一、幽门螺杆菌VacA~+ BCS致胃上皮细胞基因表达谱的改变（论文文献综述）
宋聪华[1]（2021）在《幽门螺杆菌与Correa’s Cascade关系及ERM家族在其中的机制探究》文中研究指明背景和目的:癌症已成为严重威胁我国居民健康的重大公共卫生问题。《健康中国行动—癌症防治实施方案（2019—2022年）》中提出了“控制危险因素”、“癌症信息化大数据应用”、“提升癌症防治能力”、“推广癌症早诊早治”等核心行动内容。我国为消化系统肿瘤高发区,其中胃癌是癌症防控工作的要点。然而,胃癌确诊时就多已伴肿瘤局部浸润和远处转移,死亡率高。因此,如何防控胃癌具有重要意义。与多种肿瘤的发生过程类似,胃黏膜病灶在发生癌变之前一般也会有个慢性的炎症过程,即“炎—癌转化”这个科学问题。“Correa’s Cascade”假说认为肠型胃癌（Lauren分型）的发生一般遵循以下演变规律:正常胃黏膜→慢性非萎缩性胃炎（CNAG）→慢性萎缩性胃炎（CAG）→胃黏膜肠上皮化生（IM）→胃黏膜不典型增生（DYS）→胃黏膜癌变（ML）,表明胃癌的发生是一个多阶段的慢性演变过程,为胃癌的防控提供了依据。由于炎症“可控”,而癌症“难控”,故围绕“Correa’s Cascade”假说相关胃黏膜病变的早期管理成了胃癌防控的着力点。在我国,不仅胃癌的发病率高,幽门螺杆菌（H.pylori）的感染率也高。H.pylori感染是包括胃癌在内等诸多上消化道疾病的主要病因,被认为是“Correa’s Cascade”假说相关胃黏膜病变的“始作俑者”。因此,根除H.pylori是“Correa’s Cascade”假说相关胃黏膜病变管理的重要落脚点,是炎症“可控”的具体体现,更是提升胃癌防治能力的理论依据。值得指出的是,“Correa’s Cascade”假说描述的相关胃黏膜病变阶段“逐级交联”及“时序演变”的进展规律是学者通过观察胃癌高危人群队列胃黏膜病变随时间进展的病理学改变而对胃癌发生模式所作出的一种科学假设,属于质性研究。鉴于“Correa’s Cascade”假说中各胃粘膜病变之间的进展需要较漫长的时间,因此研究这一模式存在困难,从而一定程度上限制了该模式的前瞻性研究。因此,“Correa’s Cascade”假说的科学性还需要更多的真实世界数据支持。此外,“Correa’s Cascade”假说中各胃黏膜病变致胃癌风险大小也不甚清楚,H.pylori触发“Correa’s Cascade”假说相关胃黏膜病变发生和进展的作用靶点及分子事件目前仍知之甚少。ERM家族（ezrin/radixin/moesin,ERM family）是细胞质膜与细胞骨架之间的重要连接蛋白,也是细胞微绒毛主要组成部分,包括以下四个成员:埃兹蛋白（ezrin）、根蛋白（radixin）、膜突蛋白（moesin）、膜突样蛋白（merlin）。它们通过影响细胞骨架参与对细胞膜结构与细胞形态的调控,对维持细胞形变和细胞运动有着重要作用,并作为细胞皮质信号整合子,通过沟通膜蛋白介导信号传递参与细胞极化、侵袭、迁移和黏附等过程。近年来,研究发现部分ERM家族蛋白成员不仅与多种病原微生物感染致病密切相关,而且在消化系统肿瘤发生进展中也扮演着重要角色。因此,有必要对ERM家族蛋白在H.pylori致“Correa’s Cascade”假说相关胃黏膜病变“炎—癌转化”这一过程中所扮演的角色进行探讨,以期为胃癌防控及胃癌发生进展分子机制等研究提供参考。方法:1.H.pylori与Correa’s Cascade 的关系（1）横断面调查研究设计,提取2015年1月1日至2019年12月31日连续5年调查区间中所有因各种原因于南昌大学第一附属医院消化内镜中心接受胃镜检查者的个人特征、临床信息、胃镜记录及病理描述等资料。（2）根据筛选标准对数据进行清洗整理,基于胃镜活检病理检测信息计算Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变总检出率,计算Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变在不同年龄段中的检出率;（3）将近5年来Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变在任意一个受检者中被同时检出情况制作成共现（两两比共同出现）分布表,并计算胃黏膜病变的共现率,分析Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变“逐级交联”及“时序演变”的规律;（4）基于胃镜活检病理检测信息计算H.pylori阳性率,分析H.pylori阳性率在Correa’s Cascade相关胃黏膜病变中的差异,探讨H.pylori感染程度与Correa’s Cascade相关胃黏膜病变程度的关联;（5）基于连续5年胃镜数据分析H.pylori阳性率与Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变检出率的演变趋势。2.ERM家族在Correa’s Cascade中的机制初探（1）从GEO数据库获取Correa’s Cascade相关胃黏膜病变基因表达谱信息数据（GSE106656和GSE11631）,利用官网GEO2R分析ERM家族在不同胃黏膜病变中的表达差异（2）从TCGA获取胃癌转录组数据和临床信息,利用及相关程序包（edgR和DESeq2）对ERM家族在胃癌与癌旁中的表达差异进行分析,（3）在Oncomine数据库中分析ERM家族在不同胃癌肿瘤分型（Lauren分型:肠型胃癌、弥漫型胃癌及混合型胃癌3种）、不同性别（男、女）以及不同肿瘤分期阶段（Stage Ⅰ～Ⅳ期）中的差异。（4）利用GEPIA分析了 ERM蛋白家族基因在胃癌组织、癌旁组织及正常胃组织中的表达差异,并分析了 ERM蛋白家族基因表达水平与胃癌预后关系。（5）利用Kaplan-Meier plotter对ERM蛋白家族基因表达水平与胃癌预后关系作了补充分析和验证。（6）基于Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变中ERM蛋白家族基因的表达差异分析结果运用R语言进一步实现基因功能富集分析（GSEA）。（7）基于“炎—癌转化”科学问题,结合H.pylori致病分子机制、ERM蛋白家族分子生物学特点及基因功能富集结果,进一步通过TIMER数据库进行了免疫浸润分析。3.ERM家族蛋白moesin在胃黏膜病变中的表达及意义（1）选择 26695、ATCC43504（即 NCTC11637）、7.13、PMSS1、G27 及 CCS9803等作为H.pylori标准菌株或模式菌株（cagA PMSSl>cagA 7.13）,另选择永生化的人胚胃黏膜上皮细胞（GES-1）,以及人胃腺癌细胞HGC-27与BGC-823、低度分化的人胃腺癌细胞AGS与SUN-1以及中度分化的人胃腺癌细胞SGC-7901作为实验细胞。（2）Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变选择病理科保存的组织蜡块,病变分别为CNAG（含轻度与重度,即 MCNAG与SCNAG）、CAG、IM、DYS以及ML,均含有H.pylori感染信息。（3）选择12例胃癌手术患者的胃癌组织及相应的癌旁组织作为验证补充。（4）qRT-PCR实验检测各实验细胞中moesin mRNA表达（5）Western blot法检测各细胞系与H.pylori培养后moesin表达水平的变化。（6）Western blot法和免疫组织化学染色法检测胃癌与癌旁组织中moesin蛋白的表达。（7）免疫组织化学染色法检测合并H.pylori感染Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变样本中moesin蛋白的表达。结果:1.H.pylori与Correa’s Cascade 的关系（1）在2015年至2019年这连续5年的调查区间中,因各种原因于南昌大学第一附属医院消化内镜中心接受胃镜检查者资料经初筛共有399059例次。结合既定的筛选标准,对399059例次受检者资料经R语言数据清洗进一步剔除了 87029例次。最终,本次调查研究共获得符合筛选标准的胃镜受检者资料共312030例。按年份划分,2015年至2019年的胃镜检查例数分别为58172例、61292例、65661例、63027例、63878例。（2）经数据筛选结果发现312030例受检者资料中行胃镜黏膜活检病理检查共171974例,胃镜检查过程中对受检者的总活检率约为55.1%（171974/312030）。若按年份划分,2015年至2019年的胃镜活检例数分别为20387例、29136例、38556例、41406例、42489例,对应的活检率分别为35%、48%、59%、66%、67%。（3）在171974例行胃黏膜活检病理检查的受检者中,年龄最小者不足10岁,年龄最大者达96岁,总体平均年龄为（50.9±12.9）岁。胃黏膜活检病理检查结果表明可同时存在着两种及以上的“Correa’s Cascade”假说相关胃黏膜病变,各相关胃黏膜病变并非各自独立,部分可以存在“交叉”、“重叠”或“共现”情况。（4）Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变在各年龄段中的检出率存在一定的趋势。具体而言,CNAG普遍在各年龄段中检出,以青少年组人群为主,随着年龄的增加其检出率呈下降趋势。CAG+（即,CAG+IM）、DYS、ML则与之相反,即随着年龄的增加其检出率呈上升趋势。这些胃黏膜病变随着年龄的变化趋势与Correa’s Cascade假说所描述的相关胃黏膜病变序列高度一致。（5）在不同胃黏膜病变中,各胃黏膜病变之间联系紧密程度并非完全一致,病变之间并非并列而是可能存在先后顺序且病变有优先发展方向,CNAG、CAG+、DYS、ML的发展趋势是逐级关联进展的,即病变有先后顺序（逐级）,现有病变优先向某一胃黏膜病变发展（交联）,且在病理生理（无外界干预）情况下,这种发展方向不可逆。（6）CNAG合并ML的概率为0.8%,CAG+合并ML的概率为1.1%,DYS合并ML的概率为11.0%。（7）在171977例胃镜黏膜活检及病理检查中行特殊染色查H.pylori感染状态共122735例,检测率高达71.4%（122735/171977）,提现了临床对H.pylori感染的认知和重视。近5年来,H.pylori的总体阳性率为31.0%。（8）Correa’s Cascade相关胃黏膜病变组中H.pylori感染阳性率均高于无Correa’s Cascade相关胃黏膜病变组（P均<0.01）,各Correa’s Cascade相关胃黏膜病变程度占比随着H.pylori感染程度分级或分度的增加而增加,Correa’s Cascade相关胃黏膜病变组中H.pylori感染阳性率均高于无Correa’s Cascade相关胃黏膜病变组（P均<0.01）,提示胃黏膜病变程度与H.pylori感染程度有关。进一步分析显示,除了 DYS病变,其他Correa’s Cascade相关胃黏膜病变程度差异均与H.pylori感染状态程度（分级与分度）关系,差异有统计学意义（P均<0.01）。（9）H.pylori感染与Correa’s Cascade相关各胃黏膜病变及病变程度之间的均有关联,各Correa’s Cascade相关胃黏膜病变程度占比随着H.pylori感染程度分级或分度的增加而增加,且近5年变化趋势基本一致。总体上,H.pylori阳性率、DYS及ML演变趋势一致,均呈逐年下降趋势。近3年来（2017～2019）Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变检出率的趋势变化均呈放缓趋势。2.ERM家族在Correa’s Cascade中的机制初探（1）在GEO数据分析中,发现ERM蛋白家族基因4个成员在CNAG vs CAG和CNAG vs IM中均无差异,而在CNAG vs ML和CAG vs ML中发现只有moesin基因表达均为上调,差异有统计学意义（P均<0.05）。（2）在TCGA-STAD数据分析中,发现ERM蛋白家族基因中只有moesin基因表达有差异,其在癌组织中的表达水平高于胃癌旁组织,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）在GEPIA中将TCGA-STAD和GTEx数据进行联合分析,发现ERM蛋白家族中只有moesin基因和merlin基因表达有差异,二者在癌组织中的表达水平均高于胃癌旁组织以及胃正常组织,差异有统计学意义（P均<0.05）。（4）在不同临床分期中,发现ERM蛋白家族基因中只有moesin基因在各期中的表达差异有统计学意义（P<0.05）,且Ⅱ～Ⅲ期表达水平显着高于Ⅰ期。（5）不同胃癌类型（Lauren分型）中,发现ERM蛋白家族基因中moesin基因和merlin基因表达有差异且稳定,表达水平均高于癌旁组织（P均<0.05）。（6）高表达的moesin基因预示着胃癌总体预后（OS与DFS）均不良（P<0.05）,而merlin基因表达水平与胃癌预后未见相关性。（7）Moesin基因的表达水平与胃癌患者的肿瘤分级及T分期有关（P均<0.05）,而与性别、年龄、N/M分期均无关。（8）Moesin基因在胃癌组织中的表达水平不仅较癌旁组高,也较正常胃组织高（P均<0.05）。此外,其在合并H.pylori感染的胃癌组织中的表达水平也较无H.pylori感染的胃癌组织高（P均<0.05）。（9）基因富集分析显示胃癌中moesin基因主要与细胞因子与细胞因子受体相互作用途径、Janus激酶—信号转导因子与转录激活因子（JAK-STAT）途径、细胞粘附分子途径、钙离子信号通路途径、Toll样受体信号通路以及细胞外基质受体相互作用途径等有关（P均<0.001）。（10）胃癌中moesin基因与JAK1、STAT5、ZEB1、ZEB2的有着较密切的相关性,与NF-κB、IL-6呈正相关性（P均<0.05）。（11）在TIMER分析中,发现除B细胞外,胃癌组织中moesin基因与多数免疫细胞均有正相关性（P均<0.05）,相关性系数由大到小依次为树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞。3.ERM家族蛋白moesin在胃黏膜病变中的表达及意义（1）不同H.pylori菌株作用GES-1细胞的moesin蛋白表达均显着高于无H.pylori作用的对照组（P<0.01）。（2）与不加H.pylori的GES-1/AGS 对照组相比,GES-1/AGS+PMSS1、GES-1/AGS+7.13组的moesin蛋白表达均增高,两两之间差异比较有统计学意义（P<0.01）。而且,GES-1/AGS+PMSS1组moesin蛋白的表达显着高于GES-1/AGS+7.13组,二者差异有统计学意义（P<0.05）,表明moesin蛋白的表达可能部分是通过菌株的cagA来实现的（已知cagA拷贝数:PMSS1>7.13）（3）与 GES-1/AGS 对照组相比,GES-1/AGS+WT7.13 组、GES-1/AGS+△cagA7.13组的moesin蛋白表达均增高,两两之间差异有统计学意义（P<0.01）。而且,GES-1/AGS+△cagA7.13组moesin蛋白的表达显着低于GES-1/AGS+WT7.13组,两者之间差异有统计学意义（P均<0.05）,进一步证实H.pylori上调moesin蛋白的表达可能主要是通过CagA来实现的。（4）利用Western blot方法检测12对临床胃癌及配对组织样本中moesin蛋白的表达情况,结果显示83.3%（10/12）的moesin蛋白在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义（P<0.01）,利用免疫组织化学染色法检测也显示moesin蛋白在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义（P<0.01）。（5）利用免疫组织化学染色法检测moesin蛋白在Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变中的表达,结果显示,无论是在炎细胞还是腺细胞中,moesin蛋白在Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变中的表达差异有统计学意义（P<0.01）;在腺细胞中,moesin蛋白表达在ML组显着高于其他各组（P<0.01）,而其他组之间无统计学差异（P>0.05）;在炎细胞中,则moesin蛋白表达在SCNAG组显着高于其他胃黏膜病变组（P<0.01）,而其他组各组之间无统计学差异（P>0.05）。（6）利用免疫组织化学染色法检测moesin蛋白在合并H.pylori感染Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变中的表达,结果显示,无论是在炎细胞还是腺细胞中,moesin蛋白在Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变中的表达差异有统计学意义（P<0.01）,尤其是在腺细胞中,无论有无H.pylori感染,ML组的表达均高于其他胃黏膜病变组（P均<0.001）;无论是在炎细胞还是腺细胞中,moesin蛋白在合并H.pylori感染Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变中的表达均显着高于相对应的无H.pylori感染Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变,以腺细胞明显（P<0.05）。结论:1.“Correa’s Cascade”假说中胃黏膜病变逐级交联及时序演变的进展规律与真实世界证据相吻合,假说中不同阶段的胃黏膜病变合并癌变的风险大小不一,对胃癌防控有着确切的指导价值。2.H.pylori感染与“Correa’s Cascade”假说相关胃黏膜病变有关,二者变化趋势基本一致,故在“Correa’s Cascade”假说指导下控制H.pylori感染对预防胃癌具有积极意义。3.ERM家族蛋白moesin在“Correa’s Cascade”假说相关胃黏膜病变中高表达,尤其是在胃黏膜癌变阶段,且与H.pylori及其毒力因子CagA有关。4.高表达的moesin与胃癌进展有关,能预示胃癌的不良预后,故异常高表达的moesin可能发挥着促癌作用,有望作为胃癌的诊断生物标志物或治疗干预靶点。
