黄色粘球菌论文-卓丽

导读:本文包含了黄色粘球菌论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:分子伴侣GroEL,基因重复,协同调控,粘细菌

黄色粘球菌论文文献综述

卓丽^[1]（2019）在《黄色粘球菌中双拷贝groEL基因的功能与表达的协同调控机制》一文中研究指出基因重复(gene duplication)是分子进化过程中产生新遗传物质的主要机制,能够为新功能基因的产生提供基本的物质和原材料基础,是一种重要的进化模式。基因重复事件可以增加基因组中基因的拷贝数,为基因提供发展出新功能的潜力,从而帮助物种在长期进化中适应不同的生态和环境变化。GroEL属于分子伴侣(molecular chaperone)中的伴侣素蛋白(chaperonin)家族,其作用广泛,通常在胞内帮助许多不同种类的蛋白进行折迭、成熟和转运,对于一些关键的生命过程是必不可少的。GroEL在发挥作用时通常需要辅伴侣蛋白GroES的协助,且二者都是热激蛋白,能够在高温胁迫条件下过量表达,更好地帮助细胞复性错误折迭的蛋白。在原核生物中,groEL重复现象广泛存在,然而目前相关研究主要针对单拷贝groEL的结构和功能等,对于多拷贝groELs的功能分化及调控机制等仍知之甚少。粘细菌(Myxobacteria)是一类革兰氏阴性细菌,具有复杂的多细胞群体行为特性、丰富的次级代谢产物合成能力以及广泛的环境适应性,被认为是研究细菌细胞识别与互作、细胞通讯、多细胞形态发生以及生命进化的重要模式生物材料。与其复杂的生活史特性相适应的是,粘细菌具有庞大的基因组和大量的重复基因,因此,对粘细菌重复基因的研究,有助于进一步了解功能分化的进化意义,阐明重复基因功能和表达所存在的关系,解析表达调控的分子机制,为人工定向改造基因、人为缩小基因组以降低宿主代谢负担以及多细胞群体行为的研究提供理论基础。本实验室前期在粘细菌模式菌株——黄色粘球菌DK1622中,探究了双拷贝groELs的细胞生理功能、功能分化及其分子机制。在核苷酸和氨基酸序列组成上,这两个groEL分别有83%和79%的同源性,但却在细胞生理功能上存在明显的功能分化:groEL1与菌株的发育有关,而groEL2对于细胞捕食和次级代谢产物myxovirescin的形成是必不可少的。对GroEL1和GroEL2的结构域置换结果证明,GroEL分子顶端结构域和C端赤道结构域的差异是决定两个分子底物选择性差异的主要原因。进一步的位点突变结果显示,GroEL1分子C-末端的6个GGM重复序列是GroEL1行使功能的必要片段。本文以黄色粘球菌DK1622为基本材料,在已有groELs相关的研究基础上,进一步研究了双拷贝groELs及单拷贝groES在功能和表达上的协同关系,揭示了双拷贝groELs转录差异的根本原因和分子调控机制,并鉴定到一个与groEL相关的新型调控因子,初步解释了其作用机制和存在意义。在黄色粘球菌DK1622基因组中存在双拷贝groEL和单拷贝groES基因,groaEL1(MXAN_4895)与其上游的groES(MXAN_4894)以操纵子形式存在,而groEL2(MXAN_4467)单独存在。我们在4861个完全测序的原核生物基因组中发现,19.5%的基因组中存在groEL重复现象,其中884个菌株具有双拷贝的groEL基因,且770个菌株中存在上游无相邻groES的groEL基因。目前还不清楚单独存在的groEL是否需要groES才能发挥作用,如果需要的话,双拷贝groEL和单拷贝groES基因又将如何平衡它们的表达水平。前期研究表明,黄色粘球菌DK1622可耐受双拷贝groELs中任一拷贝的失活,但二者不能被同时敲除。我们对于单拷贝groES的必要性也进行了分析,发现groES的存在是细胞存活所必需的。进一步的体内和体外依赖性分析实验证明了GroEL1和GroEL2在功能上都需要GroES的协助。在表达上,groEL1或groEL2的敲除不仅降低了groEL的表达,且降低了groES的表达,而groEL的异位回补则恢复了ggES和grSEL的表达。值得注意的是,当我们在groEL2基因前添加一个额外的groES基因以形成一个人工构建的groESL2操纵子时,对groES和groELs的表达几乎没有影响,但当我们通过自主复制质粒pZJY41使groES过表达时groEL又会显着上调。以上结果表明,黄色粘球菌DK1622可以协同调控双拷贝groELs和单拷贝groES的表达,促进了GroELs和GroES的功能协同。在双拷贝groELs和单拷贝groES具有协同功能和表达的基础上,我们进一步分析了其中存在的调控机制。通过不同生长时间点的q-PCR分析发现,黄色粘球菌DK1622中两个groEL基因的转录水平存在显着差异。我们首先证明了负调控因子HrcA和正调控因子σ32共同调节双拷贝groEEs的转录,hrcA和σ32的双重缺失可以消除两个groEL基因的转录差异。此外,我们还发现启动子区中的反向互补回文序列CIRCE元件(负调控蛋白HrcA的结合序列)与两个groEL基因的转录调控有关。groESL1的启动子区中存在两个CIRCE元件(CIRCE1groESL1和CIRCE2groEsL1),而groEL2的启动子区只有一个CIRCE元件(CIRCEgroEL2)。在代表性细菌类群中,CIRCE元件的组成和位置通常都是保守的。进一步的体外结合实验表明,HrcA蛋白的结合倾向于CIRCE1groESL1,其次为CIRCEgroEL2,但其与CIRCE2groESL1不能结合。而碱基突变实验则显示,回文序列中的单碱基突变对HrcA与CIRCE元件的结合力有一定影响。最后,为了更直观的研究两个调控因子的作用,我们在大肠杆菌中构建了一个体内转录调控系统,将每个调控因子与不同的groEL启动子交叉配对。结果显示,HrcA和σ32的调控分别偏好于groEL2和groESL1的启动子区。基于启动子序列特征,我们在黄色粘球菌DK1622中提出了一种协同调控双拷贝groELs转录的基本模型。σ32蛋白能够与RNA聚合酶的核心酶结合,导致其结合在目的基因启动子区的-10区和-35区处,从而起始下游基因的转录;而HrcA则能够结合CIRCE元件从而抑制下游基因的转录。在黄色粘球菌DK1622中,HrcA蛋白与CIRCE1groESL1的结合力要强于CIRCEgroEL2,但不能结合CIRCE2groESL1,较强的CIRCE1groESL1分布在groESL1启动子的TSS和TLS之间,而CIRCEgroEL2位于groEL2的TSS上游且部分核苷酸与-35区重迭。对于groESL1的转录,HrcA和σ32结合在相应的识别序列上,HrcA与CIRCE1groESL1的结合影响了RNA聚合酶结合在启动子区域上从而阻止了转录,两种调控过程互不干扰。但对于groEL2的转录,HrcA和σ32竞争性地结合在启动子区域内,这可能在一定程度上削弱了σ32与启动子的结合能力,从而降低了σ32对groEL2的正调控作用。这种CIRCE位置上的差异导致了HrcA和σ32调控的偏好性,从而造成了双拷贝groEL基因的转录差异。而在热激条件下,尽管hrcA的转录上调,但HrcA蛋白不能完全复性,从而削弱了HrcA与CIRCE元件的结合能力。σ32的转录在热激下也会上调,这会引起更多的RNA聚合酶结合在启动子区,从而进一步上调双拷贝groELs的表达。即在热激条件下,双拷贝groELs的转录水平均明显高于正常条件下的转录水平,但也可以在HrcA和σ32的双重调控下达到一种动态平衡。在研究双拷贝groELs的调控机制时,我们还发现了一个CheY同源蛋白编码基因(MXAN_4468)对groES及两个groEL基因的转录有影响。该基因在黄色粘球菌DK1622基因组中恰好位于groEL2的上游并与之同向相邻,然而,我们已经证明二者不是共转录关系。此外,CheY同源蛋白编码基因在所有已测序的粘细菌中只存在于单独存在的groEL基因的上下游,而groESL的邻近基因中却不存在这类基因。在黄色粘球菌DK1622基因组的其他位置上,我们也发现了多拷贝的CheY同源蛋白编码基因,说明这一类基因可能比较重要且功能多样。通过一系列相关突变株的构建,我们发现MXAN_4468对groES及groEL1/2的转录均具有很强的负调控作用,而这种作用可能是通过HrcA蛋白来实现的。MXAN_4468对groEL2的转录有直接抑制作用,其基因下游区域很可能存在groEL2的负调控序列。