在《绵羊细胞分裂周期蛋白42全长cDNA克隆、表达及单克隆抗体制备》一文中研究指出布鲁氏菌是引起人兽共患布鲁氏杆菌病的病原体,具有高度传染性。近几年布病疫情日趋上升,严重危害人类健康及我国经济发展,对于布病的防治工作已是当务之急。近年来,细胞表面分子的抗原靶向性治疗成为一种非常有发展前景的治疗方法。Cdc42是一个具有功能性的膜表面分子,本实验目标基因cdc42是从布鲁氏菌强毒株及S2疫苗株免疫雄性绵羊白细胞层抑制性差减杂交cDNA文库中筛选获得。Cdc42为Rho家族研究较多的一员,参与多项细胞活动,是细胞周期调控、细胞极性、肿瘤表达等方面中不可获缺的重要因子。克隆获得基因cdc42全长cDNA序列本实验从构建的绵羊SSH cDNA文库中筛选出了一批差异表达基因,并对相关差异表达基因进行了初步分析,经测序和NCBI BLAST同源搜索,筛选出疑似基因cdc42部分序列片段,片段长为176bp。应用RACE技术,设计两组特异性引物,进行3'RACE及5/RACE,扩增cdc42全长cDNA序列。经生物学软件DNAMAN和NCBI网站上的BLAST工具分析,获得全长cDNA序列,片段大小为1609bp,开放阅读框576bp,编码191个氨基酸残基,应用批量pI-Mw计算工具预测蛋白分子量约为21kDa,申请GenBank登录号为KC425615Ocdc42原核表达应用PCR方法,设计含有Nde Ⅰ与Xho Ⅰ酶切位点特异性引物,对完整编码区序列扩增,将扩增片段连接pMD18-T克隆载体,构建pMD18-TCdc42重组克隆载体。将测序正确的质粒双酶切后与pET30a表达载体进行连接,构建pET30a Cdc42重组表达载体。将构建的重组表达质粒经IPTG诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳,得到表达量为21kDa融合蛋白,菌体破碎,验证该蛋白主要以包涵体形式存在。制备抗Cdc42单克隆抗体将重组表达质粒进行大量诱导,切胶回收并纯化。将纯化后蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交骨髓瘤细胞,经过ELISA检测与克隆最终获得抗Cdc42单克隆抗体,经亚类试剂盒鉴定单抗为IgG类。通过Dot-blot与western-blot验证分析,制备的单克隆抗体与重组蛋白和天然蛋白发生特异性结合,说明制备出抗Cdc42单克隆抗体。(本文来源于《延边大学》期刊2013-05-25）
蓝开健,张哲欢,梁中锟,王俊洁,娄海波[7]（2013）在《采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源膀胱癌特异性抗体基因库》一文中研究指出目的构建大容量且能高效展示于哺乳动物细胞表面的全长人源膀胱癌特异性抗体基因库。方法分离膀胱癌患者的外周血单核细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,用RT-PCR方法扩增全套IgG1重链可变区(VH)和Kappa型轻链全长(LCκ)基因,经过相应的限制性内切酶酶切后分别插入pDGB-HC-TM载体,分别构建膀胱癌特异性的抗体重链基因库和轻链基因库(一级抗体库)。随机挑取20个单克隆测定抗体基因序列,并瞬时转染FCHO细胞,结合流式细胞仪检测细胞表面抗体的表达。将上述构建好的轻重链基因库通过4片段连接方法插入双表达载体pDGB4,构建二级抗体库,转染FCHO后用流式细胞仪检测细胞表面抗体表达。结果分别成功构建了膀胱癌特异性的重链基因库和轻链基因库,随机挑取的轻重链单克隆各有7个和9个含有正确的抗体基因编码序列,且能展示于哺乳动物细胞表面,理论库容量达到3.32×10~(11)[(1.7×10~6×70%)×(3.1×10~5×90%)]。成功构建了膀胱癌二级抗体库,库容量为9×10~5。结论利用哺乳动物细胞表面展示技术,我们成功构建了膀胱癌特异性的全长人源抗体基因库,一级抗体库的库容量达到3.32×10~(11),二级抗体库库容量达到9×10~5,为下一步筛选特异性、高亲和力抗膀胱癌抗体奠定了基础。(本文来源于《南方医科大学学报》期刊2013年05期）