赵巧云[2]（2021）在《PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究》文中提出研究背景与目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,预后较差。胃癌的发生发展经过了一系列漫长的演变过程,其中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染是该演变过程中最重要的始动因子。H.pylori通过多种毒力因子如Cag A、Oip A、Vac A等调控胃上皮细胞生物学行为的改变,但其致病机制目前尚不明确。我们前期利用H.pylori 7.13和CCS9803两种野生菌株分别感染胃上皮细胞GES-1,构建体外细菌细胞共培养模型,并进行细胞转录组学测序分析和实验验证,发现H.pylori感染可上调胃上皮细胞GES-1的前列腺跨膜蛋白雄激素诱导基因1（prostate transmembrane protein androgen inducible gene 1,PMEPA1）的m RNA和蛋白的表达,提示了PMEPA1可能参与H.pylori感染相关的胃黏膜病变过程。PMEPA1是于2000年在前列腺组织中被发现的一种新型雄激素诱导基因,主要在细胞膜和亚细胞器如溶酶体、高尔基体等的亚细胞器膜上表达。已知PMEPA1基因是一种TGF-β诱导基因,负性调控TGF-β信号通路。研究发现,PMEPA1在多种肿瘤中高表达,参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学过程。然而,PMEPA1在胃癌中的研究尚不明确,且PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜改变过程中的作用也未见报道。因此本文通过生物信息学、PMEPA1基因干预、细胞转录组学等多种方法研究了PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜病变过程中的作用及机制,为进一步挖掘H.pylori感染致病的新的分子机制及为H.pylori相关胃癌的靶向调控提供新的理论依据。材料方法:（一）PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中的表达分析:（1）利用Oncomine数据库、GEO数据库、TCGA数据库的胃癌测序数据,分析PMEPA1在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达及PMEPA1在不同劳伦分型胃癌中的表达;（2）从南昌大学第一附属医院手术室收集18对胃癌及癌旁组织标本,通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）及蛋白质印迹（western blot,WB）的方法检测了PMEPA1在胃癌及癌旁组织的表达。2.PMEPA1表达与胃癌患者的预后分析:利用Kaplan-Meier Plotter在线分析数据库,评价PMEPA1与胃癌患者的总体生存期（over survival,OS）,无进展生存期（progression-free survival,FP）和进展后生存期（post-progression survival,PPS）的关系,明确PMEPA1的表达与胃癌患者预后的关系。3.PMEPA1在胃癌的诊断价值:利用p ROC包对TCGA数据库中的375例胃癌和32例正常胃黏膜组织测序样本进行受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析,并计算曲线下面积（Areas under the curve,AUC）,评估PMEPA1在胃癌的诊断价值。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）根据PMEPA1的中位表达值,将TCGA数据库的375个胃癌样本分为PMEPA1高表达组和低表达组,利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析两个差异基因集富集的生物学过程;（2）用R语言对TCGA数据库中与PMEPA1基因相关的基因进行批量计算,并对相关基因进行KEGG信号通路富集。（二）H.pylori感染及其毒力因子对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.H.pylori及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）构建H.pylori 7.13和PMSS1的oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）,并制备抗Oip A抗原的抗体,在基因和蛋白水平对oip A基因的敲除效果进行验证;（2）将H.pylori PMSS1野生菌株以不同感染复数（MOI）与胃上皮细胞GES-1共培养不同时间（1h,3h,6h,12h,24h）,检测PMEPA1蛋白表达水平,并检测感染6h时PMEPA1的m RNA表达水平;（3）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）分别以不同MOI感染AGS细胞6h,检测PMEPA1蛋白的表达水平;（4）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）、cag A基因敲除菌株（Hp7.13Δcag A和Hp PMSS1Δcag A）及oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）分别与胃上皮细胞GES-1细胞和AGS细胞共培养6h,检测PMEPA1的蛋白和m RNA表达水平。2.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:从南昌大学第一附属医院病理科收集H.pylori感染的不同胃黏膜病理阶段的内镜标本石蜡切片,通过免疫组化法检测PMEPA1的表达。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1过表达及敲减稳转细胞株的构建:分别构建过表达PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1highGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1highGES-1)、敲减PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1lowGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1lowGES-1)、过表达PMEPA1的BGC-823细胞(PMEPA1highBGC-823)及对照细胞(NC-PMEPA1highBGC-823)。2.PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响及机制:（1）通过平板克隆形成实验、实时无标记细胞分析（Real Time Cellular Analysis,RTCA）技术、CCK8法检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞增殖的影响;（2）通过transwell侵袭和迁移实验、划痕修复实验检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞侵袭和迁移的影响;（3）通过生物信息学分析TCGA数据库胃癌数据集中PMEPA1与EMT转录因子的相关性;（4）Western Blot检测EMT相关分子的蛋白表达水平。3.PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响:（1）H.pylori PMSS1的野生菌株、cag A及oip A敲除菌株感染PMEPA1highBGC-823细胞及其对照细胞,RTCA技术、transwell侵袭和迁移实验检测PMEPA1过表达对H.pylori感染的胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;（2）H.pylori 7.13野生型菌株感染PMEPA1lowGES-1及其对照细胞NC-PMEPA1lowGES-1,transwell实验检测PMEPA1敲减对H.pylori感染的胃上皮细胞的侵袭和迁移能力的影响。（四）转录组学分析PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学功能的影响1.转录组学样品准备:将Hp7.13wt和Hp PMSS1wt分别感染PMEPA1lowGES-1及NC-PMEPA1lowGES-1细胞（MOI=100）,将Hp7.13wt、Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染PMEPA1highGES-1及NC-PMEPA1highGES-1细胞（MOI=100）,H.pylori感染6h后收集细胞总RNA;同时收集PMEPA1highBGC-823及NC-PMEPA1highBGC-823细胞总RNA;每个组设置三个生物学重复,共收集48个RNA样品。2.转录组测序及分析:（1）转录组测序委托上海美吉生物医药科技有限公司,基于Illumina Novaseq 6000测序平台,通过c DNA文库构建、上机测序、测序数据质控、基因注释等步骤获得基因表达量数据;（2）利用DESeq2软件对表达基因进行差异分析,筛选标准为差异基因表达倍数（Fold Change）>1.5,校正P<0.05;（3）采用Goatools软件对差异基因进行GO富集分析,校正P<0.05为显着富集;采用R语言对差异基因进行KEGG富集分析,P<0.05为显着富集。结果:（一）PMEPA1在胃癌组织的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中高表达:（1）Oncomine数据库分析结果显示,PMEPA1在多种癌症组织中显着高表达（P<0.05）,包括乳腺癌、宫颈癌、头颈癌、肺癌及多个消化系统肿瘤如食管癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌。（2）利用GEPIA数据库,共纳入408例TCGA胃癌样本和211例包含TCGA及GETx数据库的正常胃黏膜组织样本,分析结果显示,PMEPA1在胃癌组织样本的表达显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（3）从GEO数据库中下载三个胃癌测序数据集（GSE54129,GSE79973,GSE118916）,分析结果显示,在三个GEO数据集中,PMEPA1在胃癌组织中的转录水平均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（4）利用Oncomine数据库分析PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织中的表达情况,结果显示PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织的表达均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（5）18例胃癌及癌旁手术标本的q RT-PCR及WB结果显示,PMEPA1在胃癌组织的表达显着高于癌旁组织（P<0.05）。2.PMEPA1高表达与胃癌患者不良预后有关:Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示,PMEPA1是胃癌患者预后不良的风险因素（HR>1）,PMEPA1高表达的胃癌患者总体生存期（HR=1.52）、无进展生存期（HR=1.38）及进展治疗后生存期（HR=1.67）显着缩短（P<0.05）。3.PMEPA1诊断胃癌的临床价值:对TCGA数据库的胃癌数据集绘制PMEPA1基因的受试者工作曲线（ROC）,曲线下面积AUC为0.893,说明PMEPA1是良好的胃癌诊断标志物。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）GSEA分析结果显示,PMEPA1高表达与TGF-β、上皮间充质转化（EMT）、血管生成、缺氧、Wnt信号通路和Hedgehog信号通路显着正相关（FDR q-value<0.05）;（2）批量相关性基因的KEGG富集分析结果显示,PMEPA1及其相关性基因主要富集在E2F靶基因、有丝分裂纺锤体、MYC靶基因、蛋白质分泌、DNA修复、G2M细胞周期检查点、血管生成、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、紧密连接、EMT等信号通路,其中PMEPA1与EMT信号通路呈显着正相关（校正P值=0.005）。（二）H.pylori感染对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.成功构建了Hp7.13和Hp PMSS1菌株的oip A基因敲除菌株,及抗Oip A抗原的兔多克隆抗体。2.H.pylori感染上调胃上皮细胞PMEPA1蛋白和m RNA表达水平:（1）前期转录组学分析结果显示,Hp7.13和Hp CCS9803菌株感染感染GES-1细胞24h,与未感染H.pylori的细胞相比,PMEPA1表达分别上调1.59倍和1.13倍,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）Hp PMSS1以不同MOI感染胃上皮GES-1细胞1、3、6、12、24h,在感染6h和12h时随着MOI增大,PMEPA1蛋白表达水平逐渐上升,在MOI=50表达水平最高（P<0.05）,PMEPA1的m RNA表达水平在感染6h时MOI=100表达最高（P<0.05）。（3）将Hp 7.13和PMSS1以不同MOI感染胃癌细胞株AGS 6h,随着MOI的增加,PMEPA1蛋白表达水平上升,其中MOI=50在两个菌株中都有统计学差异（P<0.05）。3.Hp毒力因子Cag A和Oip A对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1 6h,Western Blot结果显示,Hp7.13wt或PMSS1wt感染后PMEPA1蛋白表达高于未感染的对照组,而cag A和oip A基因敲除菌感染的PMEPA1蛋白表达低于野生组;（2）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1和AGS细胞6h,荧光定量PCR结果显示,Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染GES-1和AGS细胞后,PMEPA1的m RNA表达水平显着高于未感染细胞（P<0.05）,而cag A和oip A基因敲除菌感染时PMEPA1的m RNA表达显着低于野生菌感染的细胞（P<0.05）。4.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:（1）PMEPA1在炎细胞和腺细胞中均有表达,主要定位于细胞质及核膜。（2）在腺细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的轻度慢性非萎缩性胃炎、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）;在炎细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的重度非萎缩性炎症、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）。（3）在H.pylori感染的标本中,PMEPA1在轻度和重度非萎缩性胃炎患者标本腺细胞中的表达显着低于肠化生、异型增生和胃癌组（P<0.05）;在轻度非萎缩性胃炎的炎细胞中的表达显着低于其它各组（P<0.05）;在H.pylori未感染患者,无论是腺细胞还是炎细胞,PMEPA1的表达在胃癌组均显着高于其它各组（P<0.05）。以上结果提示,PMEPA1可能参与了H.pylori感染的胃黏膜病变过程。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖:（1）平板克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highGES-1的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;PMEPA1lowGES-1的增殖能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）体外克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highBGC-823的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;2.PMEPA1促进胃上皮和胃癌细胞的侵袭和迁移:（1）Transwell侵袭和迁移实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的侵袭和迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1lowGES-1细胞的侵袭和迁移能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）划痕修复实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）。