进一步,在蛋白结构保守性分析上,我们发现MXAN_4468蛋白具有一个保守的磷酸化位点(61st,天冬氨酸),作为双组分系统中的反应调节因子,MXAN_4468蛋白需要被组氨酸蛋白激酶磷酸化后才能够对groEEES及groEL1/2起到负调控作用或者发挥其它功能。总之,本文深入研究了双拷贝分子伴侣基因groELs的表达调控机制,以及其与单拷贝辅伴侣蛋白基因groES在功能和表达上的协同关系,并进行了新型调控因子的挖掘及其相关作用机制的初步探究。此外,我们推测双拷贝groEL基因的转录水平差异在基因重复的初期就已经产生了,早于功能分化出现的时间。转录水平差异可能帮助双拷贝groEL基因在基因组中留存下来,这是它们之后产生功能分化的前提。因此,我们认为关注重复基因的非编码区与关注重复基因本身同样重要,那些出现在重复基因之间非编码区的差异可能为编码区在序列和功能上的分歧提供了重要帮助。在具有众多重复基因的粘细菌中,groELs的转录水平显着高于其它重复拷贝,弄清二者的功能分化和调控机制以及存在的进化意义,为其它重复基因的研究提供了一定的理论基础和指导作用。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-26）

龚亚^[2]（2018）在《黄色粘球菌中亲缘辨别及其机制研究》一文中研究指出多种多样的细菌共同生活在同一个微生物群落中,为了有限的空间和资源,细菌之间需要进行激烈的竞争或合作。同类细胞之间可以产生大量有利于自身存活的合作行为,包括营养获得、群体运动、毒力保存、离子吸收、生物膜形成和子实体生成等。为了确保这些合作行为发生在同类细胞之间,细菌细胞需要对邻近细胞进行亲缘辨别。菌落融合不兼容是细菌中广泛存在的一种亲缘辨别表型,同类菌株的两个菌落相遇后可以融合,两个非同类菌株的菌落相遇后形成一条肉眼可见的界线。菌落融合不兼容表型最初在奇异变形杆菌Protus mirbilis中发现,最近在其他细菌中陆续被报道,其中涉及的分子遗传机制也正在被广泛研究。粘细菌是来自6变形杆菌纲,粘细菌目的革兰氏阴性细菌。其中,黄色粘球菌MyxococcusxanthusDK1622为模式菌株,已完成测序。黄色粘球菌具有多种多细胞行为,也被称为社会性细菌。在营养丰富的固体表面,黄色粘球菌多细胞协作进行群体运动。当营养匮乏时,黄色粘球菌多细胞聚集形成子实体,约99%细胞死亡,仅1%细胞成为抗逆性孢子,在营养丰富后,孢子可萌发成为营养细胞。此外,黄色粘球菌细胞会分泌大量抗生素和胞外酶类来协作捕食其他微生物细胞。黄色粘球菌的多细胞行为给予自身远超单个分散细胞的生存优势。实验室前期通过转座子随机插入获得了 3392个插入突变株,从中筛选得到11株异己识别突变株。这些异己识别突变株与MxanthusDK1622菌株之间形成菌落界线。插入基因位点分散分布在M xanthus DK1622基因组中,大多为未知功能的假定蛋白。此外,这些异己识别突变株自身的生长、运动、子实体发育和生孢能力正常。值得关注的是,这些突变株与野生菌株DK1622等量混合共发育/共培养时,展示出不同的竞争能力。与DK1622菌株共发育/共培养时,多数异己识别突变株的生孢/生长能力显着弱于自身单独生孢/生长、弱于DK1622菌株单独生孢/生长、也弱于共培养的DK1622菌株。而SI03/SI11突变株与DK1622菌株共发育/共培养时,两个菌株与各自单独情况下相比,无明显变化。此外,异己识别突变株之间也会形成明显的菌落界线,这些插入基因涉及的亲缘辨别功能可能是独立或不同的。进一步分析插入基因发现,其中5个异己识别突变株的插入基因是同源的,并且这五个基因上游紧邻的基因也是同源的。插入基因的同源基因编码一类分子量较小的酸性蛋白,功能未知。上游基因的同源基因编码一类分子量较大的碱性蛋白,多序列比对结果显示包含多个高保守的碱性氨基酸位点,保守的'AHH'基序,可能是一类新型核酸酶。插入基因的同源基因单敲除突变株与相应的异己识别突变株菌落融合,与DK1622菌株形成明显的菌落界线。上游基因的同源基因单敲除突变株与DK1622菌株的菌落融合,与相邻的插入基因单敲除突变株菌落也融合。因此这两组同源基因可能编码了一对具有拮抗作用的核酸酶及其抑制蛋白。同时,这两组同源蛋白之间具有相对应的进化关系,可能是协同进化的。五个插入基因的单基因敲除突变株之间也形成菌落分界线,说明这五对同源基因可能是独立行使功能的。基于SI01突变株的插入基因MXAN_0049和上游紧邻的MANN_0050基因为中心,研究其中的亲缘辨别机制。MXAN_0049基因缺失突变株与野生菌株DK1622菌落融合不兼容,与SI01菌株的菌落融合。MXAN_0049与MXAN_0050基因紧密相邻且共转录。MXAN—0050基因缺失突变株与DK1622菌株的菌落融合,同时与SI01菌株或MXAN_0049基因缺失突变株菌落也融合。在基因缺失突变株分别回补相应的缺失基因后,表型得到恢复,与野生菌株一致。这些菌株的菌落融合不兼容表型与MXAN_0050和MXAN_0049蛋白是功能相拮抗的核酸酶及其抑制蛋白的推测是一致的。为了证明这一推测,在大肠杆菌中将MXAN_0050蛋白进行异源表达纯化,获得的MXAN_0050蛋白可以消化基因组DNA,若MXAN_0049蛋白和MXAN_0050蛋白同时存在时,基因组DNA则不被消化。MXAN_0050和MXAN_0049蛋白也被证明具有蛋白-蛋白相互作用。进一步将MXAN_0050蛋白在大肠杆菌中诱导表达,其宿主菌的生长受到抑制,低浓度菌液不能生长;如MXAN_0049蛋白与MXAN_0050蛋白在大肠杆菌中共表达,其宿主菌的生长则不受抑制,低浓度菌液仍可以生长。在大肠杆菌中证明了 MXAN_0050蛋白是毒素,而MXAN_0049蛋白可免疫其毒性。若将MXAN_0049基因敲除突变株与DK1622菌株共培养,MXAN_0049基因敲除突变株被DK1622菌株杀死;MXAN_0049基因敲除突变株与MXAN_0050基因敲除突变株共培养,二者可以共存。因此,在黄色粘球菌中,MXAN_0050和MXAN_0049蛋白是一对核酸酶毒素和免疫蛋白,介导了菌落融合不兼容的产生。在邻近菌落融合不兼容或共培养过程中,MXAN_0050核酸酶作为毒素发挥作用,应在细胞间进行转移。而我们在MXAN_0050蛋白没有预测到信号肽或跨膜域,搜索MXAN_0050基因的上下游发现一个可能与蛋白质输出有关的MXAN_0044基因。MXAN_0044基因编码蛋白被预测为PAAR蛋白,而PAAR蛋白是Ⅵ型分泌系统(T6SS)的结构组分,可以携带效应物蛋白从一个细胞转移到接触的另一细胞内。MXAN_0044基因缺失突变株与野生菌株DK1622菌落融合,与SI01菌株或MXAN_0049基因缺失突变株菌落也融合。MXAN_0049基因缺失突变株可以与MX4N_0044基因缺失突变株共存。同时,在DK1622基因组中有一个完整的t6ss基因簇,文献报道这个基因簇可以工作,是一个具有功能的T6SS。将t6ss基因簇的几个关键基因进行敲除,敲除突变株类似地与DK1622或SI01菌株菌落融合。MXAN_0049基因缺失突变株与t6ss基因缺失突变株可以共存。通过这些预测和突变株表型推测MXAN_0050核酸酶应是通过PAAR-T6SS的联合作用输出到邻近细胞中发挥毒素作用的。将MXAN_0044和MXAN-0050基因的其他周边基因也进行单基因敲除,检测这些突变菌株的菌落融合表型,MXAN_0045、MXAN_0051 和 MXAN_0052 基因缺失突变株与 DK1622 或MXAN_0049基因缺失突变株的菌落融合,这叁个基因可能与MXAN_0050核酸酶的输出有关;MXAN_0043和MXAN_0048基因缺失突变株的菌落与DK1622菌株的菌落融合,而与MXAN_0049基因缺失突变株的菌落形成界线,可能与菌落融合不兼容机制无关;MXAN_0046和MXAN_0047基因是MXAN_0049基因的同源基因,但这两个基因缺失突变株与MXAN_0049基因缺失突变株间形成明显的菌落界线,说明这两个基因不能弥补MXAN_0049基因的功能。这些推测仍需更多实验证据进行证明。通过本文研究,给出一种简单的黄色粘球菌中基于核酸酶毒素与免疫蛋白的亲缘辨别模型。在黄色粘球菌DK1622中,MXAN_0050基因编码核酸酶毒素,而这个毒素可能被MXAN_0044基因编码的PAAR蛋白所携带。PAAR蛋白携带毒素并结合在T6SS的顶端,随后输出到邻近细胞中。