本文主要研究内容
作者范金凤（2019）在《适于棘尾虫（Stylonychia）基因功能研究的CRISPR技术研究》一文中研究指出：在棘尾虫属中以模式物种浮萍棘尾虫(Stylonychia lemnae)研究得最为深入。浮萍棘尾虫是研究细胞和分子生物学机制的重要生物,已经完成大核基因组测定,这使得棘尾虫属的基因功能研究成为可能。基因敲除是目前研究基因功能最为有效的手段。但在原生动物尤其是棘尾虫属的基因组上进行高效、精确的基因敲除来验证基因功能的研究缺乏参考资料。CRISPR/Cas9系统是近年来发展最快速的基因组编辑技术,它能够实现基因的定点编辑,因其更具高效性和灵活性而广受研究者青睐。创建适合棘尾虫的CRISPR/Cas9系统能够有效推动棘尾虫基因功能的研究。本研究从探讨棘尾虫密码子的偏好性入手,在棘尾虫中创建CRISPR/Cas9基因编辑系统,针对对棘尾虫AdSS基因的功能开展实验,以建立适合棘尾虫基因功能研究的CRISPR技术平台。主要结果如下:通过对棘尾虫第3位密码子的GC含量计算,发现第3位密码子富含A和U。通过对浮萍棘尾虫基因组进行PR2-plot绘图分析,发现第3位碱基T的使用频率高于A,C的使用频率高于G。结合中性绘图分析、ENC-plot绘图分析、PCA分析,发现浮萍棘尾虫基因组密码子偏好性受突变和自然选择的影响比较大,但与此同时也受到其他因素的影响,密码子偏好性是多因素影响的结果。最终通过高表达优越密码子方法确定AGA、GGA、UUA等24个密码子为最优密码子。通过PCR扩增方法在棘尾虫中克隆到一个注释为腺苷酸基琥拍酸合成酶的基因AdSS,通过核酸和蛋白序列比对,发现浮萍棘尾虫AdSS基因与第四双小核草履虫、多子小瓜虫和嗜热四膜虫高度同源。通过同时双酶切cDNA和pEGFP-N1载体的方法构建定位AdSS基因的载体,验证该基因主要位于细胞质的核糖体中。根据棘尾虫密码子偏好性分析得到的最优密码子改造载体中的Cas9蛋白,筛选出成功突变的质粒进行转染,与此同时对浮萍棘尾虫中的AdSS基因设计多个sgRNA打靶位点,成功获得1个sgRNA作用于目的基因,并产生大片段缺失。AdSS基因被敲除后,虫体的运动性明显降低,生长发育也受到影响,少量虫体产生畸形。为了检测敲除效率,利用实时荧光定量PCR技术完成对突变体的检测,证明该CRISPR/Cas9系统能够在棘尾虫中实现目标基因的编辑。综上所述,本研究筛选并验证棘尾虫的最优密码子,对敲除载体进行了优化,成功利用CRISPR/Cas9系统实现了对棘尾虫AdSS基因的特异敲除,证明该系统可有效应用于棘尾虫的基因组编辑,获得的具有稳定突变的细胞克隆和构建的CRISPR打靶载体为后续棘尾虫基因功能的研究奠定了坚实的基础。
Abstract
zai ji wei chong shu zhong yi mo shi wu chong fu ping ji wei chong (Stylonychia lemnae)yan jiu de zui wei shen ru 。fu ping ji wei chong shi yan jiu xi bao he fen zi sheng wu xue ji zhi de chong yao sheng wu ,yi jing wan cheng da he ji yin zu ce ding ,zhe shi de ji wei chong shu de ji yin gong neng yan jiu cheng wei ke neng 。ji yin qiao chu shi mu qian yan jiu ji yin gong neng zui wei you xiao de shou duan 。dan zai yuan sheng dong wu you ji shi ji wei chong shu de ji yin zu shang jin hang gao xiao 、jing que de ji yin qiao chu lai yan zheng ji yin gong neng de yan jiu que fa can kao zi liao 。CRISPR/Cas9ji tong shi jin nian lai fa zhan zui kuai su de ji yin zu bian ji ji shu ,ta neng gou shi xian ji yin de ding dian bian ji ,yin ji geng ju gao xiao xing he ling huo xing er an shou yan jiu zhe qing lai 。chuang jian kuo ge ji wei chong de CRISPR/Cas9ji tong neng gou you xiao tui dong ji wei chong ji yin gong neng de yan jiu 。ben yan jiu cong tan tao ji wei chong mi ma zi de pian hao xing ru shou ,zai ji wei chong zhong chuang jian CRISPR/Cas9ji yin bian ji ji tong ,zhen dui dui ji wei chong AdSSji yin de gong neng kai zhan shi yan ,yi jian li kuo ge ji wei chong ji yin gong neng yan jiu de CRISPRji shu ping tai 。zhu yao jie guo ru xia :tong guo dui ji wei chong di 3wei mi ma zi de GChan liang ji suan ,fa xian di 3wei mi ma zi fu han Ahe U。