3.PMEPA1与上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）有关:（1）利用Cbioportal数据库分析了PMEPA1与EMT有关基因的相关性,分析结果显示,PMEPA1与间充质细胞标志物N-cadherin的编码基因CDH2、Vimentin的编码基因VIM、EMT间充质细胞转录因子ZEB1、TWIST1、TWIST2显着正相关（P<0.05）,与Snail转录因子编码基因SNAI1和Slug转录因子编码基因SNAI2显着正相关（P<0.05）;与基质金属蛋白酶分子编码基因MMP11、MMP14、MMP7、MMP2、MMP1、MMP17、MMP13和MMP24显着正相关（P<0.05）;（2）Western Blot结果显示,PMEPA1lowGES-1的E-cadherin蛋白表达显着高于NC细胞（P<0.05）,N-cadherin蛋白表达显着低于NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1high GES-1则反之（P<0.05）。4.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞BGC-823增殖的影响:Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823细胞和对照细胞,RTCA结果显示,H.pylori感染18小时后开始促进NC组细胞的增殖,在感染后的40-78h内,Hp PMSS1wt菌株显着促进NC-PMEPA1highBGC-823细胞的增殖（P<0.05）,而Hp PMSS1Δcag A及Hp PMSS1Δoip A感染组与Hp PMSS1wt感染组相比,细胞增殖无统计学差异（P>0.05）;Hp PMSS1wt菌株及cag A和oip A敲除菌株对PMEPA1highBGC-823细胞的增殖无统计学差异（P>0.05）。5.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞和胃上皮细胞迁移和侵袭的影响:（1）PMEPA1过表达对H.pylori感染的BGC-823胃癌细胞迁移和侵袭的影响:H.pylori未感染组中,过表达PMEPA1显着促进BGC-823细胞的迁移和侵袭（P<0.05）;Hp7.13wt感染PMEPA1highBGC-823及对照细胞后细胞迁移和侵袭能力显着高于未感染细胞（P<0.05）,同时Hp7.13wt感染组细胞的迁移和侵袭能力显着高于Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染组（P<0.05）;Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823和NC细胞后,细胞侵袭能力同Hp7.13菌株,而迁移能力在PMEPA1highBGC-823细胞各组无统计学差异（P>0.05）。（2）PMEPA1敲减对Hp7.13wt感染的胃上皮GES-1细胞的迁移和侵袭的影响:Hp7.13wt感染PMEPA1lowGES-1及对照细胞后,细胞迁移和侵袭能力显着增加（P<0.05）。（四）转录组学分析PMEPA1在H.pylori感染的胃上皮细胞作用的生物学功能1.PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响:（1）PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞GES-1转录水平的影响:（1）GES-1过表达PMEPA1后共有1025个差异基因,敲减PMEPA1后共有1376个差异基因;（2）差异基因主要富集的GO通路有细胞运动相关如质膜黏附分子的细胞间黏附作用、趋化运动、黏附过程、细胞迁移、细胞运动、细胞外基质成分、细胞运动的调节等生物过程;（3）差异基因富集到的KEGG信号通路主要有细胞粘附分子、TGF-β、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）PMEPA1过表达对胃癌细胞株BGC-823转录水平的影响:（1）共有132个差异基因;（2）主要富集的GO通路有细胞外基质组成、组织形态发生、急性炎症反应、TGF-β的分泌调控等生物过程;（3）主要富集到的KEGG通路包括耶尔森菌感染、小细胞肺癌、内吞、抗坏血酸和醛酸代谢、肌动蛋白细胞骨架的调控、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、ECM-受体相互作用。综上,PMEPA1过表达或敲减主要影响细胞运动、迁移、细胞黏附、受体配体相关作用、TGF-β信号通路、ECM-受体相互作用等生物学过程。2.H.pylori感染对敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响（1）H.pylori感染对敲减PMEPA1的GES-1细胞转录水平的影响:（1）Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染PMEPA1lowGES-1细胞后,分别有2315和959个差异基因;（2）差异基因富集的GO通路相似,主要包括细胞对缺氧的反应、细胞分裂、血管发育的调控、细胞周期的正向调控、细胞运动的正向调控等生物过程;（3）共同富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）H.pylori感染对过表达PMEPA1的GES-1转录水平的影响:（1）Hp7.13wt感染NC-PMEPA1highGES-1后,共有1646个差异基因,富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路的研究、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路等;（2）Hp7.13wt与Hp7.13Δcag A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因富集到了17条信号通路,主要有肿瘤中的micro RNAs、细胞周期、P53信号通路、细胞衰老、FOXO信号通路、癌症中的转录调控异常、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路等,说明cag A可能通过以上这些通路起作用。（3）Hp7.13wt与Hp7.13Δoip A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因未富集到KEGG通路。综上,H.pylori感染可能通过转录因子的调控作用、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路介导敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的变化,其中毒力因子Cag A可能发挥重要作用。3.PMEPA1对不同H.pylori菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响（1）PMEPA1敲减对Hp7.13（或PMSS1）感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp PMSS1wt）感染PMEPA1lowGES-1及其对照组细胞,差异基因富集的KEGG通路相似,主要包括AGE-RAGE信号通路的研究、癌症中胆碱代谢、细胞衰老、Hippo信号通路、EGFR酪氨酸酶抑制耐受、癌症中的micro RNA、Fox O信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、细胞骨架调控等;（2）PMEPA1过表达对不同H.pylori菌株感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）感染PMEPA1highGES-1及其对照细胞,差异基因富集的信号通路相似,主要的GO富集有TGF-β的反应、趋化性的调节、质膜粘附分子的粘附、细胞对生长因子刺激反应等过程等生物过程;主要的KEGG富集有细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路、TGF-β信号通路、Hedgehog信号通路、NOD样受体信号通路、IL-17信号通路等。综上,在H.pylori感染胃上皮细胞的过程中,PMEPA1可能通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。结论:1.PMEPA1在胃癌组织高表达,与胃癌不良预后有关,是良好的胃癌诊断标志物。2.PMEPA1高表达促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,与EMT表型相关。3.H.pylori感染调控PMEPA1的表达,促进胃上皮细胞的增殖、侵袭和迁移,部分依赖于毒力因子Cag A和Oip A的作用。4.H.pylori感染胃上皮细胞调控多种生物学过程;PMEPA1通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。
张富花[3]（2020）在《武威队列幽门螺杆菌感染流行病学研究》文中指出胃癌在世界范围内的发病率和死亡率均高,危害严重。位于中国西北部的甘肃省武威市为胃癌高发区。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）为Ⅰ类致癌因子。本研究利用大规模自然人群建立的武威队列,开展了人群Hp感染状况及主要毒力因子的基线调查研究。第一部分武威队列幽门螺杆菌感染及相关因素分析目的利用建立的武威市大规模（25000人）自然人群队列开展横断面基线调查,探讨当地人群Hp的感染状况及其相关危险因素以及Hp感染与胃及胃外疾病发生的相关性。为探询武威市人群胃癌及其他上消化道疾病高发的原因,帮助制定防控策略提供理论依据。方法以武威队列为研究对象,采用14C呼气试验测定队列人群中Hp的感染状况,胃镜检查诊断胃部疾病,并根据需要取胃黏膜活检标本进行组织病理学诊断,分析Hp在不同胃疾病中的感染率。开展武威队列的问卷调查,包括人口及社会学、饮食习惯、生活方式及胃肠外疾病病史等。统计学分析不同人口学、生活方式、饮食习惯与Hp感染的关系、以及人群常见胃外疾病与Hp感染的相关性。结果1.武威队列中最终有21291人完成了14C呼气试验,其中21265人行胃镜检查,9479人取活检进行了组织病理学检查。Hp感染率为52.95%（11275/21291）,其中男性的感染率是52.79%（5290/10021）,女性的感染率是53.11%（5985/11270）,（P=0.644）。Hp感染阳性人群的平均年龄（50.10±7.47岁）显着低于阴性人群（51.04±7.85岁）（P<0.001）。2.Hp的感染率在<40岁、40～、50～岁,以及60～岁以上人群中的感染率依次为56.53%、55.12%、52.56%、46.83%,呈现出随年龄增长逐渐降低的趋势（P<0.001）。有配偶人群Hp的感染率（53.19%）显着高于无配偶人群（47.99%）（P=0.002）;农民人群中Hp的感染率（53.42%）显着高于非农民人群（46.18%）（P=0.002）;文盲中Hp的感染率（49.25%）显着低于接受了小学（51.83%）和初中及以上教育程度人群（55.26%）（P<0.001）;家庭年收入在10000-19999元的人群Hp感染率（55.59%）显着高于家庭年收入为20000-29999元人群（52.79%）和收入超过30000元的人群（49.66%）（P<0.001）。Hp感染率在不同BMI人群之间的差异无统计学意义（P>0.05）。3.队列中每年进食蔬菜和水果大于6个月人群Hp的感染率（51.15%）显着低于少于1个月（55.36%）、1～个月（55.54%）和4～个月（53.62%）的人群（P<0.001）;进食速度快的人群Hp感染率（51.35%）显着低于进食速度慢的人群（53.39%）（P=0.014）;Hp在睡眠正常人群中的感染率（53.53%）显着高于轻度失眠（49.20%）、中度失眠（50.50%）及重度失眠（46.67%）的人群（P=0.001）。Hp感染率在是否吸烟、饮酒及进食烫食习惯、进食油炸饮食及不同体力活动人群之间的差异无统计学意义（P>0.05）。4.多因素logistic回归分析显示,年龄每增加10岁,Hp感染的风险降低12%（OR:0.88,95%CI:0.84-0.91）;家庭年收入增加到30000元以上,Hp感染的风险可以降低6%（OR:0.94,95%CI:0.91-0.96）;每年进食新鲜蔬菜和水果6个月以上,Hp感染的风险可以降低6%（OR:0.94,95%CI:0.91-0.97）;具有快速进食习惯者Hp感染的风险降低8%（OR:0.92,95%CI:0.86-0.98）。和文盲相比,接受小学教育、初中及以上文化程度的Hp感染的风险增加1.11倍（OR:1.11,95%CI:1.07-1.16）;从事农业生产者Hp感染的风险增加1.39倍（OR:1.39,95%CI:1.24-1.57）。5.Hp在胃镜诊断的不同胃疾病中的感染率分别是:非萎缩性胃炎46.59%、慢性萎缩性胃炎55.29%、胃溃疡69.55%、十二指肠球部溃疡60.76%、复合型溃疡76.36%、胃息肉53.69%、十二指肠炎55.16%、胃癌49.32%、胃黄色素瘤72.06%、急性胃炎41.51%、黏膜下病变47.22%,差异有统计学意义（P<0.001）。在不同组织病理学诊断中的Hp感染率分别是:非萎缩性胃炎44.31%、萎缩性胃炎54.28%、肠化生56.58%、低级别上皮内瘤变58.53%、胃癌47.74%,差异有统计学意义（P<0.001）。6.武威队列人群有胆囊炎/胆囊结石、高血压、哮喘病史者Hp的感染率显着低于无这些病史的人群（50.13%vs 53.37%）（48.73%vs 53.67%）（47.49%vs53.05%）（P<0.05）。Hp的感染率在是否有糖尿病、高脂血症、心肌梗塞、贫血及病毒性肝炎等病史人群间无显着性差异（P>0.05）。结论1.武威队列人群Hp感染率为52.95%,呈随年龄增高而降低的趋势。Hp感染在40岁前已经达到高峰,和胃癌低发区相比高峰提前,这可能与当地胃癌的高发有关。2.年龄的增加、家庭年收入的提高、足量进食蔬菜和水果的天数增加、快速进食的习惯是降低武威市人群Hp感染的独立风险因素,农民以及接受了小学以及初中以上教育是增加Hp感染的风险因素。3.Hp感染与武威市人群胃部疾病的发生有关,尤其是与胃黏膜癌前病变程度的加重密切相关。4.Hp感染与武威市人群胆囊炎/胆囊结石、高血压及哮喘的发生呈负相关。第二部分武威队列Hp主要毒力蛋白血清抗体、血清学分型与胃疾病、胃癌前病变的相关性研究尿素酶（Ure）、细胞毒素相关基因蛋白（CagA）、空泡细胞毒素（Vac A）、热休克蛋白60（Hsp60）是幽门螺杆菌（Hp）产生的重要毒力因子。硝基还原酶（Rdx A）与Hp对甲硝唑的敏感性密切相关,上述因子的表达对Hp的致病性和药物敏感性具有重要意义。目的:通过对武威队列Hp感染者血清Ure、CagA、Vac A、Hsp60和Rdx A抗体的检测,明确当地Hp上述因子的血清抗体的阳性状况及血清分型;明确Ure、CagA、Vac A、Hsp60和Rdx A血清抗体结果与胃疾病及胃癌前病变的关系,为当地Hp的精准治疗及胃癌防治提供一定的理论依据。方法:抽取武威队列中1162例14C-UBT阳性者的血清,用免疫斑点法检测Ure、CagA、Vac A、Hsp60和Rdx A抗体,分析当地Hp感染血清分型。结合对目标人群的问卷调查、胃镜检查和胃活检组织病理学诊断结果,分析Hp感染者血清抗体及血清分型与人口社会学因素之间的相关性、与不同胃疾病及胃癌前病变的关系,并进行风险评估。结果:1.Hp感染者血清中Ure、CagA、Vac A、Hsp60和Rdx A的抗体阳性率依次为100%、89.50%、85.97%、9.90%和18.24%。Ⅰ型Hp感染占90.10%,Ⅱ型占9.90%。2.CagA、Vac A和Rdx A抗体阳性者的平均年龄均低于阴性者（P<0.05）,女性的Vac A和Rdx A抗体阳性率（88.25%和22.06%）高于男性（83.59%和13.93%）,不吸烟者Rdx A抗体阳性率（18.66%）高于吸烟者（13.11%）（P<0.05）。其他人口社会学因素间血清Hp抗体的阳性率差异均无统计学意义（P>0.05）。3.胃镜检查有胃息肉者CagA抗体阳性率和Ⅰ型Hp感染率分别是82.14%和83.93%,显着低于慢性非萎缩性胃炎（92.05%）（P<0.05）。CagA抗体阳性者胃息肉的风险降低48%（OR:0.52,95%CI:0.28-0.97）、Ⅰ型Hp感染者胃息肉的风险降低47%（OR:0.43,95%CI:0.24-0.85）;萎缩性胃炎者Hp Hsp60抗体阳性率（10.59%）显着高于慢性非萎缩性胃炎（6.53%）,Hsp60抗体阳性者胃镜下萎缩性胃炎的风险增加1.66倍（OR:1.66,95%CI:1.01-2.73）。其他Hp血清抗体阳性率在不同的胃疾病中差异无统计学意义（P>0.05）。4.非萎缩性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生和低级别上皮内瘤变人群血清CagA抗体的阳性率分别为65.38%、86.06%、90.15%和92.41%,血清CagA抗体阳性者增加萎缩性胃炎、肠化生、低级别上皮内瘤变的风险分别为3.09倍（OR:3.09,95%CI:1.22-7.82）、4.70倍（OR:4.70,95%CI:1.73-12.8）及6.50倍（OR:6.50,95%CI:2.38-17.8）。Ⅰ型Hp感染率在非萎缩性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生和低级别上皮内瘤变人群中依次为80.77%、87.27%、90.15%和92.41%,呈升高趋势,感染者患萎缩性胃炎、肠化生、低级别上皮内瘤变的风险逐渐增高,但差异无统计学意义（P>0.05）。其他Hp血清抗体的阳性率在胃癌前病变中差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.武威市人群中流行的Hp以高致病Ⅰ型菌株感染为主,与萎缩性胃炎、肠化生、低级别上皮内瘤变以及胃癌的发生密切相关。2.武威市人群感染CagA阳性的Hp显着增加了胃癌前病变的发生风险。CagA抗体阳性、Ⅰ型Hp感染可一定程度上降低胃息肉发生的风险;Hp Hsp60的表达增加萎缩性胃炎发生的风险。3.武威市人群感染Hp者CagA、Vac A和Rdx A与年龄有一定的关系。女性和不吸烟者中Rdx A抗体阳性率高,提示这些人对甲硝唑敏感性高。