野生菌株DK1622细胞含有MXAN_0049免疫蛋白,故不被另一 DK1622细胞输入的MXAN_0050核酸酶毒素所伤害。而MXAN_0049基因缺失的细胞被邻近细胞输入的MXAN_0050核酸酶毒素杀伤。因此,MXAN_0049基因缺失突变株与DK1622菌株混合共培养时,肥MXAN_0049基因缺失突变株被DK1622菌株杀死;MXAN_0049基因缺失突变株与DK1622菌株邻近培养时,二者菌落相遇处由于MXAN_0049基因缺失细胞被杀死而形成菌落分界线。而缺少MXAN_0050基因的细胞不含有核酸酶毒素,不能伤害MXAN_0049基因缺失细胞,二者可以共存,菌落融合。MXAN_0044或t6ss基因缺失细胞不再输出MXAN_0050核酸酶毒素,它们也可以与MXAN_0049基因缺失细胞共存,菌落融合。同源的五对核酸酶毒素与免疫蛋白在黄色粘球菌的菌落融合不兼容中独立发挥作用。只有两个菌株包含完全一样的五种免疫蛋白才会认为彼此是同类菌株,二者的菌落相遇时融合。若两种不同的免疫蛋白缺失突变株相遇时,由于各自缺少免疫蛋白,被相应的核酸酶毒素杀死,两种细胞互相残杀,菌落不融合,形成界线。基于五对同源的核酸酶毒素与免疫蛋白,在黄色粘球菌DK1622中组合形成25个亲缘辨别密钥,可产生32种不兼容型。若任何一个亲缘辨别相关基因发生突变,都会产生新的不兼容型。而菌落融合不兼容的存在又使得不兼容的菌株可以共存,这样,群体中的遗传多样性大大提升。面对变化的环境,多样性的群体适应能力也会提高。最终,种群被保存。(本文来源于《山东大学》期刊2018-11-25）

岳新晶^[3]（2018）在《埃博霉素在异源宿主黄色粘球菌中的生物合成和遗传改造研究》一文中研究指出埃博霉素(epothilone)是由粘细菌中的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的一类具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物,与着名的抗癌药物紫杉醇(taxol)具有类似的抗肿瘤机制,即促进微管蛋白聚合,稳定微管结构,抑制肿瘤细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成,进而抑制其生长。由于分子量更小,水溶性更好,对于多重耐药肿瘤细胞仍有很好的抑制活性,埃博霉素被认为是紫杉醇的更新替代产品。作为极具潜力的抗癌药物,埃博霉素迅速成为国内外生物和医药学等多个领域的研究热点。目前,埃博霉素主要通过微生发酵进行生产制备,由于发酵产量低,分离困难等原因,埃博霉素高昂的生产成本使其成为临床抗癌药物中的“天价药”。近年来,相关研究人员陆续尝试了在不同异源宿主中表达埃博霉素生物合成基因簇,但是表达产量远远低于本源菌。黄色粘球菌作为纤维堆囊菌的近缘宿主,因为其可以提供丰富的前体物质,生长代时更短,而且遗传操作体系成熟,被证明是高效表达埃博霉素的一个友好宿主。对于此类友好宿主,通过遗传改造提高埃博霉素基因簇在宿主中的表达水平,可能是从根本上解决埃博霉素异源表达低产问题的最直接途径,但是目前国内外对此方面的研究尚处于空白。本实验室在前期的工作中通过转座的方式将So0157-2的埃博霉素基因簇及上下游侧翼序列整合至黄色粘球菌DZ2的基因组中,获得突变菌株ZE菌,成功实现了埃博霉素的异源表达。借助于这样一个高效的异源宿主平台,我们围绕着进一步提高埃博霉素异源表达产量这一目标,对菌株的发酵条件进行了初步的优化,并且对埃博霉素基因簇的转录调控和宿主展开了一系列遗传改造研究。首先,我们对ZE菌的发酵条件进行了初步的研究,通过多个批次的发酵实验确定了菌株在实验室摇瓶发酵条件下的最佳接种比例和最佳发酵周期。在培养基中添加油酸甲酯不仅可以促进菌株的生长,也可以提高菌株中埃博霉素基因簇的转录水平,进而使得埃博霉素的异源表达产量获得约十倍的提升。为了更为直接有效地调控埃博霉素的合成,我们试图寻找与其相关的调控基因。本课题组在前期工作中发现,在So0157-2插入失活基因簇上游紧邻的一个基因后,埃博霉素的产量提高4倍,说明该基因的表达可能抑制埃博霉素的合成,并由此将该基因命名为esi(epothilone synthesis inhibitor)基因。随后,本论文在埃博霉素异源表达菌ZE中对这一结果进行验证,发现esi基因的表达水平与埃博霉素基因簇的转录水平及埃博霉素产量存在负相关。结合生物信息学分析预测和体外实验验证,我们确证esi基因所编码的蛋白可以结合埃博霉素基因簇的启动子并对基因簇的转录进行负调控,而且最佳的结合位点位于基因簇启动子转录起始位点下游的一个17 bp的特殊序列。这是目前报道的第一个,也是唯一一个埃博霉素的转录调控因子。在ZE菌株中敲除该负转录调控因子,埃博霉素基因的转录水平显着上调,埃博霉素的产量提高38%。启动子是调控基因转录水平的核心,所以我们试图使用内源性的强启动子来替换基因簇的原始启动子Pepo。我们选择了黄色粘球菌中两个高表达内源基因的启动子PpilA和PgroEL1,使用绿色荧光蛋白基因(gfp)作为报告基因在大肠杆菌中证明PpilA和PgroEL1表现出远高于埃博霉素基因簇启动子Pepo的转录活性。但是使用PpilA和PgroEL1分别替换Pepo后,埃博霉素的产量显着降低,降幅达80%。随后,我们在黄色粘球菌中详细分析了叁种启动子表达gfp基因和埃博霉素基因簇的时间模式,发现Pepo启动子在培养初期保持稳定而较低的转录活性,在培养后期转录活性显着增强,而PpilA和PgroEL1在菌株生长初期的转录活性很高,但是随着培养时间的延长,转录活性迅速下降。埃博霉素是一类次级代谢产物,一般认为在细胞生长的后期或稳定期开始大量合成,所以PpilA和PgroEL1启动子这种先高后低的表达时间模式不适合用于埃博霉素的合成。以上研究结果揭示了部分强启动子不适用于表达次级代谢产物的原因,也提示我们在通过启动子改造过表达目的基因时,除了启动子的转录强度,启动子转录基因的时间模式也应当作为一个重要的指标进行考量。埃博霉素的生物合成基因簇包含7个组成基因,各基因表现出不同的转录频率和转录丰度。基因簇内部转录水平低的基因,有可能成为限制埃博霉素合成速率的限速步骤。我们在埃博霉素基因簇内部不同位置插入额外的启动子,有效提高插入位点下游基因的转录水平,进而提高埃博霉素的表达产量。例如在epoB基因前分别插入Ppil4后,epoB、epoC和epoD的转录水平分别提高了 8.5倍,4.1倍和2.6倍,而埃博霉素的总产量分别提高34%。在同一位置插入Paph后,对基因簇转录和埃博霉素产量产生类似影响,只是影响程度较弱。此外,我们注意到启动子的插入对上游基因的转录产生不利影响。在epoE基因前插入Paph后,epoP-epoD的转录水平均显着下降,对应的埃博霉素产量也下降90%。启动子插入实验展示了通过协调基因簇各基因转录水平来调控埃博霉素产量,进而由此寻找埃博霉素合成过程中限速步骤的可行性,但是实验策略有待完善。黄色粘球菌可以合成大量PKS/NRPS次级代谢产物,内源性次级代谢产物与埃博霉素的合成竞争大量的前体物质和能量,所以我们试图对这些内源性的次级代谢基因簇进行失活。通过软件预测,在黄色粘球菌DZ2中可能存在24个次级代谢基因簇,其中仅有6个被详细研究并鉴定到了对应的产物。我们优先选择了 5个产物产量较高的PKS/NRPS基因簇,通过敲除关键基因对产物合成途径进行失活,最终成功获得4个次级代谢基因簇的单失活突变株。4个突变株具有类似的生长曲线,说明失活次级代谢基因簇对宿主的生长速度没有明显的影响,但是其中两个突变株中埃博霉素产量显着提高(提高幅度分别为34%和19%),而另外两个突变株的埃博霉素产量显着降低(降低幅度分别为61%和80%)。以上实验结果说明失活宿主菌内源性次级代谢基因簇对埃博霉素的合成产生截然不同的影响,反应出宿主内次级代谢复杂的调控网络。宿主菌中仍有大量内源性次级代谢基因簇有待研究,每个基因簇的逐个单失活实验可以规避产生不利影响的基因簇,有效筛选出敲除后能够促进埃博霉素合成的基因簇。我们预期通过多个基因簇的组合失活,不仅可以进一步提高埃博霉素的表达产量,也可以为精简宿主基因组,构建适合表达埃博霉素的底盘生物奠定初步的实验基础。综上所述,我们利用实验室前期构建的埃博霉素异源表达宿主平台,在优化异源表达菌株发酵条件的基础之上,利用异源宿主成熟的遗传操作体系,通过鉴定并敲除埃博霉素基因簇的负转录调控因子,基因簇的启动子改造和宿主菌内源性次级代谢基因簇的失活,有效提高了埃博霉素在异源宿主中的表达产量。以上叁种改造思路均能不同程度地促进埃博霉素的合成,我们预期通过整合不同改造策略,可以实现促进作用的累加,大幅提高埃博霉素的异源表达产量,使其能够媲美甚至优于本源菌。构建高产的埃博霉素异源表达菌株不仅有助于实现埃博霉素的高效率规模化生产,创造巨大的经济价值和社会效益,也使得通过遗传改造定向改造埃博霉素成为可能,为筛选新型抗肿瘤药物提供更多选择。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-30）

