导读:本文包含了体内拯救系统论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）,全长cDNA分子克隆,感染性分子克隆,T7RNA聚合酶
体内拯救系统论文文献综述
王松豪[1]（2013）在《高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒体内拯救系统的建立》一文中研究指出猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）俗称猪“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus, PRRSV）引起的以怀孕母猪繁殖障碍及各年龄阶段猪呼吸道疾病为主要特征的危害世界养猪业的重要疫病。2006年我国南方一些省份的猪场暴发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病，给我国养猪业造成了严重的经济损失。PRRSV进化导致病毒抗原性、嗜性和致病性等表型发生变异，这给临床PRRS的防控带来了巨大的挑战。为了深入理解PRRSV表型变异的分子基础，进而研制出更有效的疫苗，本研究利用真核聚合酶I和II启动子和终止子，结合核酶，构建了PRRSV真核拯救系统；利用慢病毒包装和转导技术建立了稳定表达T7RNA聚合酶的Mark-145细胞系。通过上述不同方法，来试图建立PRRSV体内拯救系统。为了获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, HP-PRRSV)弱毒株的全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆，根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株（EF635006）和经典PRRSV的CH-1a株（AY032626）全基因组序列，设计并合成特异引物，用RT-PCR分6段扩增了HP-PRRSV弱毒株的全基因组。将扩增的各个cDNA重迭片段分别克隆到PMDT-20载体中，建立了PRRSV弱毒株的初级cDNA克隆，并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果，选择特异的酶切位点，将各个亚克隆产物逐段克隆入经过改造过的低拷贝pOK12载体中，通过引入MluI和EcoR I酶切位点将聚合酶Ⅱ、Ⅰ和T7启动子序列和榔头锤酶基因（Hammerhead ribozyme, HamRz）置于病毒基因组5’端；通过引入NotI和Fse I酶切位点将聚合酶Ⅱ、Ⅰ终止子序列和戊型肝炎病毒核酶（Hepatitis delta virusribozyme，HdvRz）基因置于病毒基因组3’端，结果得到了病毒基因组全长cDNA克隆ppAPRRSVOK12，该质粒可以利用真核细胞的聚合酶系统转录PRRSV的全长cDNA，也可以利用T7RNA聚合酶系统进行转录。通过直接转染Marc-145细胞来拯救病毒，利用传代培养、RT-PCR等鉴定，没有拯救出感染性病毒。为了建立表达T7RNA聚合酶的Marc-145细胞系，利用T7RNA聚合酶体内拯救病毒，我们利用慢病毒包装和转导技术建立了稳定表达T7RNA聚合酶的Marc-145-T7细胞系。先克隆出T7RNA聚合酶基因，将其定向克隆入慢病毒载体PLVX-puro中，得到阳性重组质粒pLVX-Puro-T7。共转染293T细胞，获得含有T7RNA聚合酶基因的假型病毒。然后将假型病毒感染Marc-145细胞，把T7RNA聚合酶基因整合进Marc-145细胞基因组中。通过G418和嘌呤霉素抗性筛选，获得了稳定表达具有转录活性的Marc-145-T7细胞系，通过PCR、RT-PCR、SDS-PEAG等技术进行鉴定，结果表明，T7RNA聚合酶基因已经被稳定地整合进Marc-145细胞基因组中，并且该细胞系内的T7RNAP具有较好的转录活性，其活性传代不减弱。最后，利用建立的Marc-145-T7细胞系对HP-PRRSV弱毒株全长cDNA分子进行拯救，结果表明，没有获得具有感染性的病毒。虽然没有得到具有感染性的病毒粒子，但是我们从中也收获许多，正确客观地分析没有得到具有感染性的病毒粒子的原因可以为后续试验的改进和优化指明方向。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2013-06-01）