师梦[4]（2019）在《幽门螺杆菌感染与儿童再发性腹痛的临床研究》文中研究说明目的:再发性腹痛（recurrent abdominal pain,RAP）是儿科临床中常见的症状,指病程大于3个月,发作超过3次的腹痛,多发生于3岁及以上的儿童,女孩发病率高于男孩,是儿童反复就诊的常见原因。RAP的病因很多,近年发现,幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染与RAP有着密切的关系。本课题通过对RAP患儿行13C-尿素呼气试验（13C-Urea Breath Test,13C-UBT）、H.pylori血清分型检测及胃镜检查,探讨H.pylori感染在儿童RAP中的发病率,以及H.pylori类型与腹痛严重程度的相关性。方法:随机选取2017年2月至2018年8月因RAP于滨州医学院附属医院儿科门诊就诊及收住院的儿童210例,其中男童81例,女童129例,年龄4～12岁,平均年龄为（8.2±3.5）岁,完善13C-UBT。另外,选取152例H.pylori 阳性儿童作为实验组,其中男童58例,女童94例,年龄4～12岁,平均年龄为（8.0±3.6）岁,完善H.pylori血清分型检测:Ⅰ型、Ⅱ型、中间型;正常对照组选自同期体检中心的健康儿童110例,其中男童48例,女童62例,年龄5～12岁,平均年龄为（8.3±3.0）岁,完善13C-UBT。RAP组、对照组的H.pylori 阳性率分别记为P1、P2,两组儿童在年龄、性别上均具有可比性,差异无统计学意义（P>0.05）;实验组记录各型H.pylori所对应的13C-UBT报告单中的数值,分析其差异;实验组配合胃镜检查者共125例,根据胃镜下胃黏膜病变程度分为:轻度炎症组、中度炎症组、重度炎症组及正常胃黏膜组,胃炎分级参照悉尼分类法,并分析H.pylori血清分型与胃黏膜病变程度的相关性,以及13C-UBT数值与胃黏膜病变程度的关系。结果:（1）RAP组H.pylori感染率较健康对照组升高（72.38%vs 40.0%）,即P1>P2,差异具有统计学意义（χ2=31.89 P<0.01）。（2）不同H.pylori血清分型的13C-UBT数值如下:Ⅰ型H.pylori:16.59±1.264;Ⅱ型 H.pylori:10.55±2.139;中间型 H.pylori:10.62±3.148。Ⅰ型H.pylori的13C-UBT数值较Ⅱ型、中间型H.pylori升高,差异均具有统计学意义（分别为t=18.86,P<0.01;t=13.85,P<0.01）;Ⅱ型、中间型H.pylori在13C-UBT数值中的差异无统计学意义（t=0.12,P>0.05）。（3）H.pylori血清分型与胃黏膜炎症程度有一定的相关性,H.pylori感染Ⅰ型患儿重度胃炎有12例,Ⅱ型患儿重度胃炎有3例,中间型患儿重度胃炎有2例,Ⅰ型与Ⅱ型、中间型相比较,差异均具有统计学意义（分别为:χ2=7.06,P<0.01:χ2=7.77,P<0.01）,Ⅱ型、中间型在重度胃炎的差异无统计学意义（χ2=0.02,P>0.05）;H.pylori感染Ⅱ型患儿轻度胃炎有24例,中间型患儿轻度胃炎有18例,二者的差异无统计学意义（χ2=0.58,P>0.05）;H.pylori感染Ⅱ型患儿中度胃炎有9例,中间型患儿中度胃炎有10例,二者的差异无统计学意义（χ2=0.32,P>0.05）。（4）13C-UBT数值与胃黏膜病变程度相关,重度胃炎组患儿的13C-UBT数值高于轻度、中度及正常胃黏膜组,差异均具有统计学意义（分别为t=9.79,P<0.01;t=11.02,P<0.01;t=65.54,P<0.01）;轻度胃炎组患儿的 13C-UBT 数值高于正常胃黏膜组,差异具有统计学意义（t=15.70,P<0.01）,而与中度胃炎组患儿的数值无统计学意义（t=1.58,P>0.05）。结论:（1）儿童RAP的发病与H.pylori感染有一定关系。（2）H.pylori血清分型与13C-UBT数值有一定关系,Ⅰ型H.pylori的13C-UBT数值高于Ⅱ型H.pylori、中间型H.pylori的13C-UBT数值,而后两者的数值差异未见统计学差异,考虑可能与样本量少有关。（3）H.pylori血清分型与胃镜下胃黏膜炎症程度有一定关系,Ⅰ型H.pylori感染患儿胃镜下胃黏膜病变程度较重。（4）统计中发现,胃镜下胃黏膜病变程度与13C-UBT数值有一定相关性。
张强[5]（2013）在《间质干细胞受幽门螺杆菌影响对胃上皮细胞作用及机制》文中进行了进一步梳理目的间质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一类分布广泛且具有多向分化潜能的成体干细胞,能迁移到炎症和损伤组织部位。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的重要病因,与胃癌的发生密切相关,H. pylori感染的胃肠道上皮细胞能促进MSCs向胃肠粘膜层募集。因此,MSCs是H. pylori感染所致胃炎微环境中的一种重要成份,然而在H. pylori导致的胃上皮细胞损伤或恶性转化中MSCs究竟起何作用及其机制迄今仍不清楚。因此,本研究旨在探讨H. pylori对MSCs的影响及其对胃上皮细胞的作用及机制,试图阐明MSCs参与H. pylori对胃损伤或胃癌发生、转移及治疗中的作用及机制,为胃癌发生与诊疗提供新的依据。方法体外模拟体内H. pylori（11637）感染过程,采用H. pylori（11637）活菌作为处理因素,与人脐带来源的间质干细胞（human umbilical cord MSCs, hucMSCs）)以感染指数100：1共培养24h,观察细胞形态变化,收集对照组及实验组的细胞用于后面的实时定量PCR及蛋白免疫印迹检测相关基因,并收集共培养的上清3000转每分钟,离心5min,将上清置.80℃贮存备用。所有实验均在同等条件下重复3次。分别用实时定量RT-PCR、Western blot方法检测H. pylori作用前后MSCs中癌相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts, CAFs）相关标志分子（FAP、N-cadherin、Vimentin、α-SMA等）表达变化情况。采用Luminex及ELISA法检测H. pylori作用hucMSCs后相关细胞因子的分泌情况。用Western blot法检测H. pylori刺激培养后的hucMSC中NF-kB水平、NF-kB核转位、磷酸化NF-kB及NF-kB抑制蛋白IkB-α的表达变化。应用NF-kB特异性抑制剂PDTC预处理MSCs90min,再用H. pylori刺激培养hucMSCs,观察其是否能干预H. pylori对MSCs的刺激效应。采用MSCs培养上清及H. pylori与MSCs共培养的上清分别与正常胃上皮细胞（GES-1细胞）株共培养48h,观察培养后的细胞形态变化,收集细胞并分别用实时定量RT-PCR和蛋白免疫印迹检测共培养后胃上皮细胞／胃癌细胞中EMT相关标志分子如E-cadherin、 N-cadheri、Vimentin等的表达情况。采用Transwell法检测不同上清处理后的GES.1细胞其迁移能力的变化。用手工计数法和MTT法检测正常胃上皮细胞GES.1在不同条件培养基处理后的生长曲线变化。应用平板克隆形成实验检测三种培养基处理过的GES.1细胞的克隆形成能力。流式细胞术和蛋白免疫印迹法分别检测细胞凋亡与凋亡相关蛋白表达,同时检测三种培养基处理过的GES.1细胞癌基因、抑癌基因及干性相关基因（Sox2、 Nanog及BMI）的变化。应用NF-kB特异性抑制剂PDTC（10μM）预处理MSCs90min,再用H. pylori刺激培养hucMSCs,取其上清与GES.1细胞共培养48h作为实验组,同时设立正常培养基和H. pylori刺激培养hucMSCs的上清再培养GES.1两组,以观察NF-kB参与MSCs转化的同时,是否还参与转化的间质干细胞对胃上皮细胞的损伤作用。所有数据均采用均数+SD方式表示,用SPSS统计软件对数据作进一步分析,多组间比较可用单因素方差分析法分析,对照组与实验组间两两比较用Student’t-f检测,如数据不满足方差齐,则采用Tamhane’T2方法进行结果校正。结果H. pylori刺激后的MSCs细胞形态更倾向于细长,胞质出现明显的空泡变性,有CAFs样成纤维细胞变化的倾向。实时定量RT-PCR和Western blot结果显示H. pylori作用24h后的MSCs中CAFs相关标志分子Vimentin、N-cadherin、α-SMA及FAP等均有不同程度的升高（P<0.05）。Luminex及ELISA法检测H. pylori作用后的hucMSCs分泌大量细胞因子。H. pylori刺激的MSCs胞核中NF-kB含量升高,而胞质中则下降,磷酸化的NF-kB在刺激组也是升高,存在时间依赖性,而NF-kB抑制蛋白IkB-α的表达下降。NF-kB特异性抑制剂PDTC抑制了H. pylori刺激的MSCs向CAFs样成纤维细胞的转化,同时还抑制了H. pylori刺激MSCs时分泌增加的一些因子的表达。H. pylori刺激培养的hucMSCs上清作用于GES-1细胞48h后,光学显微镜下观察到GES-1细胞形态较正常对照组变的细长如梭形,成纤维状或纺锤形,细胞两端尖细,细胞排列紊乱,部分细胞具有典型的间质干细胞的表型,与EMT相关的间质标志物N型钙粘蛋白（N-cadherin）及波形蛋白（Vimentin）等基因表达明显上调,而上皮标物E.钙粘蛋白（E-cadherin）基因表达明显下降,这几种分子的蛋白表达变化情况与mRNA变化趋势一致。另外,结果还显示体外经H.pylori处理后的MSCs可以促使正常胃上皮细胞发生EMT,其迁移能力、克隆形成能力及相关干性指标（Sox2、Nanog和BMI）的表达均增强,凋亡相关基因的蛋白表达及原癌基因与抑癌基因之间的平衡也部分被打破。被H. pylori感染后转化的间质干细胞在促进胃上皮细胞发生EMT的同时,还使其获得了部分在肿瘤细胞才能表现出来或典型表现的生物学特征或表型。采用H. pylori刺激PDTC预处理的hucMSCs上清并不能促使胃上皮细胞发生典型的EMT现象。结论H. pylori能促使MSCs句癌相关成纤维细胞样细胞转化,并伴有相应细胞因子的分泌。H. pylori对胃上皮细胞损伤或恶性转化的方式之一,是通过诱使MSCs向CAFs样转化,再由CAFs样转化的成纤维细胞进一步发挥对胃上皮细胞的作用来实现的。H.pylori作用后的MSCs促进胃上皮细胞／胃癌细胞发生EMT,在肿瘤发生和进一步的恶性转化过程中起重要作用,这一作用机制与NF-kB信号通路活化有关。本研究初步探讨了MSCs参与H. pylori慢性感染所致胃癌发生的作用及机制,对胃癌发生、转移及新的治疗靶点的寻找具有重要的意义。
陈建国[6]（2013）在《幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究》文中研究说明幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori, Hp）广泛存在于人类的胃中,是导致慢性胃炎、胃肠溃疡、胃腺癌等胃肠疾病的主要病原菌,已严重影响着人们的身体健康。尽管国内外采用抗生素三联、四联疗法在治疗H. pylori引起相关的胃炎和胃溃疡等胃肠疾病方面取得了较大成果,但临床发现广谱抗生素的治疗导致幽门螺杆菌耐药菌株不断出现和治愈后复发率居高不下,临床上将很快进入“感染-治愈-复发-再治疗-耐药”的恶性循环,不能彻底解决问题。因此希望通过疫苗免疫奶牛使在牛奶中产生高水平的抗幽门螺杆菌抗体,通过口服该抗体,来预防和治疗H. pylori引起的慢性胃炎、胃肠溃疡等胃肠疾病。因此希望使用安全、高效、使用方便的疫苗来免疫动物产生高浓度抗体或用该疫苗免疫动物使之对幽门螺杆菌产生有效的抵抗力。本研究首先选取生产后10天健康、无乳腺疾病和生殖器官疾病、体温正常的奶牛14头,随机分为两组：PBS对照组和幽门螺杆菌全菌蛋白免疫注射组,每组7头。用浓度为2×1010cfu/mL的幽门螺杆菌（H. polyri）NCTC11637全菌经超声破碎后与等剂量的完全（不完全）弗氏佐剂充分乳化后分别于0、14、28天三次多点肌肉注射全菌蛋白疫苗,每次4mL,免疫产后泌乳的健康奶牛,对照组每次注射PBS与弗氏佐剂乳化物4mL。每周采血和收集牛奶各一次,离心收集血清,以酶联免疫吸附试验测定血清、乳汁的IgG抗体,同时测量体温,观察发情和采食泌乳等健康情况。研究结果显示经肌注幽门螺杆菌全菌蛋白免疫奶牛后可在血清和乳汁中产生特异性抗体,抗体浓度显着高于对照组（P<0.05）,但免疫结束后不久逐渐下降。免疫奶牛的体温、发情和采食泌乳等情况正常。但全菌蛋白疫苗费用高,制作麻烦,注射时阻力大、奶牛反应强烈,且需要多次多点注射。结果表明肌肉注射幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗是一个安全、有效的免疫途径。但全菌蛋白疫苗制作麻烦,费用高,注射时奶牛反应大。因此希望构建更加安全、高效和使用更为方便的疫苗代替幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗。考虑到幽门螺杆菌是肠道菌群,通过口服引起胃肠道粘膜免疫是一种可行途径。但口服的蛋白疫苗的制作复杂,提纯麻烦,且时间较长,同时需加相应的免疫佐剂提高免疫原性,在口服过程中蛋白疫苗还容易被胃酸及胃蛋白酶破坏而丧失免疫功能。因此考虑用大肠杆菌或减毒沙门氏菌来作为载体。本实验室多次采用减毒猪霍乱沙门氏菌C500作为载体,安全且免疫效果好,希望构建幽门螺杆菌的减毒猪霍乱沙门菌C500口服活载体疫苗。本实验选取幽门螺杆菌中已证实具有免疫原性的两个基因：尿素酶B（urease B, UreB）和细胞毒素相关抗原（cytotoxin-associated antigen, CagA）。先采用PCR技术从幽门螺杆菌标准株SS1扩增Hp-UreB和Hp-CagA基因,将其连接至原核表达质粒pYA3493中,使之构建为pYA3493-UreB-CagA重组质粒,经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列,并与GenBank中已发表的相关序列的进行同源性分析。重组质粒pYA3493-UreB-CagA电击转入减毒猪霍乱沙门菌C500,培养后筛选阳性菌落,抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的UreB-CagA蛋白用SDS-PAGE和Western Blotting进行鉴定。然后将无特定病原菌昆明小鼠分成5组,每组10只,分别为肌肉注射幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗和灌胃分别给予含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500（0.2mL,1×1010CFUmL-1）、含空质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500（0.2mL,1×1010CFUmL-1）、减毒沙门氏菌C500（0.2mL,1×1010CFUmL-1）以及PBS （0.2mL）。每周免疫一次,连续五次。第六周后再用活H. pylori SS1（0.2mL,1×1010CFUmL-1）灌胃攻击,每天一次,连续三天。第九周采血后处死实验小鼠,取一半胃粘膜和十二指肠研磨进行细菌培养检查H. pylori在胃肠定植情况,另一半用于组织切片和免疫组化观察胃肠损伤情况和免疫蛋白分泌的情况,同时对重要脏器肝、脾、肺进行组织切片观察损伤情况。实验前和实验后每隔一周或二周采血一次,连续8次,离心分离血清,采用ELISA检测小鼠血清中的抗体水平。检验pYA3493-UreB-CagA减毒猪霍乱沙门菌C500口服疫苗对小鼠的免疫效果和口服疫苗的安全性评价。结果：核苷酸序列测定及同源性分析证实,克隆的Hp-CagA和Hp-UreB基因与GenBank中相关序列的同源性分别为98%和100%（472／480和1134／1134）。