郑悦^[4]（2018）在《黄色粘球菌生物被膜中胞外DNA的整合机制与生物学功能》一文中研究指出自然条件下,细菌附着于生物或者非生物表面,通过一系列的复杂过程,形成群落化和高度结构化的生物被膜(biofilm)结构,该生物被膜结构主要由蛋白质,多糖,核酸等物质组成。生物被膜作为一种更有优势的生存模式,可以帮助细菌对抗恶劣的环境条件,如紫外线、金属毒害、不利pH、干燥、强盐、抗生素等不利环境。粘细菌(Myxobacteria)作为一类高等原核生物类群,是研究原核生物分化发育和细胞间信号传导的重要材料,并能形成十分复杂的生物被膜结构。通过我们的前期研究,首次证实了粘细菌的代表类群黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)形成的生物被膜胞外基质中存在大量高度组织化的胞外DNA(Extracellular DNA,eDNA),并且 eDNA 与胞外多糖(Extracellular polysaccharide,EPS)分子呈现了明显的共定位分布,形成了复合型的胞外基质(Extracellular matrix,ECM)。我们提出M.xnthus胞外基质中 eDNA 与EPS分子之间发生了大分子相互作用,这一相互关系导致了 eDNA以一种化学/物理有序的方式与EPS紧密交织,遵循类似的构建和分布方式,形成复合型胞外基质的网络结构,为黄色粘球菌生物被膜履行各种生物功能提供物质和结构基础。本论文综合利用微生物学、生物化学以及分子生物学等多种方法,按照从简单到复杂,从体内到体外,从化学分子水平到细胞系统水平的原则展开了相关研究。首先,我们对eDNA与EPS的相互作用进行了确认,接着探究二者相互作用的化学本质以及二者的相互作用对DNA构象的影响。我们对纯化后的eDNA和EPS进行了体外相互作用表征,利用透射电子显微镜观察,确认了二者可以在体外形成复合物。光散射技术建立的eDNA-EPS体外相互作用的表征体系表明,DNA-EPS复合物的形成可导致光散射强度的强烈增加。接着,我们探究了随pH的变化,EPS与DNA之间结合强度的变化。结果显示,荧光的增强幅度与pH有关。这说明在eDNA-EPS体外相互作用的过程中,静电作用可能处于主导位置。另外,使用溴化乙锭(EB)进行染料的竞争替代实验是表征待测物质与DNA相互作用的非常有效的方法。我们通过染料替代的实验方法验证了 EPS和DNA之间的结合作用。在不使用外源探针的情况下,我们利用傅里叶变换红外光谱技术测定DNA-EPS之间结合的特征,结果表明,EPS分子可能只是嵌入了 DNA分子的大沟中,并不足以影响DNA的构象。然后,我们通过圆二色谱进一步确认了 EPS对DNA构象的影响,实验结果表明DNA仍然保持了 B构象,也就是说EPS与DNA的相互作用是一种中弱强度的相互作用,保持了一定程度的可逆性。在上述的实验基础之上,我们表征了 eDNA-EPS的相互作用所赋予整合型ECM的相关生物学功能和特性,通过系统的实验证明了 eDNA与EPS的相互作用对于构建DNA-EPS整合型ECM以及功能的履行是十分重要的。首先,我们表征了 DNA-EPS复合物的粘着力,结果显示复合物的粘度比单独的DNA和EPS粘度明显增大。原子力显微镜(AFM)的检测结果也表明经DNase Ⅰ处理后的生物被膜表面粘附力也明显减弱。这说明eDNA对维持胞外基质的粘附力和机械强度有非常重要的作用。接下来我们确认了 EPS具有保护DNA免受各种核酸水解酶攻击的作用,从而保证eDNA在基质中持续稳定地存在。此外,我们证实了具有eDNA的M.xanthus DK1622生物被膜对于阴离子和阳离子表面活性剂具有更强的耐受性,并且去除eDNA后细胞对氨基糖苷类抗生素的耐受性减弱,这说明eDNA-EPS复合型的ECM可以提高生物被膜的耐受性和抗逆性。M.xanthus子实体和粘孢子是其抵御恶劣环境的一种策略,除此之外,M.xanthus可以捕食包括蓝细菌、大肠杆菌、根瘤菌等各种原核生物。我们探究了 eDNA缺陷菌株对粘细菌子实体发育和捕食的影响,结果表明,eDNA对于其子实体发育基本无影响,对大肠杆菌的捕食、摄食以及邻近捕食也无影响。有趣的是,我们发现在加入DNA的培养条件下,SW504(△difA)得到了更好的生长,说明eDNA可以作为细胞的营养成分支持其在饥饿条件下的存活。最后,我们分别在液体培养条件下以及生物被膜培养条件下对M.xanthus eDNA含量随其生长的变化趋势进行了测定。初步的研究结果表明,M.xanthus eDNA主要来自于细胞生长后期的细胞裂解,且eDNA与基因组DNA具有极高的相似性。另外,在细胞没有发生裂解的情况下,生长前期的eDNA的释放表明,M.xanthus很可能还存在一个eDNA的主动分泌过程,这一点还有待于进一步验证。本论文的研究结果不但可以帮助我们更加深入地了解eDNA和EPS在细菌生物被膜形成过程中的作用,还可为研究细菌生物被膜抗性以及寻找治疗相关疾病的药物提供借鉴。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-26）

彭冉^[5]（2017）在《黄色粘球菌CRISPR系统的功能分析及CRISPR/Cas9在粘球菌中的应用研究》一文中研究指出面对恶劣的生存环境,原核生物通常能够开发不同的策略来促进生存,适应不断变化的世界。构成自然防御机制的系统之一是具有区分自身与非自身核酸的能力。核酸可以通过感染、转导、接合或转化插入原核细胞,并且可能具有有害作用。防御机制包括限制性修饰系统、流产感染和表面排除系统,这些系统都是固有的且不具有特异性。而最近报道了一种特异性的防御系统,成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关蛋白 CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins),该系统可提供大多数古细菌和细菌针对外来核酸的适应性和遗传免疫。这种免疫机制基于掺入宿主基因组的外来DNA短片段,在转录后引导蛋白复合物靶向外来核酸并促进其降解。迄今为止,已经推测了 CRISPR系统的不同功能,可在包括染色体重排、DNA修复、基因表达调控、孢子和生物膜形成、致病菌抗性的获得以及水平基因转移等方面发挥作用。其中基于Ⅱ型CRISPR/Cas系统构建的新型基因编辑技术,它由识别靶位点DNA序列的sgRNA和Cas9蛋白组成,可对双链DNA进行定点切割。随着研究的深入,CRISPR/Cas9系统及其衍生技术在不同物种的基因组编辑中得到了广泛的应用。粘细菌是一类属于Delta变形菌纲的革兰氏阴性细菌,具有复杂的多细胞社会学行为并能产生丰富的次级代谢产物。粘细菌基因组庞大,且存在大量的重复基因和水平基因转移现象,暗示粘细菌的基因组易于整合外源DNA并进行染色体重排,这些现象都与CRISPR系统的功能相关。通过CRISPR database数据库对已测序的粘细菌基因组分析,发现两株纤维堆囊菌(S.cellulosum So ce 56和S.cellulos So0157-2)和五种粘球菌含有 CRISPR 系统。其中,M.fulvus 124B02基因组包含一个Cas操纵子,该区域内分布61个串联的spacers;M.fulvus HW-1基因组包含2个完整的Cas操纵子,含有130个spacers;M.stipitatus DSM 14675基因组包含2个完整的Cas操纵子,具有79个spacers;作为粘细菌的模式菌株黄色粘球菌M.xanthus DK1622基因组包含3个完整的Cas操纵子,159个spacers。本论文旨在探究黄色粘球菌CRISPR系统的功能,并在粘球菌中利用CRISPR/Cas9新型基因编辑技术建立高效快速的敲除系统,针对低表达的次级代谢基因簇利用CRISPRa技术进行转录激活,为在粘细菌中基因功能研究和次级代谢产物的挖掘提供新型有效的基因编辑工具;同时对黄色粘球菌复制相关的双拷贝DNA聚合酶Ⅲα亚基的功能进行分析,探讨了其在粘球菌环境适应与进化中所起的作用。