蓝开健[8]（2013）在《全长人源抗VEGF抗体库的构建及展示》一文中研究指出肾细胞癌又称肾癌,是成人最常见的肾脏肿瘤,可见于各个年龄段,高发年龄50-70岁。在我国,肾肿瘤在泌尿外科肿瘤中占第二位,仅次于膀胱肿瘤。且肾癌对放疗、化疗效果不明显副作用大。由于其起病隐匿,诊断时有一部分已发生转移。即使是局限性肾癌,采用根治性切除术后仍有近30%患者会复发。因此,全身转移性肾癌及肾癌术后复发的治疗成为泌尿外科研究的重点和难点。随着研究深入,发现肾癌多存在VHL-HIF-VEGF信号通路。因此,抑制或阻断VHL-HIF-VEGF信号通路,特别是阻断VEGF或其受体VEGFR,就可能抑制肾癌的生长。贝伐单抗(Bevacizumab)是VEGF特异性抗体,是经过人源化改造的鼠源抗体,与VEGF特异性结合并阻断其生物活性。2007年12月美国FDA批准转移性肾癌的一线治疗方案其中就有贝伐单抗联合IFN-α的靶向治疗。然而,通过杂交瘤技术获得的鼠源单抗经过人源化改造,不可能完全去除抗体的免疫原性,且抗体空间构型可能发生改变,亲和力往往会降低,在临床上表现为小剂量疗效有限,大剂量或联合用药导致副反应增加的问题。目前常用噬菌体展示技术、核糖体展示技术、酵母菌展示技术在内的常用的人源抗体展示技术,都没有或者有着与哺乳动物细胞不同的蛋白质折迭和转录后修饰功能,所以其所展示的抗体不能形成正确的叁级结构,亲和力不高,表达及纯化难度大,且只能筛选到抗体片段(单链抗体可变区片段scFv或者抗原结合片段Fab)而非全长抗体。为了克服以上抗体制作的不足,研究者尝试利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术筛选人源抗体。迄今为止,哺乳动物细胞表面展示技术所构建抗体库的库容量多局限于104-106,筛选抗体多样性不足,难以满足筛选高亲和力抗体的要求。为了克服上述抗体筛选技术存在的不足,本课题组对现有的哺乳动物细胞展示技术作了技术改良。为了提高筛选到特异性抗VEGF抗体的几率,本实验应用来自于肾癌及自身免疫病患者的外周血淋巴细胞(PBMC)为材料构建抗体库。通过提取患者PBMC的总RNA,进行RT-PCR扩增全套抗体基因,随后使用哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,构建了两个全长人源抗体基因库,库容量达到1010以上。为了提高筛选到特异性抗VEGF抗体的成功率,充分利用贝伐单抗的抗VEGF导向选择作用,本课题通过全基因方法合成了贝伐单抗的轻、重链可变区基因,分别与上述构建好的两个全长人源的抗体库配对,通过四片段连接的方法插入双表达载体pDGB4,构建两个二级抗体库。并构建了用于表达贝伐单抗的阳性对照载体pDGB4-avastin。然后将其稳定转染FCHO细胞,成功构建能稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库。利用流式细胞分选技术,我们能从构建的细胞库中筛选到在细胞表面稳定展示能与VEGF抗原结合的抗体的FCHO细胞。通过两轮的富集,可结合VEGF抗原的阳性细胞分别增加20.7倍和7.8倍；随后利用流式细胞分选术进行了单细胞分选,获得了轻链18株、重链8株可结合VEGF抗原的单克隆细胞。为进一步获得全长人源抗VEGF抗体奠定了基础。一、全长人源初级抗体库的构建及展示目的：采用哺乳动物表面展示技术构建全长人源初级抗体库。方法：1.外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取采集患者静脉血,置入抗凝管中,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,加入Buffer RLT,裂解细胞,一80℃冰箱保存备用或者直接用于提取总RNA。2.cDNA第一链的合成以总RNA为模板,根据V-BASE网站信息所设计合成的全套人抗体重链可变区引物和全套人抗体轻链恒定区引物,逆转录合成cDNA第一条链。3.全套IgG1重链可变区基因和轻链K型全长基因的扩增以合成的cDNA为模板,用对应的特异性引物扩增全套IgG1轻链κ型全长基因及全套IgGl重链可变区基因(3套轻链引物,3套重链引物)。