重组质粒PYA3493-UreB-CagA转染减毒猪霍乱沙门菌C500,可表达约59kD的UreB-CagA蛋白。全菌蛋白注射组和含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500组的血清中幽门螺杆菌特异抗体滴度显着高于含质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500组、减毒沙门氏菌C500组以及PBS组（P<0.01）。但均未完全保护月=pylori SS1对胃的攻击,五组中胃和十二指肠均有H. pylori SS1的定植。但全菌蛋白注射组和含质粒pYA3493-UreB-CagA的减毒沙门氏菌C500组小鼠胃肠内的菌落数量显着低于含质粒pYA3493的减毒沙门氏菌C500组、减毒沙门氏菌C500组以及PBS组（P<0.01）。免疫组化表明全菌注射组和口服疫苗中胃和十二指肠有明显的抗体存在,且所有组胃、十二指肠、肝、脾以及肺均无明显损伤,也无小鼠死亡。结果表明建立了同时表达Hp-CagA和Hp-UreB基因的减毒猪霍乱沙门菌疫苗株,该口服减毒沙门氏菌载体疫苗有明显的免疫预防效果,而且比较安全,但不能完全抑制幽门螺杆菌在胃和十二指肠中定植。以上是UreB-CagA双价口服活载体疫苗在小鼠体内的免疫效果,安全有效。体外实验希望通过构建H. pylori的CagA和UreB基因重组真核表达质粒用电击法转染到胃粘膜上皮细胞GES-1后,用幽门螺杆菌SSl攻击转染成功的胃上皮细胞(（?）ES-1,观察对细胞凋亡及细胞形态的影响,探讨细胞凋亡机制。采用PCR技术从幽门螺杆菌标准株SS1中获取CagA部分基因和UreB全长基因与真核表达载体pEGFP-N1相连,构建幽门螺杆菌CagA/UreB真核荧光表达载体pEGFP-N1-CagA-UreB,并用脂质体的方法将质粒pEGFP-N1-UreB-CagA和空质粒pEGFP-N1分别转染到胃粘膜上皮细胞GES-1中,用(3418筛选阳性细胞,用幽门螺杆菌SSl分别处理转染pEGFP-N1-CagA-UreB的细胞、转染pEGFP-N1的细胞以及没转染质粒的细胞。用Annexin V-APC和7-AAD染色后,流式细胞术检测胃上皮细胞GES-1凋亡和死亡的情况,同时透射电镜观察胃上皮细胞GES-1的形态变化。结果发现用脂质体转染质粒到细胞GES-1,转染效率可高达60%以上,500μg G418可对转染细胞进行筛选,筛选后的阳性细胞用幽门螺杆菌处理后,凋亡率要小于空质粒转染的细胞和未转染质粒的细胞,但长时间处理后GES-1细胞均死亡,电镜结果显示细胞凋亡和坏死。结果表明质粒pEGFP-N1-UreB-CagA可转染到胃上皮细胞GES-1在培养细胞内的表达可抵抗幽门螺杆菌SSl对细胞GES-1的破坏,减少细胞凋亡。但用幽门螺杆菌长时间、大剂量处理也会导致细胞凋亡和坏死。这说明尿素酶B和CagA可导致细胞凋亡,但同时也有其他途径参与凋亡过程。
谢立苹[7]（2012）在《幽门螺杆菌CagM、CagI蛋白的生物信息学分析》文中认为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）是目前发现唯一能够在人胃内定植、生存的微需氧革兰氏阴性杆菌。是世界性分布的病原菌,也是目前人类发生率最高的慢性细菌感染之一,全世界范围内感染率超过50%。来自世界各地的流行病学研究证实,H. pylori感染是消化性溃疡和慢性胃炎的重要病因,并与胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织（MALT）淋巴瘤的发病密切相关,1994年世界卫生组织已将其列为Ⅰ类致癌原。cag致病岛编码的Ⅳ型分泌系统是幽门螺杆菌的一个重要致病因素,通过此分泌系统cag致病岛可将其唯一效应分子CagA转运至宿主细胞并发挥其毒性作用。目前,cag致病岛编码基因的生物学功能及其参与H. pylori致病的机制尚未明确,因此,本文以cag致病岛中的cagM、cagI基因为研究对象,通过分子生物学、微生物学及生物信息学等技术探讨H. pylori cagM、cagl基因的结构和功能,以指导以后的实验研究,为更深入研究cag致病岛的致病机理奠定理论基础。方法：1.根据GenBank中已报道的H. pylori22695的全基因组序列,利用生物信息学软件Primer5.0自行设计cagM、cagI基因引物,获得H. pylori cagM、cagI基因。2. cagM、cagI基因T-A克隆后构建pGEM-T-cagM, pMD18-T-cagI载体,并进行序列测定。3. cagM、cagI基因测序结果提交GenBank,获得基因库登录号。4.运用DNAstar V7.1软件和ANTHEPROT5.0软件分析CagM、CagI蛋白基本性质,包括：氨基酸组成、分子量、等电点、疏水性、亲水性、抗原性等。5.利用生物信息学软件分析H. pylori cagM、cagI基因核苷酸序列及蛋白序列同源性。6.运用ANTHEPROT5.0软件和网络数据库等分析预测其结构,用PROSITE SCAN和Fingerprint分析推测其潜在的功能,包括蛋白的跨膜区、信号肽和剪切位点、二级结构、三级结构、功能位点、亚细胞定位、蛋白家族、蛋白质指纹图谱等。结果：1.应用PCR技术成功克隆了H. pylori cagM、cagI基因。2. cagM、cagI基因T-A克隆后测序,基因测序结果表明：H. pylori NCTC11637cagM基因全长1149bp （GenBank基因库登录号为：GU269568）,与设计序列大小完全一致,编码376个氨基酸；H. pylori NCTC11637cagI基因全长1086bp （GenBank基因库登录号为：HM126476）,与设计序列大小完全一致,编码361个氨基酸。3. CagM、CagI基本性质分析：CagM蛋白有376个氨基酸,分子量为43.76kD,理论等电点为9.3,有多个疏水区域和亲水区域,有多个抗原决定簇；CagI蛋白有361个氨基酸,分子量为39.37kD,理论等电点为5.56,疏水性不是很强,接近两亲性,亲疏水区域间隔分布,有多个明显的具有抗原活性的结构域。4. H. pylori cagM、cagI基因核苷酸序列及蛋白序列同源性比对分析发现：H.pylori cagM、cagI核苷酸序列与GenBank中已知的其他H. pylori菌株cagM、cagI的核苷酸序列同源性分别为96～99%和95～99%；将核苷酸序列按标准密码子翻译成蛋白质后,其氨基酸序列与其他H. pylori菌株氨基酸序列同源性分别为98～99%和96～99%。5. CagM、CagI结构预测分析：CagM蛋白N端20个氨基酸为信号肽,有一段跨膜区,剪切位点在第20个和第21个氨基酸之间,二级结构和三级结构中螺旋结构为主体,CagM蛋白定位于细菌周质空间；CagI蛋白N端20个氨基酸亦为信号肽,有三段跨膜区,剪切位点亦在第20个和第21个氨基酸之间,二级结构和三级结构中螺旋结构亦为主体,CagI蛋白是定位于外膜。6. CagM、CagI功能预测分析：CagM属于蛋白水解酶家族,有多个磷酸化位点,是多种激酶的底物,有糖基化位点和豆蔻化位点,通过翻译后剪切修饰,形成有功能的蛋白,在细菌周质空间行使信号传递和集装Ⅳ型分泌系统中其他蛋白的功能；CagI为稳定的疏水蛋白,保守性很强,有N-糖基化作用位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和豆蔻酰化作用位点,有膜蛋白、菌毛蛋白、转运蛋白、水解酶、ATP/GTP酶、微管蛋白、转录调节因子、锚蛋白、分泌系统蛋白等多个蛋白标签。结论：1.成功克隆了H. pylori cag致病岛中的cagM、cagI基因。2.获得了CagM、CagI蛋白的大部分理化特征数据,包括：氨基酸组成、分子量、等电点、疏水性、亲水性、抗原性等。3. H. pylori cagM、cagI核苷酸序列及蛋白序列同源性比对分析发现cagM、cagI基因作为H. pylori cag致病岛编码的Ⅳ型分泌系统结构基因之一,其核苷酸序列及氨基酸序列相对保守,说明二者在幽门螺杆菌致病过程中具有重要作用。4.应用生物数据库和多种生物学软件对H. pylori CagM、CagI蛋白进行全方位的信息学分析,为分析其结构和功能提供了依据。5.预测分析获得：CagM、CagI作为cag致病岛中两个重要蛋白,CagM蛋白定位于周质空间,功能可能是帮助cag致病岛中其他蛋白的集合组装以及协助转运CagA毒素蛋白；CagI蛋白是定位于外膜,在信号转导和物质转运过程中充当信使或载体,可能具有水解酶活性,ATP/GTP酶活性。
王芬[8]（2011）在《幽门螺杆菌相关胃癌基因差异表达谱的研究》文中提出我国胃癌的发生率在各类恶性肿瘤中位居第二,是严重危害人民身体健康的疾病。20世纪80年代以来,在人群中具有较高感染率的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）与胃癌的关系已受到广泛关注。流行病学证实,Hp慢性感染是导致胃癌的重要危险因素之一,与胃癌的发生发展密切相关,感染人群患胃癌的风险比非感染者高4倍。大多数研究表明在“慢性胃炎—胃黏膜萎缩—肠化生—异型增生—胃癌”这一癌变模式中,Hp可能起着先导作用。1998年Watanabe等首次报道Hp感染的蒙古沙土鼠可发生胃癌,这是Hp感染可诱发胃癌的直接证据。1994年,世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）正式将Hp列为胃癌的I类致癌原。但Hp引起胃癌的机制尚未完全阐明。胃癌的发生是一个多病因、多阶段的过程,感染Hp后,其结局可能发生慢性胃炎,也可能发展为胃癌。提示不同的菌株可能对胃黏膜上皮细胞产生不同的影响,导致不同程度的疾病发生。本实验选用临床分离自胃癌、胃炎患者的菌株各10例分别和GES-1细胞以不同浓度比例共培养,12h、24h和48h后分别收获细胞,进行MTT和流式细胞仪检测。结果显示不同来源的Hp菌株对GES-1细胞在增殖方面的影响具显着性差异,低浓度菌液可不同程度地促进细胞增殖,高浓度菌液则抑制细胞增殖活性,并且随着时间延长,低浓度菌液促细胞增殖作用逐渐增强,高浓度菌液对细胞增殖的抑制作用也越发明显。不同疾病来源的Hp菌株均会引起胃黏膜上皮细胞凋亡率增加,但组间差异无显着性。随着时间的延长和细菌浓度的提高,Hp菌株促胃黏膜上皮细胞凋亡的影响越发显着。分别挑选出对GES-1细胞的增殖影响最显着和最小的两株Hp菌株,分别和GES-1细胞共培养,收获细胞后提取RNA产物与全基因组表达谱芯片杂交后进行统计分析。结果显示Hp感染GES-1细胞后引起胃黏膜上皮细胞基因表达谱广泛地改变,这些差异表达基因与原癌基因与抑癌基因的激活或失活、细胞周期、细胞骨架和运动、细胞凋亡、DNA的合成、转录、细胞信号、蛋白质的翻译、物质和能量代谢等过程有关。筛选出一些与肿瘤的发生发展密切相关的基因,如TRAF1、HDAC6、ETS1、JUN、JUNB、CLDN1、CXCL2、IL-8、IRAK2、NUPR1、STC2、TP53BP1、TNFAIP3、DIO2以及SR蛋白家族,为下一步的基因表达验证和生物学功能研究提供了新的线索。在基因芯片的结果中挑选出差异性较大且科研意义较高、目前在Hp相关性胃癌发病机制尚未见报道的两个基因：TRAF1和HDAC6。将挑选出的对GES-1细胞的增殖影响最显着和最小的两株Hp菌株,分别和GES-1细胞共培养,用空白组进行对照,共分为对照组、胃炎组和胃癌组,共培养24小时后。收获细胞提取RNA产物,逆转录后得到cDNA,进行RT-PCR检测,结果发现TRAF1和HDAC6在对照组、胃炎组、胃癌组中的表达依次增强,与基因芯片结果一致。利用取自于临床的伴Hp感染的慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎（病检示肠上皮化生、不典型增生）及胃癌患者的标本进行免疫组化检测。结果显示TRAF1和HDAC6在慢性浅表性胃炎、肠上皮化生、不典型增生及胃癌组织中表达依次增强；提示TRAF1和HDAC6可能参与了Hp感染导致慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌的发生发展过程,为阐明Hp致胃癌发生的分子机制以及胃癌新的分子标记物提供了新的线索。
马一君[9]（2010）在《幽门螺杆菌iceA基因相关的致病机制》文中研究指明幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种专寄生于人胃黏膜的革兰阴性微需氧菌,世界上至少有50%人口感染H. pylori。许多研究表明,H. pylori感染后可导致胃炎和消化性溃疡等疾病,而且是胃癌、初级B淋巴瘤、硬化性胆管炎等疾病的重要因素。H. pylori的感染和发病涉及多个毒力因子。H.pylori接触胃粘膜上皮后可诱导表达一种毒力相关因子----粘膜接触诱导因子,是独立于cagA和vacA之外的一个重要毒力相关基因,由iceA （induced by contact with epithelium, iceA）基因编码,包括iceA1、iceA2两种等位基因。该基因可能通过调控相关毒素基因的表达等机制,参与Hp的致病作用。有研究发现,iceA基因与消化性溃疡及IL-8的黏膜浓度增高显着相关,而IL—8在H. pylori所致相关性炎症及疾病中发挥着重要作用。虽然国内外研究人员针对iceA基因与H. pylori所致临床疾病的相关性进行了大量研究,认为iceA基因（包括iceA1和iceA2基因）是慢性胃炎和十二指肠溃疡特异性相关基因,是一种与炎症和免疫损伤有关的毒力因子。但是iceA基因生物学功能及其致病机制仍不十分清楚。研究首先利用郑州市慢性萎缩性胃炎患者幽门螺杆菌临床分离株MEL-H.pylori 27,对iceA基因进行了克隆和序列分子特征分析；又根据同源重组原理,利用分子生物学方法进行了Hp27 iceA基因的插入失活突变,构建了iceA基因的Hp27突变株；然后进一步比较遗传背景相同的野生株和构建的Hp27 iceA基因突变株的重要特性,包括菌株的尿素酶活性、与细胞体外共培养时对胃粘膜上皮细胞的形态特征、细胞周期、增殖、凋亡等特性的影响；比较野生株和突变株对细胞的黏附性以及诱导细胞产生炎性细胞因子IL—8能力等炎症相关因素。为阐明iceA基因的功能及参与Hp致病的分子机制奠定了重要的实验基础。方法1幽门螺杆菌菌株的培养及基因组DNA的制备将临床分离株MEL-Hp27（Hp27）接种于布氏平板上,37℃微需氧条件下培养。3d后收获细菌,提取基因组DNA。2 Hp27 iceA基因的克隆2.1引物设计及PCR扩增参照GenBank公布的H.pylori菌株的iceA基因及其上下游核苷酸序列设计引物,用于扩增包括iceA基因在内的基因序列,扩增片段长度约790 bp。2.2 iceA基因克隆与测序PCR产物回收纯化后与pMD19-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α,筛选含重组质粒的阳性克隆,测序并分析。2.3基因序列特征分析从GenBank上检索H.pylori菌株的iceA基因的同源基因序列,用Clustal W软件对检索到的基因序列进行多重序列比较,应用MEGA4.0等软件对基因及相应氨基酸序列进行同源比较,并构建系统发生树进行分析。3 iceA基因打靶载体的构建3.1将重组质粒pMD19-T-iceA及质粒pBluescript SKⅡ（一）分别酶切并连接,构建重组质粒pBS-iceA。3.2将重组质粒pBS-iceA和卡那霉素抗性基因扩增产物酶切并连接,构建出带卡那霉素抗性标记的突变打靶载体pBS-iceA-km。4 iceA基因突变株的构建与鉴定采用电穿孔方法将打靶载体pBS-iceA-km电转化入受体菌株野生型Hp27中,在普通布氏平板上培养48h,然后转涂于含卡那霉素布氏平板上继续培养3-5d,筛选出iceA基因突变株,经PCR及测序进行鉴定。5野生株和iceA基因突变株特性比较5.1采用尿素酶活性诊断试剂,检测和比较野生株Hp27和Hp27 iceA插入失活突变株的尿素酶活性差异。5.2将细菌与SGC7901细胞共同培养一定时间,观察和比较细胞形态学变化。5.3采用MTT比色法,检测野生株Hp27和Hp27 iceA插入失活突变株对SGC7901细胞增殖活性的影响并分析比较。5.4流式细胞仪检测野生株、突变株与SGC7901细胞共培养一定时间后细胞周期的改变并分析比较。5.5流式细胞仪检测野生株、突变株与SGC7901细胞共培养一定时间后细胞的凋亡率并分析比较。6 iceA基因的炎症相关因素研究6.1 Hp诱导SGC7901细胞分泌细胞因子IL-8的分析H. pylori27野生株与突变株分别与细胞共培养一定时间,诱导细胞分泌IL-8。收集培养上清液,用ELISA试剂盒定量检测IL-8的浓度并分析。6.2 H. pylori 27野生株与突变株对胃粘膜上皮细胞的黏附作用分析野生株与突变株分别与细胞共培养一定时间,用免疫学方法处理,在荧光倒置显微镜下观察,流式细胞仪检测并分析其粘附率。7统计学分析处理应用SPSS11.0软件分析各指标数据,计量资料以x±S表示,两组之间的比较采用t检验；多组之间的比较,根据资料特点分别采用单因素方差分析或重复测量的方差分析；两两比较采用最小显着差法（LSD）,检验水准取a=0.05。结果1幽门螺杆菌分离株MEL-Hp27 iceA基因克隆及分析成功克隆幽门螺杆菌Hp27菌株iceA基因序列,扩增产物大小约为790 bp；重组质粒pMD19-T-iceA单酶切产生3820 bp片段,双酶切产生3000 bp和820 bp的2个片段；Hp27 iceA基因与大多数美国来源菌株同源性较高,均大于85%,与日本、印度等地区来源菌株同源性小于70%；Hp27 iceA基因一10区（TATA）位于起始密码子ATG上游的17bp处,起始密码子上游—7nt处有一个SD序列,起始密码子和上游cysE基因之间有两个8bp的串联可重复序列,其它地区分离菌株与Hp27 iceA基因特征有差异。