为了探究黄色粘球菌CRISPR系统在细胞生存、多细胞形态发生、进化中的作用。本论文首先通过在线软件CRISPR database分析了M.xanthus DK1622自身的CRISPR系统,阐述其CRISPR结构特征,对多个CRISPR系统进行归类,描述分布规律,并利用CRISPR Target及BLAST对各个CRISPR基因座区域的spacer序列进行了生物信息学分析,对spacer序列匹配基因编码产物进行分析,发现有的与细菌生存有关,有的与侵染的噬菌体有关,有的与环境适应性有关。进一步,通过对DK1622各个CRISPR/Cas系统依次敲除,分析突变株与野生株在生长状态以及社会学行为之间的差别,从而探究CRISPR/Cas系统在菌株中发挥的功能。发现敲除CR1SPR2削弱了菌株的发育和生孢能力,而且敲除CRISPR3减少了黄色粘球菌DK1622胞外多糖(EPS)的产生,并提高了其自然转化的效率。探究了黄色粘球菌DK1622自身的CRISPR系统如何影响其生理学特征,并为在粘球菌中开发新的基因组编辑工具CRISPR/Cas9清除了自身免疫背景。作为目前粘细菌中遗传背景研究最清楚的菌株,黄色粘球菌DK1622已经作为异源表达宿主并进行了诸多研究。但DK1622基因组庞大,9.14Mb大小的基因组至少有1.4Mb来自于水平基因转移(HGT),大部分用来编码次级代谢产物。而目前M.xanthusDK1622的遗传操作主要通过转导和电穿孔的模式进行,例如:基于attB位点整合的pSWU30 质粒和随机整合质粒pMiniHimar-lacZ质粒可以完成基因插入基因组的目的;基于在橙色粘球菌124B02中发现的可自主复制的质粒构建的可在大肠杆菌与粘球菌间穿梭的pZJY41质粒,可以实现非基因组整合的基因引入。粘球菌中的基因敲除主要通过由PBJ113质粒的抗性基因盒和负筛选基因galK介导的二次同源重组实现,此方法需要两步筛选,第一步抗性筛选发生一次同源重组的菌株,获得的突变株需要第二次基于D-gal致死原理的负筛,获得发生二次同源重组的敲除菌株,该方法通量较低,这导致多基因组合敲除周期较长,而某些基因和反义RNA不能被敲除,同时某些基因敲除造成的染色体结构改变可能带来表型的假象,这些都限制了黄色粘球菌中的相关研究。近年来,大量研究发现来源于细菌免疫系统的CRISPR/Cas系统在基因编辑体现出的巨大的应用潜力。特别是来源于酿脓链球菌的II型CRISPR系统,因为其只需一个Cas蛋白(Cas9)与crRNA和tracrRNA嵌合体形成蛋白核酸复合体,扫描基因组寻找能与spacer互补配对的PAM序列,并进行目的基因的切割形成DNA双链断裂(DSBs)。该方法广泛应用于真核生物,以及少数几种原核生物中,完成了单基因的精准突变以及多基因的同时敲除。为了提高粘球菌属的遗传操作效率,我们建立基于CRISPR/Cas9系统的遗传操作工具用来删除基因组中的基因。我们将密码子优化后的Cas9蛋白基因导入DK1622与ACRISPR染色体,并融合表达荧光蛋白验证了 Cas9能够表达且正确折迭。发展出两种方法来修复靶向DNA双链断裂,一是引入真核生物中常见的不依赖同源模板的非同源末端修复系统(Non-homologousendjoining,NHEJ),通过来自于铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1和橙色粘球菌(M.fulvus)124B02的Ku和LigD蛋白行使NHEJ的作用,在Cas9切割目的基因后将两端接头修复,进而引起目的基因不同大小序列的删除;二是将增加了同源重组DNA模板HR,通过同源重组修复CRISPR/Cas9系统形成的双链断裂,完成基因的精确删除。该技术实现了在黄色粘球菌DK1622中大基因的一步敲除,大大缩短了基因组编辑的时间,成为在该菌中进行高效遗传操作的新工具。CRISPR/Cas9系统另一个引人注目的应用是将核酸酶失活的Cas9(dCas9)融合转录激活因子,可以结合目标基因而不进行切割,从而激活靶向基因的表达,称为CRISPRa。其相对传统过表达基因的优势在于针对一些难克隆或者较大的基因,可在基因的转录起始位点(TSS)激活。此方法是利用dCas9融合蛋白来招募RNA聚合酶。利用dCas9-激活因子的案例主要集中在哺乳动物细胞中,通常采用VP64或者p65AD融合到dCas9上,与sgRNA 一起对报告基因或者内源基因进行激活。目前将CRISPRa应用到细菌中的研究还比较少,主要是针对大肠杆菌、天蓝色链霉菌和肺炎链球菌中基因的激活。目前,利用CR1SPR对于微生物次级代谢基因簇进行激活没有被报道。作为粘细菌次级代谢产物异源表达的优秀宿主,黄色粘球菌DK1622具备代时短(4h)、菌体生长分散、可提供所需底物和酶等特点。本实验室之前将纤维堆囊菌So0157-2中合成抗癌聚酮化合物埃博霉素的56kb基因簇,通过转座的方式插入黄色粘球菌中,产量高于其他异源表达菌株,但仍具有提升的空间。我们期望通过CRISPRa对异源表达的埃博霉素基因簇进行转录激活。首先在异源表达埃博霉素的黄色粘球菌株ZE9中构建含有dCas9-激活因子的系统。然后在该基因簇启动子区针对两个转录起始位点(TSS1和TSS2),设计sgRNA引导dCas9-激活因子结合DNA的spacer序列。激活蛋白分别采用了黄色粘球菌DK1622的RNA聚合酶中的Omega亚基和alpha亚基,以及黄色粘球菌全局调控因子Sigma54和ECF Sigma因子CarQ。而且,我们通过目标产物埃博霉素的产量以及各个模块的转录量,比较了不同引导位点的sgRNA对埃博霉素基因簇的激活效果,以及比较了不同激活因子的激活能力。进一步,我们通过把dCas9-激活因子的组成型启动子改为能在黄色粘细菌中使用的铜离子诱导的启动子Pcuo,通过添加不同浓度的铜离子,使埃博霉素的产量有了进一步的提高。首次在粘细菌中建立基于CRISPR/Cas9的激活体系,同时也是在细菌中首次通过CRISPRa对次级代谢基因簇进行激活并获得可观的产物增加,为粘细菌以及其他微生物次级代谢基因簇的发掘提供了有力的工具。在对黄色粘球菌的复制和修复系统的研究中,我们发现所有的已测序粘细菌都具有两个dnaE基因,编码的DnaE是负责细菌基因组复制的DNA聚合酶III复合体的一种α亚基。通过对粘细菌两个dnaE基因进行系统发育分析,发现重复的dnaE基因高度保守且分别进化,说明了它们在粘细菌中的重要性。以黄色粘球菌DK1622作为模式菌,我们确证了dnaE1(MXAN_5844)对细胞生存是必不可少的,而dnaE2(MXAN_3982)编码复制相关的易错酶且可以被删除。dnaE2的敲除对黄色粘球菌DK1622的生长速率和社会型运动的影响甚微,但显着减弱了其发育和生孢能力,发育和生孢的变化可以被dnaE2的回补恢复。通过RT-qPCR对dnOE1和dnaE2在生长和发育阶段的表达量检测,发现dnaE1的表达水平始终高于dnaE2。dnaE2的过表达虽然高于dnOE1,但仍然无法代替dnOE1的功能,体现了dnaE2和dnaE1在蛋白结构上的差别。通过过表达dnaE2,提高了生长能力,增加了突变率,同时增强了发育和生孢的能力,证明dnaE2对DK1622的发育阶段起着重要的作用。因此推断dnaE2对基因组突变率起着平衡作用,既保证在恶劣环境中保持突变率保证菌株适应性,更避免了突变率过高对细胞带来的损害,表明dnaE2对黄色粘球菌的进化有一定的推动作用。本论文相关工作提出以下推论:1.利用在线软件对黄色粘球菌DK1622中CRISPR系统进行分析、分类,分析spacer序列的来源,系统研究了其中3个CRISPR系统与DK1622发育、生孢、运动等社会学行为以及自然转化之间的关系。将敲除自身CRISPR的菌株与外源CRISPR/Cas9系统的引入联系起来,排除自身免疫干扰。2.首次在粘细菌中开发了基于CRISPR/Cas9系统的基因敲除工具,实现了大基因的一步敲除,为以后在该菌中进行多基因同时删除或突变奠定了基础。3.首次将CRISPRa应用到微生物次级代谢基因簇的激活,成功提高了基因簇各个模块基因的转录水平和目标产物埃博霉素的产量。为基因组中未知功能基因簇的研究以及新的次级代谢产物的发现提供了新的工具。4.以黄色粘球菌DK1622为模板,研究了粘细菌的双拷贝基因dnaE,作为DNA聚合酶Ⅲα亚基的一种,在生活周期中起的作用,以及对其社会学行为产生的影响。提出了dnaE2对粘细菌环境适应和进化所起的潜在作用。(本文来源于《山东大学》期刊2017-05-25）