PCR条件为：94℃预变性5分钟,然后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min),随后在延长温度下反应7min,以确保全长目的片段的合成。4.PCR扩增产物的分离纯化用PCR扩增抗体重链可变区基因和全套Kappa轻链。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。5.重链抗体基因库及轻链基因库的构建及鉴定用BsmBI对PCR扩增的重链基因产物及载体pDGB-HC-TM进行酶切,电泳分析并回收目的片段,将回收的载体片段和抗体基因片段用T4DNA连接酶按1：1进行连接,16℃反应24h后,化学转化感受态大肠杆菌TOPO-10,构建重链基因库。用SfiI酶切轻链全长基因和载体pDGB-HC-TM,电泳回收目的DNA片段,用上述构建重链基因库同样的方法构建轻链基因库。分别从轻、重链抗体库中各随机挑取10个单克隆,培养过夜后获取质粒,测序分析抗体基因库的质量及多样性。6.初级抗体库在293T细胞表面展示将构建的两个初级抗体库质粒中提,一起瞬时转染293T细胞,用流式细胞仪分析抗体在细胞表面的表达情况。结果与讨论：获得淋巴细胞的数量为1.4×108个。提取获得约3.5μg总RNA,其A260/A280的值为1.90。PCR扩增共获得约2gg的全套IgGl轻链K型全长基因和约2gg的全套重链可变区基因。根据在含有氨苄青霉素抗性的LB平皿上长出的细菌克隆数,计算所构建的抗体重链基因库库容量为1.89×105,背景克隆的比例为3.60%；抗体轻链基因库库容量为6.54x104,背景克隆的比例为1.65%。在轻、重链抗体基因库中各挑取10个单克隆进行测序分析,结果表明重链库的10个单克隆中有8个含有正确的VH编码序列,编码8个特异的氨基酸序列；轻链库的10个单克隆中有7个含有正确的LCK编码序列,编码7个特异的氨基酸序列。将此重链库和轻链库共转染哺乳动物细胞后,理论上抗体库的多样性可以达到6.67x109[(1.89x105×80%)×(6.54x104x70%)]。将两个抗体库共转染293T细胞,可以检测到阳性细胞总量为63.40%,表明抗体库中的全长抗体可以展示在293T细胞的表面,可以满足筛选高亲和力、高特异性抗体的要求。结论：成功采用哺乳动物细胞展示技术,构建了库容量大且多样性好的全长人源轻、重链基因库,可以满足筛选高亲和力、高特异性抗体的要求。二、二级抗体库的构建目的：为了更容易筛选到抗VEGF抗原的抗体,更好地利用贝伐单抗的导向作用。我们将第一部分构建好的轻、重链初级抗体库,分别与通过全基因合成方法合成的贝伐单抗重链、轻链基因进行配对,通过四片段连接插入哺乳动物细胞双表达载体pDGB4,构建两个二级抗体库。实验中将贝伐单抗轻、重链的可变区基因片段通过四片段连接的方法插入pDGB4载体,构建抗体库筛选阳性对照。方法：1.双表达载体pDGB4的制备以BsmBI和SfiI对载体pDGB4进行双酶切,电泳鉴定,并分离纯化5kb和3kb的两段目的DNA片段。2.贝伐单抗序列的合成在贝伐单抗的重链可变区碱基序列前面加上BsmBI的酶切序列以及信号肽序列,以BsmBI进行酶切,电泳分离纯化0.45kb大小的目的DNA片段。在贝伐单抗的轻链可变区碱基序列前面加上SfiI的酶切序列以及信号肽序列,采用重迭延伸PCR方法进行全长轻链的制备,再以SfiI进行酶切,电泳并分离纯化0.75kb的目的片段。3.抗体库基因的制备以已经制备的抗体重链基因库(pDGB-HClib-TM)的细菌沉淀为来源,进行质粒中提,获得抗体重链基因库的质粒DNA；用BsmBI进行酶切,电泳并分离纯化0.45kb的DNA片段。同样的方法,将抗体轻链基因库(pDGB-LClib)用SfiI进行酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化0.75kb的DNA片段。4.四片段连接构二级建抗体库将经过双酶切的载体pDGB4的3kb,5kb两个目的片段,以及经酶切的重链抗体库0.45kb片段加上贝伐单抗轻链0.75kb片段,4片段按1：1：1：1进行连接。同样的方法将载体的3kb,5kb以及经酶切的轻链抗体库0.75kb和贝伐单抗重链可变区0.45kb片段,4片段按1：1：1：1进行连接。