薛青红[2]（2009）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定、遗传变异分析及其体内拯救系统的初步研究》一文中研究指出猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪发生繁殖障碍和仔猪出现呼吸道症状为特征的传染性疾病。本病于20世纪80年代首发于美国,1990年6月在欧洲出现,中国于1995年发生该病。目前,全世界所有养猪的国家和地区均有本病的发生与流行,并引起巨大的经济损失。从河南省某发病猪场临床组织样本中分离到1株北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒,命名为PRRSV HN-08株。对PRRSV HN-08株进行生物学特性研究表明,该病毒粒子呈球形,直径约50 nm,为RNA病毒;可在Marc-145细胞中稳定传代,并产生明显CPE;可与PRRSV荧光抗体结合,产生特异性荧光;可被美洲型PRRSV阳性血清特异性中和;对热、酸、碱、氯仿等敏感。对猪的致病性试验表明,与我国早期PRRSV分离株相比,该毒株对猪的致病力明显增强,接种后对其血清及剖检病料进行病原检测结果表明,该PRRSV变异株在猪体内增殖速度增快,病毒血症持续时间延长,在体内分布范围更广。为了解我国不同地区PRRSV分离株间的遗传变异关系,本研究对2005—2008年间分离自中国部分省区的37株PRRSV分离株的ORF5基因和Nsp2基因进行了分子流行病学研究。GP5具有较高的免疫原性和中和活性,在环境和免疫压力作用下极易发生变异。对包括14株参考毒株在内的51株PRRSV GP5序列分析表明,所分离的37株PRRSV均为北美洲型;ORF5基因序列间同源性为85.6%~99.5%,说明PRRSV分离株ORF5基因区域变异较大,具有年度特征;不同地区PRRSV分离株遗传关系存在交叉现象,地域特征不明显。29株Nsp2变异株主要中和表位PNE序列中L39全部突变为I39,潜在的毒力相关位点与强毒株(VR-2332株、CH-1a株)相同,所有PRRSV分离株诱骗表位均极为保守。Nsp2蛋白具有极强的抗原性,在37株PRRSV分离株中,有8株未发生Nsp2基因缺失,多分离于2005年;29株Nsp2基因缺失株均分离于2006年下半年至2008年,说明目前PRRSV优势流行毒株在Nsp2区域变异较大,发生了部分缺失,但缺失的氨基酸并不影响病毒的增殖。系统分析表明,目前我国田间使用的弱毒疫苗与PRRSV分离株亲缘关系较远。对PRRSV HN-08株的全基因组进行序列测定和结果分析表明,该毒株与我国2006—2007年间多个省份分离的高致病性PRRSV变异株的各蛋白氨基酸序列具有高度同源性,且遗传变异特征相同,推测可能来源于同一祖先。PRRSV为RNA病毒,在体外难于进行基因操作。应用反向遗传操作技术,将基因组RNA转换为cDNA,在DNA水平上对病毒进行基因操作。本研究就PRRSV体内拯救系统的建立进行了初步探讨。根据PRRSV基因组和克隆载体的限制性酶切位点,将PRRSV基因组分为4段进行反转录和扩增(RT-PCR),将得到的片段经过一系列的克隆和亚克隆后,获得了基因组全长cDNA克隆。在基因组5`端引入PⅡ、PⅠ和榔头锤酶,在基因组3`端引入戊肝核酶、TⅠ和TⅡ序列,获得了含有PRRSV HN-08株基因组全长cDNA的重组质粒pPⅠT7PⅡ-HN08。将该重组质粒进行全基因序列测定,未发现致死性突变。转染Marc-145细胞后对拯救病毒进行鉴定表明,该拯救系统可能没有转录出完整的病毒基因组或转录出的病毒基因组没有感染性,或虽然拯救出了PRRSV,但拯救效率较低。构建基因组全长cDNA克隆是构建感染性分子克隆的关键一步,但获得的cDNA克隆不一定具有感染性。在本试验中构建的基因组全长cDNA克隆为进一步获得具有感染性的PRRSV分子克隆并研究该病毒基因组的结构和功能奠定了基础。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2009-04-01）