张坤梅^[6]（2017）在《黄色粘球菌中四型菌毛蛋白与胞外多糖特异性结合关键位点的研究》一文中研究指出作为粘细菌的模式菌,黄色粘球菌具备多细胞水平的典型社会性特征,能够进行复杂多样化的细胞行为并贯穿于其生命周期的各个环节,主要包括:在固体介质表面进行的群体细胞运动过程;群体细胞的捕食过程;子实体的发育。其中社会性细胞运动(S运动)是黄色粘球菌进行捕食和分化发育的行为基础,其分子机制的解析对黄色粘球菌多细胞水平的社会性行为研究具有重要的理论指导意义。S运动系统主要介导了黄色粘球菌细胞在固体表面的群体运动过程,与铜绿假单胞菌的颤动系统非常类似,胞外多糖(EPS)和Ⅳ型菌毛(TFP)参与的收缩模型是目前普遍接受的S运动分子机制。EPS为TFP的收缩提供了锚定的位点;细胞前导端伸出的TFP细丝抓住附近细胞产生的EPS并激发收缩,从而拉动细胞以粘-滑交替的方式前行。在这一过程中,TFP与EPS这两个胞外生物大分子之间的特异性相互作用的实质是极为重要的科学问题。在本学位论文中,我们对组成TFP的菌毛蛋白PilA与EPS在互作过程中各自参与识别的关键位点进行了探寻。首先,我们利用表面等离子共振的方法,基于直接偶联、多循环动力学-捕获、单循环动力学-捕获以及多循环动力学竞争等手段构建了 PilA-糖类生物大分子体外相互作用的检测体系。首先分析了 EPS天然类似物壳聚糖与PilA蛋白的相互作用。结果显示,不同分子量的壳聚糖均可以通过直接偶联的方式与PilA蛋白相互作用。随后,根据提取方法的不同,我们从黄色粘球菌DK1622菌株中获取了可溶性与不可溶性的EPS,在直接偶联模式下,无论是可溶性还是不可溶性的EPS均与PilA蛋白存在相互作用。直接偶联法由于偶联的方式简单被广泛应用,但是该方法也存在特异性吸附以及蛋白偶联方向不一致导致蛋白结合位点被屏蔽等弊端。因此,我们改进了检测手段,建立了多循环动力学-捕获法以及单循环动力学-捕获法,EPS与PilA蛋白相互作用的阳性信号响应值明显增大。既然EPS与PilA蛋白间存在相互作用,那么EPS参与识别PilA蛋白的关键位点是什么?我们分别检测了参与构成EPS的各个单糖组分与PilA蛋白之间的结合能力。结果显示,含有氨基的单糖能够与PilA蛋白结合,而无修饰的单糖以及N-乙酰修饰的氨基单糖均不能与PilA蛋白结合。该结果与等温滴定量热仪测定的结果一致。同时,基于多循环动力学-捕获法的竞争实验结果显示葡萄糖胺能够与EPS竞争性结合PilA蛋白。另一方面,我们对PilA蛋白参与识别EPS的关键位点也进行了分析。根据生物信息学分析的结果,我们推测PilA蛋白中有22个氨基酸残基位点可能参与了 EPS的识别。从中选取了 3个位点,即Tyr69、Trp146、Trp181,分别将其突变成为Ala。体外互作的结果显示,PilA(W146A、W181A)突变型蛋白和EPS的相互作用与野生型蛋白无差别,而PilA(Y69A)突变型蛋白与氨基糖类的相互作用消失,推测Tyr69可能是PilA蛋白与EPS互作识别时的关键位点。随后,将含有突变位点的全长PilA基因回补到PilA蛋白缺失菌株10410中,结果显示菌株 DK10410::PilAY69A,DK10410::PilAw146A和 DK10410::Pi1Aw181A在固体平板上的S运动能力丧失。在甲基纤维素实验中,菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAW146A呈现出一定程度的运动趋势,而菌株DK10410::PilAw181A没有明显运动趋势。Western Blot分析显示,叁种回补菌株均没有表面菌毛,菌株菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAw146A具有全细胞菌毛蛋白。根据以上实验结果,我们认为Trp146突变后能够产生PilA蛋白,但是PilA蛋白不能进行有效组装,而Trp181突变后不产生任何的PilA蛋白。Tyr69突变后能够产生少量的PilA蛋白,但是PilA蛋白不能进行有效组装。(本文来源于《山东大学》期刊2017-05-22）

刘付平^[7]（2017）在《黄色粘球菌DZ2中温度应答ECF-σ因子的研究》一文中研究指出胞质外功能σ因子(ECF-σ)是一类简单而多变的可替代σ因子,参与细胞对环境信号的感知和应答,是原核生物普遍使用的一种基本的信号转导与转录调控机制。以复杂多细胞群体行为及次级代谢产物产生能力而闻名的粘细菌(Myxobacteria)是一类广泛分布的环境微生物,可以耐受包括营养、温度、pH、渗透压、氧化等在内广泛的环境刺激而生长发育,但是对其生态适应机制却研究甚少。前期石美琳硕士以黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)DK1622基因组为参考序列,在M.xanthus DZ2菌株中构建了所有未见报道的35个ECF-σ因子和14个anti-σ因子的基因敲除突变株,分析了它们在各种非生物环境信号下的生长发育表型。在此基础上本论文开展了如下研究:一、以其筛选出的专一性温度信号应答ECF-σ因子MXAN_3959和MXAN_7214以及一个全局性信号应答(对所研究的环境信号均产生应答)ECF-σ因子MXAN_4147为靶标,研究它们各自的信号传导途径。首先通过基因回补菌株构建及表型分析,证实突变表型确实是由各基因的缺失所导致的。利用RT-qPCR技术检测了特定环境信号下各基因表达量的变化,结果显示除了全局性信号应答ECF-σ因子MXAN_4147的表达量在Na+胁迫条件下的表达量下降外,其他基因在相应条件下均有不同幅度的上升,这与它们各自突变体的生长表型是一致的。鉴于在没有环境刺激时,绝大多数ECF-σ因子与其同源的anti-σ因子结合而失活,我们又通过共转录实验、细菌双杂交系统分析了上述ECF-σ因子可能的anti-σ因子,结果表明,MXAN_3960、MXAN_7215和MXAN_4148可能分别为MXAN_3959、MXAN_7214和MXAN_4147对应的anti-σ因子。为预测它们可能参与调控的靶基因,我们在确定了它们各自所在的operon后,利用5'RACE技术检测了各自的转录起始位点,获得了 MXAN_3959、MXAN_7214的启动子序列,并以其为探针,预测了它们可能参与调控的靶基因。以上结果初步阐明了 M.xanthus DZ2中MXAN_3959和MXAN_7214参与高温应答的信号转导通路。另外,本文还对上述ECF-σ因子进行了异源表达和纯化,正在通过体内、外实验尝试鉴定各自调控的靶基因。以上结果不仅为阐明粘球菌中ECF-σ因子参与的温度应答调控机制奠定了基础,也为相关研究提供了技术积累。二、利用已有的突变株,筛选参与M.xanthus DZ2生物因素应答的ECF-σ因子,重点分析了各突变株对于次级代谢产物抗生素TA(Myxovirescin)合成的影响。通过指示菌株Acinetobacter baumannii 19606 COLR 和E.coli K12 MG1655 抑菌圈实验筛选到叁个影响TA产量的ECF-σ因子,分别是在抗生素TA合成过程中发挥正调控作用的MXAN_0203和MXAN_4148以及发挥负调控作用的MXAN_6173,为解析和改造M.xanthus次级代谢产物生物合成调控机制奠定了基础。(本文来源于《山东大学》期刊2017-05-18）