构建含贝伐单抗重链及抗体库轻链的抗体库1,和含贝伐单抗轻链及抗体库重链的抗体库2。将上述两个抗体库化学转化感受态大肠杆菌TOPO-10,计算抗体库的库容量。5.构建质粒pDGB4-avastin将经过双酶切的载体pDGB4的3kb,5kb两个目的片段和经过酶切纯化贝伐单抗重链抗体片段、轻链抗体片段,同时插入到pDGB4载体,化学转化感受态大肠杆菌TOPO-10,随机挑取单克隆,进行扩增培养、小提测序分析。结果与讨论：构建了库容量分别为9×105抗体库1和1.8×106抗体库2,背景克隆的比例分别为0.24%和0.35%。成功构建阳性对照质粒pDGB4-avastin。测序结果表明贝伐单抗轻、重链已经成功插入pDGB4。为下一步稳定转染FCHO细胞,筛选具有能稳定表达抗体并能与VEGF抗原结合的稳定细胞株奠定基础。结论：成功将第一部分构建好的两个初级抗体库基因以及贝伐单抗轻、重链基因通过四片段连接插入哺乳动物细胞双表达载体pDGB4,构建了两个二级抗体库。并构建了阳性对照载体克隆pDGB4-avastin,为特异性抗体的筛选奠定了基础。叁、抗VEGF抗体库的展示及初步筛选目的：将第二部分构建好的两个二级抗体库与阳性对照克隆pDGB4-avastin,进行质粒中提,获取的各自的质粒DNA,稳定转染至FCHO,获得稳定展示全长抗体的细胞株。用流式细胞仪进行分选获取能与VEGF抗原特异性结合的细胞。方法：1.全长抗体库以及pDGB4-avastin质粒DNA的制备以已经制备的四片段连接抗体库的细菌沉淀为来源,中提获得质粒DNA。2.稳定转染抗体库的细胞库的库容量将稳定转染四片段连接抗体库质粒DNA的FCHO细胞在含潮霉素B的培养基中持续培养,根据倍比稀释后计数的细胞克隆数量,计算出所获得的细胞库的库容量。3.抗VEGF抗体的富集、筛选常规培养稳定表达全长抗体的细胞库,用不含胰酶的细胞消化液(cell dissociation buffer)进行消化回收后用PE标鼠抗人抗体和Biotinylated Human VEGF试剂盒进行双染,随后经流式细胞分选仪检测、富集、分选表达抗VEGF抗体的FCHO细胞。4.分选的单克隆细胞的流式分析分选获得的单克隆细胞进行扩大培养,使用PE标鼠抗人抗体和Biotinylated Human VEGF试剂盒进行双染,然后用流式细胞仪进行检测,选择存在双阳性信号的细胞株保种,以备后续分析。结果与讨论：将抗体库1及2的质粒DNA稳定转染FCHO细胞。获得了稳定表达的细胞抗体库1,库容量为4.2×105,抗体库2的库容量为3.8×105。经过两轮富集后,细胞表面特异性抗体的表达抗体库1提高了20.7倍,抗体库2提高了7.8倍。经单克隆分选,抗体库1获得49个单克隆,其中8个能与VEGF抗原特异性结合,而抗体库2获得89个克隆,其中18个能表达特异性的抗体。为下一步获取单克隆基因,展开全长人源抗VEGF抗体的筛选奠定了实验基础。结论：成功构建了全长抗VEGF的稳定细胞抗体库,并通过流式分选富集,共获得了26株能与VEGF特异性结合的单克隆细胞株。为后期分析单克隆序列,展开全长人源抗VEGF抗体的筛选以及抗体活性的鉴定奠定了良好的基础。(本文来源于《南方医科大学》期刊2013-03-20）
李峰,刘艳红,李艳雯,李跃辉,谢平丽[9]（2012）在《人源抗肝癌哺乳动物细胞表面展示全长抗体库的构建及初步应用》一文中研究指出研究背景:工程抗体作为肿瘤防治的新型手段,为肝癌等恶性肿瘤的治疗带来了希望,为了克服目前鼠源性单克隆抗体和人源化单克隆抗体的局限性,全人源全长抗体是治疗性工程抗体的发展方向。目的:构建全人源抗肝癌哺乳动物细胞表面展示全长抗体库,从中筛选、克隆可溶性抗体,为进一步研究及应用奠定基础。方法:通过基因克隆的方法,在载体pc DNA-CH、pc DNA3-CL的基础上重新构建了哺乳动物细胞表面展示载体pc DNA3-CHm和pc DNA3-CLm。为了便于可变区基因的克隆,载体pc DNA3-CHm和pc DNA3-CLm分别引入了酶切位点Nhe I,Cla I。其中载体pc DNA3-CHm的恒定区基因3端同时引入了细胞锚定蛋白(GPI)。