体内拯救系统论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪发生繁殖障碍和仔猪出现呼吸道症状为特征的传染性疾病。本病于20世纪80年代首发于美国,1990年6月在欧洲出现,中国于1995年发生该病。目前,全世界所有养猪的国家和地区均有本病的发生与流行,并引起巨大的经济损失。从河南省某发病猪场临床组织样本中分离到1株北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒,命名为PRRSV HN-08株。对PRRSV HN-08株进行生物学特性研究表明,该病毒粒子呈球形,直径约50 nm,为RNA病毒;可在Marc-145细胞中稳定传代,并产生明显CPE;可与PRRSV荧光抗体结合,产生特异性荧光;可被美洲型PRRSV阳性血清特异性中和;对热、酸、碱、氯仿等敏感。对猪的致病性试验表明,与我国早期PRRSV分离株相比,该毒株对猪的致病力明显增强,接种后对其血清及剖检病料进行病原检测结果表明,该PRRSV变异株在猪体内增殖速度增快,病毒血症持续时间延长,在体内分布范围更广。为了解我国不同地区PRRSV分离株间的遗传变异关系,本研究对2005—2008年间分离自中国部分省区的37株PRRSV分离株的ORF5基因和Nsp2基因进行了分子流行病学研究。GP5具有较高的免疫原性和中和活性,在环境和免疫压力作用下极易发生变异。对包括14株参考毒株在内的51株PRRSV GP5序列分析表明,所分离的37株PRRSV均为北美洲型;ORF5基因序列间同源性为85.6%~99.5%,说明PRRSV分离株ORF5基因区域变异较大,具有年度特征;不同地区PRRSV分离株遗传关系存在交叉现象,地域特征不明显。29株Nsp2变异株主要中和表位PNE序列中L39全部突变为I39,潜在的毒力相关位点与强毒株(VR-2332株、CH-1a株)相同,所有PRRSV分离株诱骗表位均极为保守。Nsp2蛋白具有极强的抗原性,在37株PRRSV分离株中,有8株未发生Nsp2基因缺失,多分离于2005年;29株Nsp2基因缺失株均分离于2006年下半年至2008年,说明目前PRRSV优势流行毒株在Nsp2区域变异较大,发生了部分缺失,但缺失的氨基酸并不影响病毒的增殖。系统分析表明,目前我国田间使用的弱毒疫苗与PRRSV分离株亲缘关系较远。对PRRSV HN-08株的全基因组进行序列测定和结果分析表明,该毒株与我国2006—2007年间多个省份分离的高致病性PRRSV变异株的各蛋白氨基酸序列具有高度同源性,且遗传变异特征相同,推测可能来源于同一祖先。PRRSV为RNA病毒,在体外难于进行基因操作。应用反向遗传操作技术,将基因组RNA转换为cDNA,在DNA水平上对病毒进行基因操作。本研究就PRRSV体内拯救系统的建立进行了初步探讨。根据PRRSV基因组和克隆载体的限制性酶切位点,将PRRSV基因组分为4段进行反转录和扩增(RT-PCR),将得到的片段经过一系列的克隆和亚克隆后,获得了基因组全长cDNA克隆。在基因组5`端引入PⅡ、PⅠ和榔头锤酶,在基因组3`端引入戊肝核酶、TⅠ和TⅡ序列,获得了含有PRRSV HN-08株基因组全长cDNA的重组质粒pPⅠT7PⅡ-HN08。将该重组质粒进行全基因序列测定,未发现致死性突变。转染Marc-145细胞后对拯救病毒进行鉴定表明,该拯救系统可能没有转录出完整的病毒基因组或转录出的病毒基因组没有感染性,或虽然拯救出了PRRSV,但拯救效率较低。构建基因组全长cDNA克隆是构建感染性分子克隆的关键一步,但获得的cDNA克隆不一定具有感染性。在本试验中构建的基因组全长cDNA克隆为进一步获得具有感染性的PRRSV分子克隆并研究该病毒基因组的结构和功能奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
体内拯救系统论文参考文献
[1].王松豪.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒体内拯救系统的建立[D].中国农业科学院.2013
[2].薛青红.猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定、遗传变异分析及其体内拯救系统的初步研究[D].西北农林科技大学.2009
标签：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）; 全长cDNA分子克隆; 感染性分子克隆; T7RNA聚合酶;