周强1宋晓春2龙安予1滑洋洋1吴晓东1（1郑州市儿童医院病理科河南郑州450052；2南阳市中心医院病理科河南南阳473000）
【摘要】目的：探讨小分子干扰RNA（siRNA）对人食管癌EC9706细胞蛋白激酶CK2β基因表达的影响。方法：体外转录合成CK2βsiRNA，转染EC9706细胞，采用RT-PCR及免疫细胞化学技术检测转染前后CK2β的表达水平。结果：各实验组CK2β表达量均较对照组降低（p<0.05）。结论：特异性siRNA能有效抑制EC9706细胞中CK2β基因的表达。
【关键词】蛋白激酶CK2β食管癌EC9706细胞siRNA【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）36-0073-01蛋白激酶CK2是真核生物细胞中第二信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶，由两个α亚基和两个β亚基形成的四聚体，在细胞的生长增殖、凋亡中发挥着重要作用[1-2]。现有研究显示CK2β基因在人体多种恶性肿瘤中表达水平明显升高[3-5]。本实验通过构建CK2β的特异性siRNA，转染人食管癌EC9706细胞，观察CK2β对肿瘤细胞生物学特性的影响，为进一步研究CK2β在食管癌发生发展中的机制提供科学的理论依据。
1材料与方法1.1材料人食管癌EC9706细胞株（中国医学科学院馈赠）；T7RiboMAXExpressRNAiSystem购自美国Promega公司；Trizol试剂、RT试剂盒购自美国Invitrogen公司，鼠抗人CK2β单克隆抗体购自基因公司。
1.2方法1.2.1siRNA的合成根据GeneBank中参考序列设计siRNA模板，按T7RiboMAXExpressRNAiSystem说明书操作，得到双链siRNA，无关模板按如上操作得到无关siRNA。
1.2.2细胞培养将人食管癌EC9706细胞置于含10﹪胎牛血清的培养液中贴壁培养，使细胞在转染时达90﹪覆盖率。
1.2.3siRNA的转染设24h、48h、72h三个转染时间，每个时间设150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl三个浓度的转染组、正常对照组、无关对照组。收集细胞后滴于载玻片上固定备用。
1.2.4RT-PCR:Trizol提取各组细胞RNA，逆转录cDNA后进行RT-PCR。取扩增产物电泳后，经BandScan进行图像分析，评价mRNA的表达水平。
1.2.5CK2β蛋白检测：采用免疫细胞化学法，以PBS代替一抗做阴性对照，光镜下以染色强弱进行评分并进行统计学处理。
1.3统计学处理用SPSS12.0进行统计分析，以α=0.05为显著性水准。
2结果2.1EC9706细胞中CK2βmRNA的表达RT-PCR结果表明，CK2βmRNA在对照组呈高表达；在转染组呈低表达，且随转染剂量增加siRNA抑制效应增强，三者相比差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。
表1siRNA对CK2βmRNA表达的影响（x-±s）
注：各实验组与对照组相比,均P＜0.052.2EC9706细胞中CK2β蛋白的表达CK2β蛋白定位于细胞浆内，呈棕黄色颗粒。随转染剂量增加siRNA抑制效应增强，三者相比差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。
表2siRNA对CK2β蛋白表达的影响（x-±s）
注：各实验组与对照组相比，均P＜0.053讨论CK2是由两个催化亚基α和两个调节亚基β构成的四聚体。Lin等[3]发现CK2β在胃癌中的表达明显高于其周围正常组织。另有研究发现CK2β在大肠癌中的表达明显升高[6]。在子宫内膜癌中，CK2β的表达明显高于正常子宫内膜组织[2]。食管鳞状细胞癌是常见的恶性肿瘤之一，有关CK2β在食管癌组织中高表达的研究已有报道。
本实验采用体外转录法合成CK2β特异性siRNA并转染EC9706细胞，通过免疫细胞化学、RT-PCR技术检测CK2β表达的变化。
结果显示各试验组均可有效降低EC9706细胞中CK2β基因的表达，提示CK2β亚基可能作为一个有效的抗食管癌药物筛选的分子靶点，为临床应有RNAi技术对食管癌进行基因治疗提供了新的思路和理论依据。
参考文献[1]DuncanJS,LitchfieldDW.Toomuchofagoodthing:theroleofproteinkinaseCK2intumorigenesisandprospectsfortherapeuticinhibitionofCK2[J].BiochimBiophysActa,2008,1784(1):33-47.[2]PallaresJ,LlobetD,SantacanaM,etal.CK2βisexpressedinendometrialcarcinomaandhasaroleinapoptosisresistanceandcellproliferation[J].AmJPathol,2009,174(1):287-296.[3]LinKY,FangCL,ChenY,etal.OverexpressionofnuclearproteinkinaseCK2Betasubunitandprognosisinhumangastriccarcinoma[J].AnnSurgOncol,2010,17(6):1695-1702.[4]BrownMS,DialloOT,HuM,etal.CK2modulationofNF-kappaB,TP53,andthemalignantphenotypeinheadandneckcancerbyanti-CK2oligonucleotidesinvitroorinvivoviasub-50-nmnanocapsules[J].ClinCancerRes,2010,16(8):2295-2307.[5]ZouJ,LuoH,ZengQ,etal.ProteinkinaseCK2alphaisovexpressedincolorectalcancerandmodulatescellproliferationandinvasionviaregulatingEMTrelatedgenes[J].JRranslMed,2011(9):97.[6]邹金金,罗何三,等.高表达CK2β与大肠癌发生和转移的相关性研究[J].南方医科大学学报，2011,31(4):628-632.