应用 RT-PCR的方法,将来源于肝癌患者PBMC的 RNA进行反转录及扩增人重、轻可变区基因,并通过连接将可变区基因插入载体中。通过共转染将重、轻链抗体库转入293T细胞中。利用基因重组技术构建p ET21a(+)-T RX-EGFL7原核表达载体,表达纯化重组蛋白EGFL7,以此作为筛选抗原。应用磁珠细胞分选和细胞ELISA技术,快速鉴定和证实所构建的哺乳动物细胞表面展示全长抗体库的有效性。通过 RT-PCR的方法,克隆抗EGFL7的可变区基因并连入可溶性表达载体,通过转染293T细胞得到可溶性抗体。结果:成功地将抗体库以全长lg G的形式展示在细胞表面,并且通过磁珠细胞分选和细胞ELISA技术,从抗体库中成功地筛选到抗EGFL7全人源全长展示抗体,并进行可溶性抗体的表达及初步研究。结论:全人源哺乳动物细胞表面展示全长抗体库对于快速鉴定和克隆抗肝癌相关基因的人源化单克隆抗体具有良好的应用潜力。(本文来源于《第八届全国免疫学学术大会论文集》期刊2012-10-18）
曹虹,温扬明,邹辰[10]（2012）在《人单克隆抗体技术用于构建登革病毒全长抗体库》一文中研究指出登革热是由登革病毒(dengue virus)感染引起,登革病毒属B组虫媒病毒,黄病毒科黄病毒属(flavivirus)。埃及伊蚊和白纹伊蚊是登革热的主要传播媒介。由于全球气候变暖、国际旅游频繁和对蚊虫缺乏有效的控制,全世界有25亿人正受到登革病毒感染的威胁,有100多个国家和地区有登革的流行,每年均出现几百万病例,是一严重的公共卫生问题。然而由于登革病毒感染机制较为复杂,且其四个亚型之间有交叉感染增强现象,所以目前还没有效的疫苗及治疗性抗体用于临床。近20年来,抗体技术领域的发展使得人们能够应用现代的生物学技术克隆全套的人抗体基因组。(本文来源于《新发传染病研究热点研讨会论文集》期刊2012-09-01）
全长抗体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL,评价其在毕赤酵母中的表达产物与抗原的结合特性,及其抑制细胞增殖的活性。方法:利用基因合成分别获得VEGF抗体CL和CH序列,分别构建pPICZαA-CH和pPICZαA-CL重组质粒,再利用同尾酶特性构建双启动子表达盒的重组pPICZαA-CH-CL载体,用Westen印迹对其进行表达鉴定后将VH和VL序列插入该载体,获得VEGF的全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL;通过膜筛和ELISA进行菌株筛选,并对VEGF抗体表达阳性菌株进行小量表达和纯化,采用CCK-8法对其抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性进行初步评价。结果:获得表达轻、重链的VEGF抗体表达载体,ELISA实验证明pPICZαA-VH-CH-VL-CL具有一定的VEGF抗原结合特性;体外增殖实验表明,该抗体可以以剂量依赖性抑制HUVEC增殖。结论:在毕赤酵母中表达、纯化了具有一定功能活性的VEGF全长抗体,为后续比较研究酵母糖基化改造对VEGF抗体的药效学和药代学的影响提供了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
全长抗体论文参考文献
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[2].陈薇,张晶,刘强,华玲,刘蕴慧.血管内皮生长因子全长抗体在毕赤酵母中的表达与活性鉴定[J].生物技术通讯.2014
[3].刘强,张晶,张小爱,杨小盼,华玲.分泌型毕赤酵母人全长抗体库的构建与鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志.2014
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[9].李峰,刘艳红,李艳雯,李跃辉,谢平丽.人源抗肝癌哺乳动物细胞表面展示全长抗体库的构建及初步应用[C].第八届全国免疫学学术大会论文集.2012
[10].曹虹,温扬明,邹辰.人单克隆抗体技术用于构建登革病毒全长抗体库[C].新发传染病研究热点研讨会论文集.2012