2 MEL-Hp27 iceA基因突变株的构建采用基因重组的方法将卡那霉素抗性基因插入目的基因序列中,构建了突变打靶载体pBS-iceA-km;通过电穿孔转化方法将突变载体转化进入野生株,筛选出iceA基因突变株。用iceA基因两端序列设计引物分别扩增突变株和野生株的基因组DNA,结果突变株的扩增片段长度比野生株长约800bp,且突变株能扩增出卡那霉素抗性基因片段,野生株则不能。扩增产物的测序结果证明卡那霉素抗性基因插入目的基因序列中。3野生株和iceA基因突变株尿素酶活性比较将构建的突变株和野生株分别与尿素酶试剂作用,立即引起明显的颜色改变,野生株25min完全分解尿素酶试剂达到其最大吸光度值,且在此之前其吸光度值均高于突变株组。突变株组在50 min达到其最大吸光度值,且在作用25min后的吸光度值均高于野生株组,但两组之间的差异无统计学意义。4 iceA基因对SGC7901细胞生长的影响H.pylori突变株组和野生株组引起相似的细胞形态学改变,细胞拉伸,出现蜂鸟样改变；细菌和细胞共培养12h和18h,与对照组相比细胞活力轻度增加。共培养24h后,与对照组相比细胞活力则下降。在细菌与细胞共培养12h、18h、24h,野生株组和突变株组细胞增殖活性与空白组相比,差异无统计学意义（P>0.05）;培养30h和36h各组细胞的增殖活性差异有统计学意义（P<0.05）,其中,培养30h时突变株组的细胞增殖活性高于野生株组（P<0.05）；与对照组相比,野生株对细胞周期的影响主要表现为G2期的阻滞；而突变株对细胞周期的影响主要表现为S期的阻滞；野生株组和突变株组均可以诱导细胞产生明显凋亡,共培养24h及48h的凋亡率均高于对照组凋亡率（P<0.05）,但野生株组和突变株组之间凋亡率的差异无统计学意义（P>0.05）。5 iceA基因的炎症相关因素研究将H.pylori分别与SGC7901细胞共培养8h和24h后,检测诱导IL-8的浓度,野生株组和突变株组与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。共培养8h野生株组和突变株组之间,差异无统计学意义（P>0.05）,但共培养24h后,野生株组和突变株组间差异有统计学意义（P<0.05）；荧光显微镜下显示野生株和突变株均迅速粘附在SGC7901细胞表面,野生株和突变株的粘附率分别为32.49±2.96%和25.03±2.74%,但二组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论1来自不同地区的幽门螺杆菌分离菌株iceA基因序列的分子特征有差异。2 Hp27菌株和Hp27 iceA基因突变株可以抑制SGC7901细胞增殖并诱导细胞凋亡；iceA基因的插入失活突变明显改变细胞增殖和细胞周期特征,对细胞凋亡率和粘附率的影响无统计学意义。3 Hp27菌株和Hp27 iceA基因突变株均可以诱导SGC7901细胞产生IL-8, iceA基因的插入失活突变导致细胞产生IL-8的浓度明显减少。
黄增荣[10]（2010）在《幽门螺杆菌空泡毒素与线粒体腺嘌呤核苷酸转移酶相互作用的研究》文中指出幽门螺杆菌（Helicopter pylori,Hp）是人体内最常见的病原微生物之一,其感染率约占世界人口的50%。目前我国约有7亿人已感染Hp,未感染人群也普遍易感。流行病学研究提示Hp与胃癌的发生关系密切,世界卫生组织（WHO）已把Hp列为胃癌的首要致病因子。Hp感染引起的胃上皮细胞凋亡异常在胃癌的发生发展中起主要作用,但是其具体机制尚不清楚。Hp空泡细胞毒素（Vacuolating cytotoxin,VacA）与Hp产生的其它已知细菌毒素无明显的同源性,因其可致真核上皮细胞发生空泡变性而得名,是目前倍受关注的细胞毒力因子之一。胃癌患者所感染的Hp大多含有VacA,推测其在胃癌发生过程中可能起着较为重要的作用。VacA作为Hp的主要毒力因子,诱导上皮细胞凋亡是引发细胞癌变的关键分子,VacA诱导凋亡的作用与致空泡的作用虽有关联但不互为因果,但均与其膜通道活性改变有关。进一步研究发现VacA进入上皮细胞,能够靶向线粒体,引起线粒体膜通透性发生转换（mitochondrial permeability transition,MPT）,造成线粒体跨膜电位降低、细胞色素c释放、活化凋亡相关因子等一系列变化,诱导细胞发生凋亡, VacA导致MPT的机理尚不明确。腺嘌呤核苷酸转移酶（adenine nucleotide translocase,ANT）是线粒体内膜上含量最丰富的蛋白。它是将细胞的产能和耗能过程耦联起来的主要载体,也是组成线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore,MPTP,或简称PT孔）的关键组分,参与调节线粒体膜通透性转换孔的开放,与细胞凋亡紧密相关。线粒体凋亡途径是细胞的内源性凋亡途径,线粒体凋亡的发生最终都归结于MPT,而MPT的发生又是由于PT孔的开放所致。PT孔的分子构成尚不完全清楚,但目前已明确ANT是其位于线粒体内膜的关键蛋白,它在线粒体内、外膜的交接点处可形成“非特异性孔道”,通过它的开放、关闭以及与一些凋亡调控因子（如Bax/bcl-2家族）的互动,参与组织细胞凋亡的调控。VacA可以迅速转运至线粒体内膜,其导致的线粒体内膜通透性转换明显早于外膜通透性转换。其它配体或蛋白质可与ANT发生相互作用改变其构象来控制PT孔的开放与关闭,通过调节膜通透性的改变来达到调控细胞凋亡的目的,ANT在MPT中处于核心地位。研究VacA与ANT的相互作用关系,将有助于进一步明确VacA致MPT的机理。本研究通过酵母双杂交和免疫共沉淀来探索VacA与ANT的相互作用关系,为阐明Hp通过线粒体凋亡途径诱发胃癌的分子机制提供科学依据。1.酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定提取幽门螺杆菌标准毒株NCTC11637基因组DNA,PCR扩增VacA片段,并将其克隆入pGBKT7载体构建pGBKT7-VacA诱饵质粒。通过酶切和测序鉴定诱饵质粒构建成功后,将诱饵质粒转化宿主酵母菌AH109后,提取酵母总蛋白,Western-Blot分析重组蛋白的活性。同时分别检测了诱饵质粒的毒性、渗漏和自激活活性。结果显示构建的诱饵质粒对酵母菌无毒性、无渗漏也未表现自激活活性。2.酵母双杂交猎物质粒的构建及鉴定RT-PCR扩增ANT各异构体——ANT1、ANT2、ANT3基因,并分别将它们克隆入pGADT7载体构建pGADT7-ANT1、pGADT7-ANT2、pGADT7-ANT3猎物质粒,进行酶切和测序鉴定。各猎物质粒分别转化宿主酵母菌Y187后,提取酵母总蛋白,Western-Blot分析各重组蛋白的活性。一系列活性和毒性检测结果表明全部质粒均具有天然活性、对宿主未表现毒性,并且无渗漏和自激活活性。3.酵母双杂交试验将转化了诱饵质粒pGBKT7-VacA的酵母菌AH109分别与转化了猎物质粒pGADT7-ANT1、pGADT7-ANT2、pGADT7-ANT3的酵母菌Y187两两配对交配培养,富集交配后的合子铺不同严谨程度营养缺陷培养基,X-α-Gal检测报告基因的激活,结果未检测到报告基因的转录,表明VacA与ANT在酵母双杂交系统内未发生相互作用。4.VacA免疫共沉淀载体的构建及鉴定以pGBKT-VacA质粒DNA为模板,PCR扩增得到VacA片段并将其克隆入pCMV-Myc载体中构建pCMV-Myc-VacA表达质粒。将构建好的质粒采用脂质体法瞬时转染AGS细胞,Western Blot检测重组质粒在AGS细胞内的表达,结果表明重组蛋白得到正确表达。5.ANT各异构体免疫共沉淀载体的构建及鉴定分别以pGADT7-ANT1、pGADT7-ANT2、pGADT7-ANT3质粒DNA为模板,PCR扩增ANT1、ANT2、ANT3基因片段,并将其分别克隆入pCMV-HA载体中构建pCMV-HA-ANT1、pCMV-HA-ANT2、pCMV-HA-ANT3融合表达质粒。将构建好的各质粒采用脂质体法分别瞬时转染AGS细胞,Western Blot检测各重组质粒在AGS细胞内的表达,结果表明各重组蛋白均得到正确表达。6 .免疫共沉淀试验将pCMV-Myc-VacA载体分别与pCMV-HA-ANT1、pCMV-HA-ANT2、pCMV-HA-ANT3载体配比瞬时共转染AGS细胞,提取细胞总蛋白进行免疫共沉淀试验,分别用VacA抗体沉淀ANT（ANT1、ANT2、ANT3）和ANT抗体沉淀VacA,验证二者在细胞内的蛋白相互作用。结果表明VacA与ANT之间不能发生免疫共沉淀反应。
二、幽门螺杆菌VacA~+ BCS致胃上皮细胞基因表达谱的改变（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、幽门螺杆菌VacA~+ BCS致胃上皮细胞基因表达谱的改变（论文提纲范文）
（1）幽门螺杆菌与Correa’s Cascade关系及ERM家族在其中的机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 胃癌的防控具有重要意义 |
| 1.2 "Correa’s Cascade"假说指导着胃癌的防控 |
| 1.3 幽门螺杆菌是"Correa’s Cascade"假说相关胃黏膜病变的病因 |
| 1.4 ERM家族蛋白或在H.pylori感染相关胃黏膜病变中发挥作用 |
| 1.5 研究设计与意义 |
| 第2章 H.pylori与 Correa's Cascade的关系 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 筛选标准 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 研究设计 |
| 2.2.2 研究实施 |
| 2.2.3 研究变量 |
| 2.2.4 相关标准(定义、操作规范、诊断标准、数据测量及分类依据) |
| 2.2.5 研究偏倚 |
| 2.2.6 样本量估计 |
| 2.2.7 数据处理与统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 胃镜活检概况 |
| 2.3.2 受检者病理信息概况 |
| 2.3.3 Correa's Cascade假说相关胃黏膜病变总检出率 |
| 2.3.4 Correa's Cascade假说相关胃黏膜病变与年龄的关系 |
| 2.3.5 Correa's Cascade假说相关胃黏膜病变级联与序列的科学性 |
| 2.3.6 H.pylori感染状态 |
| 2.3.7 H.pylori感染与Correa's Cascade相关胃黏膜病变关系 |
| 2.3.8 H.pylori感染程度与Correa's Cascade相关胃黏膜病变程度关系 |
| 2.3.9 H.pylori感染与Correa's Cascade假说相关胃黏膜病变的演变关系 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 ERM家族在Correa's Cascade中的机制初探 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 材料来源 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 数据获取 |
| 3.2.2 差异分析 |
| 3.2.3 预后分析 |
| 3.2.4 基因功能 |
| 3.2.5 免疫浸润分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ERM家族基因在Correa's Cascade假说相关胃黏膜病变中的表达 |
| 3.3.2 ERM家族基因在胃癌组织中的表达 |
| 3.3.3 ERM家族基因在不同胃癌分期中的表达 |
| 3.3.4 ERM家族基因在不同胃癌类型(Lauren分型)中的表达 |
| 3.3.5 MSN与NF2 的表达水平对胃癌患者预后的影响 |
| 3.3.6 MSN表达水平与胃癌患者临床病理参数的关系 |
| 3.3.7 MSN在合并H.pylori感染胃癌组织中的表达 |
| 3.3.8 基于MSN表达的胃癌转录组GSEA分析 |
| 3.3.9 MSN相关免疫浸润概况 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 ERM家族蛋白moesin在胃黏膜病变中的表达及意义 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 模式菌株 |
| 4.1.2 实验细胞 |
| 4.1.3 蜡块组织 |
| 4.1.4 新鲜组织 |
| 4.1.5 主要试剂 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.1.7 溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞的复苏、培养、传代、计数及冻存 |
| 4.2.2 H.pylori的复苏、鉴定、传代及保存 |
| 4.2.3 H.pylori与各细胞系共培养 |
| 4.2.4 qRT-PCR实验检测各细胞系moesin mRNA表达 |
| 4.2.5 Western blot法检测各细胞系和新鲜组织moesin蛋白的表达 |
| 4.2.6 免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色法检测胃黏膜组织样本中moesin蛋白的表达 |
| 4.2.7 统计学方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 不同细胞中moesin m RNA的表达 |
| 4.3.2 菌株刺激细胞的适宜浓度与时间 |
| 4.3.3 不同菌株刺激后胃上皮细胞moesin蛋白的表达 |
| 4.3.4 H.pylori及 CagA对胃上皮细胞和胃癌细胞moesin表达的调控 |
| 4.3.5 Moesin蛋白在胃癌组织中的表达 |
| 4.3.6 Moesin蛋白在Correa’s Cascade假说相关胃黏膜病变中的表达 |
| 4.3.7 Moesin蛋白在合并H.pylori感染胃黏膜病变中的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 胃黏膜癌前变化与胃癌预防研究现状 |
| 参考文献 |
（2）PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 H.pylori主要的致癌因子 |
| 1.3 H.pylori感染胃黏膜改变的关键分子PMEPA1 |
| 第2章 PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及其生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床组织标本及资料收集 |
| 2.1.2 生物信息学数据库 |
| 2.1.3 主要试剂耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学数据挖掘 |
| 2.2.2 组织蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 2.2.3 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PMEPA1在胃癌组织中显着高表达 |
| 2.3.2 PMEPA1与胃癌患者预后的关系 |
| 2.3.3 PMEPA1诊断胃癌的临床价值 |
| 2.3.4 生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 H.pylori感染及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 临床组织标本收集 |
| 3.1.2 细胞系及实验菌株 |
| 3.1.3 质粒及感受态细胞 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.1.6 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 幽门螺杆菌的复苏、鉴定、传代 |
| 3.2.2 H.pylori7.13和PMSS1 oipA基因敲除菌株的构建 |
| 3.2.3 制备抗oipA重组抗原的免疫兔多克隆抗体 |
| 3.2.4 细胞培养及细菌细胞共培养模型的构建 |
| 3.2.5 蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 3.2.6 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 3.2.7 石蜡切片及免疫组织化学 |
| 3.2.8 细胞转录组学 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Hp7.13和PMSS1 菌株的oipA基因敲除菌株的构建及鉴定 |
| 3.3.2 H.pylori感染上调胃上皮细胞中PMEPA1的表达水平 |
| 3.3.3 H.pylori cag A和 oipA影响胃上皮细胞PMEPA1的表达 |
| 3.3.4 PMEPA1在不同胃黏膜病变阶段的表达及与H.pylori感染的关系 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 慢病毒稳转细胞株的构建 |
| 4.2.2 CCK8 细胞增殖实验 |
| 4.2.3 实时无标记细胞增殖实验 |
| 4.2.4 Transwell细胞迁移和侵袭实验 |
| 4.2.5 划痕修复实验 |