石美琳^[8]（2016）在《黄色粘球菌DZ2环境信号应答ECF sigma因子的筛选及功能鉴定》一文中研究指出细菌RNA聚合酶(RNAP)的σ因子对特定启动子序列的识别和结合决定了特定阶段和条件下细胞内基因表达的差异,是原核生物基因表达中最为保守的初级调控方式。除了决定细胞生存必须的主要σ因子外,多数细菌都编码有可替代σ因子,它们在诸如膜胁迫、营养获得、发育分化等广泛的细胞生理生化过程中发挥重要作用。胞质外功能σ因子(Extracytoplasmic Function sigma factor, ECFσ)是可替代σ因子中数量最多、序列最为多变的一类小的调控蛋白,一般受到跨膜的anti-σ因子调控,是原核生物感知和应答环境变化的重要的信号传导与调节机制之一。典型的粘细菌是一类以土壤为主要生境且分布广泛的环境微生物,拥有包括多细胞营养扩展、子实体形成和孢子分化在内的复杂生活周期。该类群拥有目前已知最大的细菌基因组,编码大量的ECF σ因子,推测它们在粘细菌适应多变自然生境、完成生活史中发挥重要作用,但尚缺乏系统的研究。通过对模式菌株基因组序列的生物信息学分析,我们从其编码的ECFσ/anti a基因中选择了尚未有报道的31个ECF σ因子和14个ECF anti-σ因子进行研究。我们首先利用同源重组敲除法,在模式菌株Myxococcus xanthus DZ2中成功构建了45个ECF σ/anti-σ单因子缺失突变株。鉴于ECF a因子主要是对胞外信号进行应答,而粘细菌的生态分布又较为广泛,我们首先选择了温度、pH、氧化水平、盐和渗透压力等非生物环境信号进行研究。对于每个信号分别设置5-10不同的梯度,测定背景株的生长情况并选择亚适生长条件作为后续分析的信号参数,分别是：温度26℃和35.5℃,酸碱度pH 6.4和pH 8.8,3%甘露醇,100mMNaCl和5 mM H2O2。在确定了上述具体信号和参数之后,我们深入比较了所有突变株与野生株在这些条件下的营养生长情况。在正常培养条件下,所有突变株的生长与野生菌株DZ2没有明显变化,符合ECFa因子为可替代a因子的作用特点。而在设定的压力条件下,许多突变株的生长减慢,提示相应的ECF a因子在该种环境信号应答中发挥作用。经过复筛验证,我们获得了与野生株生长曲线显着不同的11株突变株,其中有5株仅在某一种研究条件下生长减弱,分别为MXAN 2395、MXAN 3686、MXAN 3959、MXAN_4315和MXAN_6174基因敲除突变株,提示它们可能是特异性应答相应刺激。另外6株即MXAN 4147、MXAN 4148、 MXAN 4987、MXAN 6460、MXAN 6461和MXAN7214基因敲除突变株则在两种及以上设定条件下均出现了生长变化,提示它们可能应答多种环境变化。营养匮乏引发的多细胞子实体发育及抗逆性粘孢子分化是粘细菌最为显着的特征,这一过程受到严格的时间和空间调控,涉及到包括诸多调控途径如双组份系统等在内的复杂调控网络。但除了营养匮乏外,这一过程是否也会受到其他外界不利环境的影响?ECF a因子是否也参与了该过程的信号传导与调控?为了解答这些问题,我们比较了所有突变株与野生株在添加和不添加10 mM H2O2条件下的运动、子实体形成和孢子萌发率。结果显示,氧化压力条件下,与野生株相比,有25突变株与DZ2的运动不同,其中既有单独影响个体或者群体运动能力的,亦有同时影响两种运动能力的。而ECF a因子对于发育和生孢的影响则更为多样,例如,有7株突变株与正常饥饿信号刺激下的发育相关,进一步的功能鉴定将可以补充现有的粘细菌子实体发育信号途径。另有5株突变株与DZ2在正常条件下的发育和生孢率无明显差别或相对氧化压力下的差异较小,而在氧化压力条件下,其中3株MXAN_4316, MXAN_5410和MXAN7288基因缺失突变株现为发育延迟,生孢率明显降低,而MXAN 2394则表现为发育提前,生孢率明显升高,另1株和MXAN_4986基因缺失突变株的生孢率也明显升高。初步证实多种不利环境变化均可诱发粘细菌的发育分化过程。以上结果提示,ECF a因子对黄色粘球菌的运动、子实体形成和生孢等均发挥着广泛而复杂的调控作用。综合所有突变体表型,我们发现MXAN 6461基因缺失的性状最为显着,在高温、酸、碱、盐和氧化压力信号下它的生长都比野生株慢,且在营养匮乏条件下不能正常发育,也无法形成抗逆性的粘孢子。本论文最后部分对其进行了深入研究。我们首先通过基因回补实验确证了突变株的所有缺陷性状均由该基因缺失导致。qRT-PCR分析显示,野生株中的MXAN 6461基因在35.5 ℃、pH6.4、/pH8.8,3%甘露醇,100mM NaCl和5 mM H2O2条件下的表达量都有不同程度的提高,这与其条件下的生长表型相一致,说明该因子确实作为广谱性ECF σ因子参与粘细菌对高温、酸、碱、盐和氧化胁迫等环境信号的应答。转录分析同时显不,MXAN_6461与其上下游基因MXAN_6457- MXAN_6462共转录。将MXAN_6461异源表达纯化后进行了bandshift试验,结果显示其所在operon的启动子序列位于MXAN 6462基因上游500bp内。该基因簇中的MXANJ_460预测编码MXAN_6461的auti-σ因子。我们利用细菌双杂交试验证实MXAN_6460和MXAN_6461的编码产物确实存在相互作用。这些结果初步揭示了ECF a因子MXAN_6461的信号传导机制。综上所述,本论文系统研究了M. xanthus中ECF a因子在不同环境压力下的生长、运动、发育和孢子萌发等表型,对其中表型显着的ECF a因子进行了调控机制分析,为进一步研究鉴定不同ECF a因子的信号传导及应答机制奠定了扎实的基础。(本文来源于《山东大学》期刊2016-05-18）

林威鹏^[9]（2015）在《具有抑草潜力的化感水稻根际黄色粘球菌的增殖机制研究》一文中研究指出植物释放的化感物质与其根际土壤微生物相互作用最终决定植物化感潜力已成为当前普遍认可的学术观点。前期研究发现,水稻第2号染色体上的PAL基因(PAL-2)是化感水稻PI312777酚酸类物质合成的重要功能基因,该基因被干扰后的转基因植株酚酸类物质合成能力和化感抑草效果均明显弱于野生型植株,且转基因水稻根际土壤中的细菌多样性降低,其中包括粘球菌等粘细菌属微生物。已有研究还发现强化感水稻PI312777根际土壤中粘球菌数量丰富,并显着高于非化感水稻根际土壤中的数量,暗示粘球菌在水稻化感作用根际生物学过程中具有重要作用。据此,为深入揭示酚酸类化感物质与化感水稻根际粘球菌的相互关系,本研究以强化感水稻PI312777(PI)、非化感水稻Lemont(LE)以及化感水稻PI312777的PAL-2基因过量表达(PAL-OE)和干扰(PAL-RNAi)的转基因植株为材料,经甲醇浸提法提取水稻五叶期根系分泌液进行过滤除菌后,分别接种和不接种强化感水稻根际黄色粘球菌,检测混合物对稗草萌发和生长的影响。生测结果显示,经过滤除菌的不同水稻根系浸提液对稗草的生长抑制率均未达到显着差异;而PAL-OE根系浸提液与黄色粘球菌混合物的抑草率显着高于野生型PI312777根系浸提液与粘球菌混合物的抑草率,PAL-RNAi根系浸提液与粘球菌混合物的抑草率则显着降低;进一步运用实时荧光定量PCR(qPCR)检测不同处理下土壤中粘球菌的数量,结果表明生物测试显示出的化感抑草能力的强弱与土壤粘球菌属微生物的数量呈现出明显的正相关,暗示PAL-2基因调控酚酸类化感物质的合成与分泌后进一步影响了土壤中粘球菌属微生物的群体生长,最终对受体稗草产生化感效应。在此基础上,利用阿魏酸和肉桂酸对黄色粘球菌进行诱导培养,并动态检测黄色粘球菌的生长变化情况以及粘细菌对酚酸类物质的利用率,结果表明,适宜浓度的阿魏酸和肉桂酸均可作为信号物质促进粘细菌细胞的增殖,其中以0.10mM阿魏酸对黄色粘细菌增殖的促进作用最为明显。进一步利用二甲基化标记技术对阿魏酸诱导下黄色粘球菌菌体蛋白及分泌至发酵液中蛋白进行质谱鉴定,结果显示黄色粘球菌蛋白质表达量显着地受阿魏酸处理影响,其中在0.05mM与O.10mM阿魏酸诱导下,鉴定到共同上调表达的蛋白质76种,共同下调表达的蛋白质56种,其中共同上调表达的蛋白质涉及的功能包括营养生长、运动、信号响应与转导、代谢过程、次级代谢物质产生、群体捕食、转运和胞内运输等。对重要差异蛋白进行转录水平验证,结果显示不同浓度阿魏酸诱导下frzS、MXAN_2023、MXAN_3668和MXAN_3339基因在mRNA水平和相应蛋白水平的变化情况基本一致。进一步对Frz基因家族另外5个成员基因frzA、frzB、frzCD、frzE、frzG的表达变化模式进行检测,结果也显示0.1OmM阿魏酸诱导下黄色粘球菌中5个Frz成员基因均明显上调表达。上述研究结果初步揭示了具有化感抑草潜力的化感水稻根际黄色粘球菌的增殖机制,为深入理解水稻酚酸类化感物质与根际土壤微生物的相互作用机制提供了理论依据。(本文来源于《福建农林大学》期刊2015-04-01）