tong guo dui fu ping ji wei chong ji yin zu jin hang PR2-plothui tu fen xi ,fa xian di 3wei jian ji Tde shi yong pin lv gao yu A,Cde shi yong pin lv gao yu G。jie ge zhong xing hui tu fen xi 、ENC-plothui tu fen xi 、PCAfen xi ,fa xian fu ping ji wei chong ji yin zu mi ma zi pian hao xing shou tu bian he zi ran shua ze de ying xiang bi jiao da ,dan yu ci tong shi ye shou dao ji ta yin su de ying xiang ,mi ma zi pian hao xing shi duo yin su ying xiang de jie guo 。zui zhong tong guo gao biao da you yue mi ma zi fang fa que ding AGA、GGA、UUAdeng 24ge mi ma zi wei zui you mi ma zi 。tong guo PCRkuo zeng fang fa zai ji wei chong zhong ke long dao yi ge zhu shi wei xian gan suan ji hu pai suan ge cheng mei de ji yin AdSS,tong guo he suan he dan bai xu lie bi dui ,fa xian fu ping ji wei chong AdSSji yin yu di si shuang xiao he cao lv chong 、duo zi xiao gua chong he shi re si mo chong gao du tong yuan 。tong guo tong shi shuang mei qie cDNAhe pEGFP-N1zai ti de fang fa gou jian ding wei AdSSji yin de zai ti ,yan zheng gai ji yin zhu yao wei yu xi bao zhi de he tang ti zhong 。gen ju ji wei chong mi ma zi pian hao xing fen xi de dao de zui you mi ma zi gai zao zai ti zhong de Cas9dan bai ,shai shua chu cheng gong tu bian de zhi li jin hang zhuai ran ,yu ci tong shi dui fu ping ji wei chong zhong de AdSSji yin she ji duo ge sgRNAda ba wei dian ,cheng gong huo de 1ge sgRNAzuo yong yu mu de ji yin ,bing chan sheng da pian duan que shi 。AdSSji yin bei qiao chu hou ,chong ti de yun dong xing ming xian jiang di ,sheng chang fa yo ye shou dao ying xiang ,shao liang chong ti chan sheng ji xing 。wei le jian ce qiao chu xiao lv ,li yong shi shi ying guang ding liang PCRji shu wan cheng dui tu bian ti de jian ce ,zheng ming gai CRISPR/Cas9ji tong neng gou zai ji wei chong zhong shi xian mu biao ji yin de bian ji 。zeng shang suo shu ,ben yan jiu shai shua bing yan zheng ji wei chong de zui you mi ma zi ,dui qiao chu zai ti jin hang le you hua ,cheng gong li yong CRISPR/Cas9ji tong shi xian le dui ji wei chong AdSSji yin de te yi qiao chu ,zheng ming gai ji tong ke you xiao ying yong yu ji wei chong de ji yin zu bian ji ,huo de de ju you wen ding tu bian de xi bao ke long he gou jian de CRISPRda ba zai ti wei hou xu ji wei chong ji yin gong neng de yan jiu dian ding le jian shi de ji chu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自哈尔滨师范大学的范金凤，发表于刊物哈尔滨师范大学2019-07-01论文，是一篇关于棘尾虫论文,密码子偏好性论文,基因论文,实时荧光定量论文,哈尔滨师范大学2019-07-01论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自哈尔滨师范大学2019-07-01论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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