| 4.2.6 克隆形成实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 成功构建PMEPA1过表达和敲减稳转细胞株 |
| 4.3.2 PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.3.3 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞的生物学行为的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 PMEPA1在H.pylori感染胃上皮细胞改变的转录组学研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞转录组测序流程 |
| 5.2.2 转录组测序数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 测序样品的RNA验证 |
| 5.3.2 PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响 |
| 5.3.3 Hp感染对过表达或敲减PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.3.4 PMEPA1对不同Hp菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 小结和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述一 PMEPA1在肿瘤中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 幽门螺杆菌外膜蛋白致病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）武威队列幽门螺杆菌感染流行病学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 武威队列幽门螺杆菌感染及相关因素分析 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 幽门螺杆菌的基本生物学特性 |
| 1.2 螺旋菌及幽门螺杆菌的研究历史 |
| 1.3 Hp的感染与致病性 |
| 1.3.1 Hp的流行病学 |
| 1.3.2 Hp在人群中的感染状况 |
| 1.3.3 Hp感染的风险因素 |
| 1.3.4 Hp感染与胃肠外疾病 |
| 1.3.5 Hp的致病性 |
| 1.4 Hp的诊断 |
| 1.5 Hp感染的防治 |
| 1.6 本项目研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 筛查人群选择 |
| 2.1.2 参加者的权益保护 |
| 2.1.3 人群排除标准 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 问卷调查 |
| 2.2.2 ~(14)C-UBT检测方法 |
| 2.2.3 胃镜检查 |
| 2.2.4 组织病理学检查 |
| 2.3 变量定义 |
| 2.4 统计学方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 武威队列Hp流行病学研究人群构成情况 |
| 3.2 武威队列人群Hp感染状况 |
| 3.3 武威队列人群不同人口经济学因素与Hp感染 |
| 3.4 武威队列人群生活方式暴露因素与Hp感染 |
| 3.5 武威队列人群Hp感染风险因素的单因素分析 |
| 3.6 武威队列人群Hp感染风险因素的多因素分析 |
| 3.7 武威队列不同胃疾病及胃癌前病变间Hp感染的关系 |
| 3.8 武威队列Hp感染与既往消化性溃疡及家族消化道肿瘤病史的关系 |
| 3.9 武威队列人群Hp感染与胃外疾病的关系 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第二部分 武威队列Hp主要毒力蛋白血清抗体、血清学分型与胃疾病、胃癌前病变的相关性研究 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 Hp的重要毒力及耐药因子 |
| 1.1.1 细胞毒素相关基因A蛋白 |
| 1.1.2 空泡细胞毒素A |
| 1.1.3 尿素酶 |
| 1.1.4 热休克蛋白60 |
| 1.1.5 硝基还原酶 |
| 1.2 本项目研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 研究人群 |
| 2.2 参加者的权益保护 |
| 2.3 主要的仪器设备和试剂耗材 |
| 2.4 研究方法 |
| 2.4.1 问卷调查 |
| 2.4.2 血标本收集和保存 |
| 2.4.3 ~(14)C-UBT检测 |
| 2.4.4 胃镜检查 |
| 2.4.5 组织病理学检查 |
| 2.4.6 免疫斑点检测法 |
| 2.4.7 统计学方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 Hp感染者Ure、CagA、VacA、Hsp60及RdxA血清抗体检测结果与Hp感染分型 |
| 3.2 Hp感染者血清CagA、VacA、Hsp60及RdxA抗体结果及不同血清分型与人口及社会因素比较 |
| 3.3 不同胃疾病Hp感染分型及血清CagA、VacA、Hsp60及RdxA抗体在结果比较 |
| 3.3.1 1154例Hp感染者胃镜检查结果 |
| 3.3.2 不同胃疾病中Ⅰ型、Ⅱ型Hp感染状况分析 |
| 3.3.3 不同胃疾病中血清Hp CagA、VacA、Hsp60及RdxA抗体结果分析 |
| 3.3.4 武威队列Hp感染分型及血清CagA、VacA、Hsp60及RdxA抗体对不同胃疾病的风险评估 |
| 3.4 武威队列胃癌及胃癌前病Hp感染分型及血清CagA、VacA、Hsp60、RdxA抗体结果分析 |
| 3.4.1 Hp感染分型及血清CagA、VacA、Hsp60及RdxA抗体阳性间胃癌及胃癌前病病理检查结果 |
| 3.4.2 胃癌及癌前病变Hp感染分型及血清CagA、VacA、Hsp60、RdxA抗体结果 |
| 3.4.3 Hp感染分型及血清CagA、VacA、Hsp60及RdxA抗体检测结果与胃癌前病变的风险评估 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第三部分 全文总结与展望 |
| 3.1 全文总结 |
| 3.2 本研究的优势 |
| 3.3 本研究的局限和展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）幽门螺杆菌感染与儿童再发性腹痛的临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文词汇对照表 |
| 引言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 幽门螺杆菌毒力基因与致病性研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（5）间质干细胞受幽门螺杆菌影响对胃上皮细胞作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 幽门螺杆菌感染与胃癌 |
| 1.1 幽门螺杆菌生物学性状 |
| 1.2 幽门螺杆菌的致病机制 |
| 1.2.1 幽门螺杆菌的鞭毛 |
| 1.2.2 幽门螺杆菌的毒力因子 |
| 1.2.3 幽门螺杆菌的毒素 |
| 1.2.4 幽门螺杆菌主要致病性酶和代谢产物 |
| 1.3 幽门螺杆菌所致的炎症反应与胃癌 |
| 1.4 幽门螺杆菌与NF-κB信号通路 |
| 2 MSCs与炎症微环境 |
| 2.1 MSCs的生物学特性 |
| 2.2 MSCs炎症趋化性并参与炎症微环境的形成 |
| 2.3 MSCs与癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs) |
| 2.3.1 癌相关成纤维细胞 |
| 2.3.2 癌相关成纤维细胞与MSCs |
| 3 CAFs与肿瘤发生 |
| 4 上皮间质化与肿瘤 |
| 4.1 EMT概念 |
| 4.2 EMT发生机制简述 |
| 4.3 EMT与肿瘤 |
| 4.4 EMT与肿瘤侵袭转移 |
| 4.5 EMT与肿瘤干细胞 |
| 5 本论文研究目的、方法、技术路线及意义 |
| 5.1 研究目的 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.3 技术路线 |
| 5.4 研究意义 |
| 第二章 幽门螺杆菌对人脐带间质干细胞的作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备及相关耗材 |
| 2.1.3 幽门螺杆菌 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 幽门螺杆菌的复苏培养、鉴定与冻存 |
| 2.2.1.1 培养基配制 |
| 2.2.1.2 冻存液的配制 |
| 2.2.1.3 幽门螺杆菌的复苏培养 |
| 2.2.1.4 幽门螺杆菌的鉴定 |
| 2.2.1.5 幽门螺杆菌的冻存 |
| 2.2.1.6 不同浓度菌液的配制 |
| 2.2.2 hucMSCs的分离培养、扩增及准备 |
| 2.2.2.1 hucMSCs的分离培养与扩增 |
| 2.2.2.2 hucMSCs细胞的准备 |
| 2.2.3 H.pylori与hucMSCs细胞共培养 |
| 2.2.4 总RNA提取、逆转录和定量RT.PCR |
| 2.2.4.1 总RNA提取 |
| 2.2.4.2 逆转录 |
| 2.2.4.3 实时定量PCR |
| 2.2.5 Western blot |
| 2.2.6 Transwell迁移试验检测H.pylori对hucMSCs细胞的募集 |
| 2.2.7 手工计数法测定H.pylori刺激培养的hucMSCs对SGC7901细胞增殖的影响 |
| 2.2.8 Transwell迁移实验检测H.pylori刺激培养的hucMSCs对胃癌细胞SGC-7901的迁移作用 |
| 2.2.9 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 H.pylori鉴定结果 |
| 2.3.2 H.pylori与hucMSCs以不同感染指数培养不同时间后hucMSCs的形态变化 |
| 2.3.3 H.pylori体外诱导hucMSCs向CAFs样细胞转化 |
| 2.3.4 H.pylori体外促进hucMSCs的迁移 |
| 2.3.5 H.pylori刺激培养hucMSCs的上清对SGC-7901细胞生长无促进作用 |
| 2.3.6 H.pylori刺激培养hucMSCs的上清对SGC7901细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 2.3.7 H.pylori刺激培养的hucMSCs上清促进胃癌细胞要SGC-7901的迁移 |
| 2.3.8 H.pylori刺激培养hucMSCs的上清体外诱导SGC7901细胞EMT样分化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 CAFs样转化的MSCs对正常胃上皮细胞的作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂或材料 |
| 3.1.2 主要仪器设备及相关耗材 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 GES-1细胞及hucMSCs的培养 |
| 3.2.1.1 GES-1细胞的培养 |
| 3.2.1.2 hucMSCs的培养 |
| 3.2.2 H.pylori刺激培养hucMSCs细胞的条件及培养基(CM)的制备 |
| 3.2.3 用H.pylori刺激培养的hucMSCs上清对GES-1胃上皮细胞培养 |
| 3.2.4 RNA的提取及逆转录 |
| 3.2.5 实时定量PCR |
| 3.2.6 Western blot检测相关蛋白的表达 |
| 3.2.7 MTT细胞增殖试验及手工计数法测定细胞生长曲线 |
| 3.2.8 Transwell法检测H.pylori刺激培养的hucMSCs对胃上皮细胞的迁移作用 |
| 3.2.9 平板克隆试验 |
| 3.2.10 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.2.11 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 H.pylori刺激培养的hucMSCs上清促使胃上皮细胞GES-1形态变化 |
| 3.3.2 H.pylori刺激培养的hucMSCs上清诱导胃上皮细胞发生EMT |
| 3.3.3 H.pylori刺激培养的hucMSCs促进胃上皮细胞GES-1的迁移 |
| 3.3.4 H.pylori刺激培养的hucMSCs上清对胃上皮细胞增殖及凋亡的影响 |
| 3.3.5 H.pylori刺激培养的hucMSCs对胃上皮细胞干性和癌基因及抑癌基因的影响 |
| 3.3.6 H.pylori刺激培养的hucMSCs上清促进胃上皮细胞GES-1克隆形成 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 H.pylori促进hucMSCs CAFs样转化过程细胞因子的分泌 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂和材料 |
| 4.1.2 主要仪器设备及相关耗材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫磁珠流式细胞仪液相芯片技术(Luminex flow cytometry,Luminex)筛检H.pylori刺激培养MSCs上清中相关因子分泌 |
| 4.2.2 IL-6、IL-8及PDGF-DD等的ELISA检测 |
| 4.2.3 RNA的提取及逆转录 |
| 4.2.4 荧光实时定量PCR |
| 4.2.5 Western blot检测IL-6刺激培养GES-1细胞后EMT相关基因的蛋白表达 |
| 4.2.6 Transwell法检测IL-6对正常胃上皮细胞的迁移作用 |
| 4.2.7 平板克隆试验 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 H.pylori刺激培养的hucMSCs上清中细胞因子的液体芯片筛检结果 |
| 4.3.2 ELISA法对上一步筛选出的部分因子做进一步验证 |
| 4.3.3 体外IL-6诱导胃上皮细胞GES-1发生EMT |
| 4.3.4 体外IL-6促进胃上皮细胞GES-1的迁移 |
| 4.3.5 体外IL-6促进胃上皮细胞GES-1增殖或克隆形成 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 NF-κB参与MSCs在H.pylori感染过程中对胃上皮细胞的作用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器设备及相关耗材 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 PDTC的配制 |
| 5.2.2 PDTC对H.pylori刺激培养hucMSCs的NF-κB抑制实验 |
| 5.2.3 PDTC抑制前后H.pylori刺激培养的hucMSCs上清对GES-1胃上皮细胞培养 |
| 5.2.4 总蛋白提取 |
| 5.2.5 胞质蛋白提取 |
| 5.2.6 核蛋白提取 |
| 5.2.7 总RNA提取 |
| 5.2.8 实时荧光定量RT-PCR |
| 5.2.9 Western blot |
| 5.2.10 Transwell法检测NF-κB特异性抑制剂PDTC预处理后H.pylori刺激培养的hucMSCs对GES-1细胞的迁移实验 |
| 5.2.11 平板克隆试验 |
| 5.2.12 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 H.pylori促使hucMSCs细胞NF-κB活化(核转位) |
| 5.3.2 PDTC抑制H.pylori体外诱导hucMSCs向CAFs样细胞分化 |
| 5.3.3 H.pylori诱导hucMSCs细胞因子的分泌部分依赖NF-κB活化 |
| 5.3.4 PDTC可部分逆转H.pylori刺激培养的hucMSCs上清对GES-1细胞EMT |
| 5.3.5 PDTC预处理后H.pylori刺激培养的hucMSCs上清减弱GES-1细胞迁移能力 |
| 5.3.6 PDTC预处理后H pylori刺激培养的hucMSCs上清降低GES-1细胞的克隆形成 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的论文 |
（6）幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 幽门螺杆菌疫苗的研究进展 |
| 1 幽门螺杆菌的病理损伤机制 |
| 1.1 幽门螺杆菌的生物学特性 |
| 1.2 幽门螺杆菌的感染途径 |
| 1.3 幽门螺杆菌的毒力基因 |
| 1.3.1 幽门螺杆菌尿素酶(urease) |
| 1.3.2 细胞毒素相关抗原(CagA) |
| 1.3.3 空泡毒素基因(VacA) |
| 1.3.4 iceA基因 |
| 2 幽门螺杆菌的治疗 |
| 2.1 幽门螺杆菌的化学药物治疗 |
| 2.2 免疫抗体治疗幽门螺杆菌 |
| 2.3 影响幽门螺杆菌治疗的因素 |
| 3 幽门螺杆菌感染动物模型 |
| 3.1 H. pylori类似菌的自然感染情况 |
| 3.2 H. pylori感染的动物模型 |
| 3.3 动物模型的应用 |
| 3.3.1 动物模型在抗H. pylori治疗方法和疗效研究进展 |
| 3.3.2 动物模型在研究H. pylori致病机理方面的应用 |
| 3.3.3 动物模型在研究H. pylori疫苗中的应用 |
| 4 幽门螺杆菌疫苗免疫机制及其研究进展 |
| 4.1 幽门螺杆菌自然感染的免疫反应 |
| 4.2 幽门螺杆菌疫苗类型的研究进展 |
| 4.2.1 全菌蛋白疫苗 |
| 4.2.2 基因工程疫苗 |
| 4.2.3 载体疫苗 |
| 4.3 国内外幽门螺杆菌疫苗研究的现状 |
| 5 研究目的和意义 |
| 5.1 本研究的目的 |
| 5.2 本研究的意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验研究一 幽门螺杆菌全菌蛋白疫苗免疫奶牛 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗准备 |
| 1.2.2 免疫、采样 |
| 1.2.3 血清/乳汁中IgG检测 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 奶牛的血清中和牛奶中幽门螺杆菌抗体的动态变化规律 |
| 3.2 免疫后奶牛身体状况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 疫苗的免疫途径 |
| 4.2 免疫乳的应用 |
| 实验研究二 幽门螺杆菌UreB/CagA双价口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的构建 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 幽门螺杆菌的培养 |
| 1.2.2 感受态细菌的制备 |
| 1.2.3 引物设计及PCR反应体系 |
| 1.2.4 目的基因CagA和UreB分别与T载体(pMD-18T)的连接、转化 |
| 1.2.5 转化的质粒提取鉴定 |
| 1.2.6 pYA3493质粒提取,酶切 |
| 1.2.7 表达Hp-UreB和Hp-CagA的重组减毒猪霍乱沙门菌疫苗的建立 |
| 1.2.8 重组蛋白的表达及鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Hp-UreB和Hp-CagA基因片段的扩增 |
| 2.2 酶切鉴定和和PCR鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达及鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 基因的选择 |
| 3.2 口服疫苗载体的选择 |
| 实验研究三 幽门螺杆菌CagA/UreB沙门氏菌活载体疫苗免疫小鼠的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 菌株 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 各种培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗准备 |
| 1.2.2 免疫、采样 |
| 1.2.3 幽门螺杆菌特异抗体IgG检测(ELISA) |
| 1.2.4 组织切片和免疫组化 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 血清中抗体分析 |
| 3.2 组织切片和免疫组化 |
| 3.3 不同组织中幽门螺杆菌SS1菌落数 |
| 4 讨论 |
| 实验四 幽门螺杆菌CagA/UreB真核荧光载体的构建及胃黏膜上皮细胞GES-1转染的研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 各种培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 幽门螺杆菌的培养 |
| 1.2.2 引物设计及PCR反应体系 |
| 1.2.3 目的基因CagA和UreB分别与T载体(pMD-18T)的连接、转化 |
| 1.2.4 转化的质粒提取鉴定 |
| 1.2.5 质粒pEGFP-N1提取、酶切 |
| 1.2.6 表达Hp-UreB和Hp-CagA的重组质粒的构建 |
| 1.2.7 质粒大量提取 |
| 1.2.8 提纯质粒转染GES-1细胞 |
| 1.2.9 细胞凋亡的检测 |
| 1.2.10 电镜观察 |
| 2 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Hp-UreB和Hp-CagA基因片段的扩增 |
| 3.2 UreB与pEGFP-N1连接以及酶切结果 |
| 3.3 细胞转染 |
| 3.4 细胞凋亡的检测 |
| 3.5 透射电镜观察 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 参考文献 |
| 第四部分 全文结论和创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录Ⅰ 在读期间发表的学术论文 |
| 附录II 参加的学术活动 |
| 致谢 |
（7）幽门螺杆菌CagM、CagI蛋白的生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 幽门螺杆菌感染现状 |
| 1.1.2 幽门螺杆菌cag致病岛 |
| 1.1.3 幽门螺杆菌的致病因子 |
| 1.1.4 幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system,T4SS) |
| 1.1.5 Ⅳ型分泌系统伴侣蛋白(Type Ⅳ secretion system chaperone) |
| 1.2 本研究的目的、内容及技术路线 |
| 1.2.1 研究目的 |
| 1.2.2 研究内容及方案 |
| 1.2.3 技术路线 |
| 第二章 幽门螺杆菌cagM、cagI基因的克隆与测序 |
| 前言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 H.pylori培养与鉴定 |
| 2.2.2 H.pylori基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 PCR引物的设计 |
| 2.2.4 PCR扩增H.pylori的cagM、cagI基因 |
| 2.2.5 目的DNA片段的回收 |
| 2.2.6 制备感受态细胞 |
| 2.2.7 载体和目的片段的连接 |
| 2.2.8 转化与筛选 |
| 2.2.9 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.10 H.pylori NCTC11637 cagM、cagI基因序列的检测 |
| 2.2.11 H.pylori NCTC11637 cagM、cagI基因序列提交NCBI核酸数据库GenBank |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 H.pylori的分离培养与鉴定 |
| 2.3.2 PCR法扩增H.pylori cagM、cagI基因片段 |
| 2.3.3 T-A克隆与鉴定 |
| 2.3.4 H.pylori NCTC11637菌株cagM、cagI基因的测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 CagM、CagI蛋白的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要软件 |
| 3.1.2 主要网站 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 序列组成和基本性质分析 |
| 3.2.2 同源性分析 |
| 3.2.3 跨膜区预测分析 |
| 3.2.4 信号肽和剪切位点预测分析 |
| 3.2.5 二级结构预测分析 |
| 3.2.6 三级结构预测分析 |
| 3.2.7 功能位点分析 |
| 3.2.8 卷曲螺旋的预测分析 |
| 3.2.9 细胞定位的预测分析 |
| 3.2.10 蛋白家族保守区域分析 |
| 3.2.11 蛋白质指纹图谱分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 序列组成和基本性质分析 |
| 3.3.2 同源性分析 |
| 3.3.3 跨膜区预测 |
| 3.3.4 信号肽和剪切位点预测 |
| 3.3.5 二级结构预测分析 |
| 3.3.6 三级结构预测分析 |
| 3.3.7 功能位点分析 |
| 3.3.8 卷曲螺旋的预测分析 |
| 3.3.9 细胞定位的预测分析 |
| 3.3.10 蛋白家族保守区域分析 |
| 3.3.11 蛋白指纹图谱分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 基本性质 |
| 3.4.2 同源性 |
| 3.4.3 结构预测 |
| 3.4.4 功能分析 |
| 第四章 结论和展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 读博期间发表的论文和参加的课题 |
（8）幽门螺杆菌相关胃癌基因差异表达谱的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩略词简表 |
| 技术路线 |
| 第一章 Hp菌株感染对人胃黏膜细胞系增殖及凋亡的影响研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 幽门螺杆菌对人胃黏膜细胞系GES-1细胞基因表达谱的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 TRAF1、HDAC6在伴Hp感染的胃癌组织中的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 参考文献 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（9）幽门螺杆菌iceA基因相关的致病机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 技术路线 |
| 第一部分 幽门螺杆菌iceA基因克隆及序列分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 幽门螺杆菌iceA基因突变株的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 iceA基因的功能及特性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 iceA基因炎症相关因素分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 幽门螺杆菌重要毒力因子的致病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果 |
（10）幽门螺杆菌空泡毒素与线粒体腺嘌呤核苷酸转移酶相互作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第一章 幽门螺杆菌及其空泡毒素研究进展 |
| 1.1 幽门螺杆菌 |
| 1.1.1 幽门螺杆菌概述 |
| 1.1.2 幽门螺杆菌流行病学 |
| 1.1.3 幽门螺杆菌毒力因素 |
| 1.1.4 幽门螺杆菌致病机制 |
| 1.1.5 幽门螺杆菌的防治 |
| 1.2 幽门螺杆菌空泡毒素 |
| 1.2.1 vacA 的基因型及其分布 |
| 1.2.2 VacA 蛋白 |
| 1.2.3 VacA 毒理作用 |
| 第二章 线粒体通透性转换孔与腺嘌呤核苷酸转移酶的研究进展 |
| 2.1 线粒体通透性转换孔 |
| 2.1.1 线粒体对细胞凋亡的调控 |
| 2.1.2 线粒体通透性转换孔与凋亡 |
| 2.2 腺嘌呤核苷酸转移酶 |
| 2.2.1 腺嘌呤核苷酸转移酶结构 |
| 2.2.2 腺嘌呤核苷酸转移酶异构体及其组织分布 |
| 2.2.3 腺嘌呤核苷酸转移酶的生理功能 |
| 试验研究 |
| 第三章 幽门螺杆菌空泡毒素酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Hp NCTC 11637 VacA 基因PCR 结果 |
| 3.2.2 重组质粒pGBKT7-VacA 酶切鉴定 |
| 3.2.3 重组质粒pGBKT7-VacA 测序鉴定 |
| 3.2.4 酵母诱饵质粒鉴定 |
| 3.2.5 Western-Blot 检测重组诱饵蛋白活性 |
| 3.2.6 重组诱饵蛋白的毒性检测 |
| 3.2.7 重组诱饵蛋白渗漏和自激活活性检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 腺嘌呤核苷酸转移酶各异构体酵母双杂交猎物质粒的构建及鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 提取的AGS 细胞总RNA 质量 |
| 4.2.2 腺嘌呤核苷酸转移酶各异构体基因的PCR 结果 |
| 4.2.3 腺嘌呤核苷酸转移酶各异构体重组质粒的酶切鉴定 |
| 4.2.4 腺嘌呤核苷酸转移酶各异构体重组质粒的序列测定 |
| 4.2.5 腺嘌呤核苷酸转移酶各异构体重组质粒酵母转化子的鉴定 |
| 4.2.6 Western-Blot 检测腺嘌呤核苷酸转移酶各异构体重组蛋白 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 酵母双杂交系统验证幽门螺杆菌空泡毒素与线粒体腺嘌呤核苷酸转移酶的相互作用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 酵母菌株基因表型的鉴定 |
| 5.2.2 酵母双杂交试验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 幽门螺杆菌空泡毒素免疫共沉淀质粒的构建、表达及鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 pCMV-Myc-VacA 的构建 |
| 6.2.2 Western-Blot 检测重组pCMV-Myc-VacA 蛋白的活性 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 腺嘌呤核苷酸转移酶各异构体免疫共沉淀质粒的构建、表达及鉴定 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 pCMV-HA-ANT 的构建 |
| 7.2.2 Western-Blot 检测重组pCMV-HA-ANT 蛋白的活性 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 免疫共沉淀探索幽门螺杆菌空泡毒素与线粒体腺嘌呤核苷酸转移酶的相互作用 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 线粒体的功能地位 |
| 8.3.2 线粒体内外膜的结构特点 |
| 8.3.3 VacA 与线粒体凋亡 |
| 8.3.4 VacA 与 ANT 的蛋白相互关系 |
| 8.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究的创新点和尚需进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 英文缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、幽门螺杆菌VacA~+ BCS致胃上皮细胞基因表达谱的改变（论文参考文献）
- [1]幽门螺杆菌与Correa’s Cascade关系及ERM家族在其中的机制探究[D]. 宋聪华. 南昌大学, 2021(01)
- [2]PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究[D]. 赵巧云. 南昌大学, 2021(01)
- [3]武威队列幽门螺杆菌感染流行病学研究[D]. 张富花. 兰州大学, 2020(04)
- [4]幽门螺杆菌感染与儿童再发性腹痛的临床研究[D]. 师梦. 滨州医学院, 2019(02)
- [5]间质干细胞受幽门螺杆菌影响对胃上皮细胞作用及机制[D]. 张强. 江苏大学, 2013(08)
- [6]幽门螺杆菌CagA/UreB口服减毒沙门氏菌活载体疫苗的研究[D]. 陈建国. 华中农业大学, 2013(10)
- [7]幽门螺杆菌CagM、CagI蛋白的生物信息学分析[D]. 谢立苹. 江苏大学, 2012(09)
- [8]幽门螺杆菌相关胃癌基因差异表达谱的研究[D]. 王芬. 中南大学, 2011(12)
- [9]幽门螺杆菌iceA基因相关的致病机制[D]. 马一君. 郑州大学, 2010(01)
- [10]幽门螺杆菌空泡毒素与线粒体腺嘌呤核苷酸转移酶相互作用的研究[D]. 黄增荣. 西北农林科技大学, 2010(10)