赵金凤,金晶,毛晓华^[10]（2015）在《黄色粘球菌发育阶段外膜蛋白表达的变化（英文）》一文中研究指出【目的】黄色粘球菌是研究原核发育的一种模式生物,对其膜蛋白的研究仍然十分缺乏。【方法】利用6种预测软件,在黄色粘球菌的基因组中筛选编码外膜蛋白(OMP)的基因。根据报告基因lac Z,检测这些基因在营养性生长和发育阶段的表达。【结果】基于生物信息学分析,筛选出11个编码外膜蛋白的基因。其中2个基因(MXAN3106和MXAN3883)在发育阶段表达量上升,它们分别编码Secretin家族和Fimbrial usher protein(FUP)家族转运蛋白。其余9个基因在发育起始阶段表达量降低或保持较低水平,它们均编码Ton B依赖型受体或外排蛋白。【结论】这些数据提示,黄色粘球菌由生长到发育的转换过程,伴随着膜蛋白表达的显着变化。(本文来源于《微生物学通报》期刊2015年06期）

黄色粘球菌论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

多种多样的细菌共同生活在同一个微生物群落中,为了有限的空间和资源,细菌之间需要进行激烈的竞争或合作。同类细胞之间可以产生大量有利于自身存活的合作行为,包括营养获得、群体运动、毒力保存、离子吸收、生物膜形成和子实体生成等。为了确保这些合作行为发生在同类细胞之间,细菌细胞需要对邻近细胞进行亲缘辨别。菌落融合不兼容是细菌中广泛存在的一种亲缘辨别表型,同类菌株的两个菌落相遇后可以融合,两个非同类菌株的菌落相遇后形成一条肉眼可见的界线。菌落融合不兼容表型最初在奇异变形杆菌Protus mirbilis中发现,最近在其他细菌中陆续被报道,其中涉及的分子遗传机制也正在被广泛研究。粘细菌是来自6变形杆菌纲,粘细菌目的革兰氏阴性细菌。其中,黄色粘球菌MyxococcusxanthusDK1622为模式菌株,已完成测序。黄色粘球菌具有多种多细胞行为,也被称为社会性细菌。在营养丰富的固体表面,黄色粘球菌多细胞协作进行群体运动。当营养匮乏时,黄色粘球菌多细胞聚集形成子实体,约99%细胞死亡,仅1%细胞成为抗逆性孢子,在营养丰富后,孢子可萌发成为营养细胞。此外,黄色粘球菌细胞会分泌大量抗生素和胞外酶类来协作捕食其他微生物细胞。黄色粘球菌的多细胞行为给予自身远超单个分散细胞的生存优势。实验室前期通过转座子随机插入获得了 3392个插入突变株,从中筛选得到11株异己识别突变株。这些异己识别突变株与MxanthusDK1622菌株之间形成菌落界线。插入基因位点分散分布在M xanthus DK1622基因组中,大多为未知功能的假定蛋白。此外,这些异己识别突变株自身的生长、运动、子实体发育和生孢能力正常。值得关注的是,这些突变株与野生菌株DK1622等量混合共发育/共培养时,展示出不同的竞争能力。与DK1622菌株共发育/共培养时,多数异己识别突变株的生孢/生长能力显着弱于自身单独生孢/生长、弱于DK1622菌株单独生孢/生长、也弱于共培养的DK1622菌株。而SI03/SI11突变株与DK1622菌株共发育/共培养时,两个菌株与各自单独情况下相比,无明显变化。此外,异己识别突变株之间也会形成明显的菌落界线,这些插入基因涉及的亲缘辨别功能可能是独立或不同的。进一步分析插入基因发现,其中5个异己识别突变株的插入基因是同源的,并且这五个基因上游紧邻的基因也是同源的。插入基因的同源基因编码一类分子量较小的酸性蛋白,功能未知。上游基因的同源基因编码一类分子量较大的碱性蛋白,多序列比对结果显示包含多个高保守的碱性氨基酸位点,保守的'AHH'基序,可能是一类新型核酸酶。插入基因的同源基因单敲除突变株与相应的异己识别突变株菌落融合,与DK1622菌株形成明显的菌落界线。上游基因的同源基因单敲除突变株与DK1622菌株的菌落融合,与相邻的插入基因单敲除突变株菌落也融合。因此这两组同源基因可能编码了一对具有拮抗作用的核酸酶及其抑制蛋白。同时,这两组同源蛋白之间具有相对应的进化关系,可能是协同进化的。五个插入基因的单基因敲除突变株之间也形成菌落分界线,说明这五对同源基因可能是独立行使功能的。基于SI01突变株的插入基因MXAN_0049和上游紧邻的MANN_0050基因为中心,研究其中的亲缘辨别机制。MXAN_0049基因缺失突变株与野生菌株DK1622菌落融合不兼容,与SI01菌株的菌落融合。MXAN_0049与MXAN_0050基因紧密相邻且共转录。MXAN—0050基因缺失突变株与DK1622菌株的菌落融合,同时与SI01菌株或MXAN_0049基因缺失突变株菌落也融合。在基因缺失突变株分别回补相应的缺失基因后,表型得到恢复,与野生菌株一致。这些菌株的菌落融合不兼容表型与MXAN_0050和MXAN_0049蛋白是功能相拮抗的核酸酶及其抑制蛋白的推测是一致的。为了证明这一推测,在大肠杆菌中将MXAN_0050蛋白进行异源表达纯化,获得的MXAN_0050蛋白可以消化基因组DNA,若MXAN_0049蛋白和MXAN_0050蛋白同时存在时,基因组DNA则不被消化。MXAN_0050和MXAN_0049蛋白也被证明具有蛋白-蛋白相互作用。进一步将MXAN_0050蛋白在大肠杆菌中诱导表达,其宿主菌的生长受到抑制,低浓度菌液不能生长;如MXAN_0049蛋白与MXAN_0050蛋白在大肠杆菌中共表达,其宿主菌的生长则不受抑制,低浓度菌液仍可以生长。在大肠杆菌中证明了 MXAN_0050蛋白是毒素,而MXAN_0049蛋白可免疫其毒性。若将MXAN_0049基因敲除突变株与DK1622菌株共培养,MXAN_0049基因敲除突变株被DK1622菌株杀死;MXAN_0049基因敲除突变株与MXAN_0050基因敲除突变株共培养,二者可以共存。因此,在黄色粘球菌中,MXAN_0050和MXAN_0049蛋白是一对核酸酶毒素和免疫蛋白,介导了菌落融合不兼容的产生。在邻近菌落融合不兼容或共培养过程中,MXAN_0050核酸酶作为毒素发挥作用,应在细胞间进行转移。而我们在MXAN_0050蛋白没有预测到信号肽或跨膜域,搜索MXAN_0050基因的上下游发现一个可能与蛋白质输出有关的MXAN_0044基因。MXAN_0044基因编码蛋白被预测为PAAR蛋白,而PAAR蛋白是Ⅵ型分泌系统(T6SS)的结构组分,可以携带效应物蛋白从一个细胞转移到接触的另一细胞内。MXAN_0044基因缺失突变株与野生菌株DK1622菌落融合,与SI01菌株或MXAN_0049基因缺失突变株菌落也融合。MXAN_0049基因缺失突变株可以与MX4N_0044基因缺失突变株共存。同时,在DK1622基因组中有一个完整的t6ss基因簇,文献报道这个基因簇可以工作,是一个具有功能的T6SS。将t6ss基因簇的几个关键基因进行敲除,敲除突变株类似地与DK1622或SI01菌株菌落融合。MXAN_0049基因缺失突变株与t6ss基因缺失突变株可以共存。通过这些预测和突变株表型推测MXAN_0050核酸酶应是通过PAAR-T6SS的联合作用输出到邻近细胞中发挥毒素作用的。将MXAN_0044和MXAN-0050基因的其他周边基因也进行单基因敲除,检测这些突变菌株的菌落融合表型,MXAN_0045、MXAN_0051 和 MXAN_0052 基因缺失突变株与 DK1622 或MXAN_0049基因缺失突变株的菌落融合,这叁个基因可能与MXAN_0050核酸酶的输出有关;MXAN_0043和MXAN_0048基因缺失突变株的菌落与DK1622菌株的菌落融合,而与MXAN_0049基因缺失突变株的菌落形成界线,可能与菌落融合不兼容机制无关;MXAN_0046和MXAN_0047基因是MXAN_0049基因的同源基因,但这两个基因缺失突变株与MXAN_0049基因缺失突变株间形成明显的菌落界线,说明这两个基因不能弥补MXAN_0049基因的功能。这些推测仍需更多实验证据进行证明。通过本文研究,给出一种简单的黄色粘球菌中基于核酸酶毒素与免疫蛋白的亲缘辨别模型。在黄色粘球菌DK1622中,MXAN_0050基因编码核酸酶毒素,而这个毒素可能被MXAN_0044基因编码的PAAR蛋白所携带。PAAR蛋白携带毒素并结合在T6SS的顶端,随后输出到邻近细胞中。野生菌株DK1622细胞含有MXAN_0049免疫蛋白,故不被另一 DK1622细胞输入的MXAN_0050核酸酶毒素所伤害。而MXAN_0049基因缺失的细胞被邻近细胞输入的MXAN_0050核酸酶毒素杀伤。因此,MXAN_0049基因缺失突变株与DK1622菌株混合共培养时,肥MXAN_0049基因缺失突变株被DK1622菌株杀死;MXAN_0049基因缺失突变株与DK1622菌株邻近培养时,二者菌落相遇处由于MXAN_0049基因缺失细胞被杀死而形成菌落分界线。而缺少MXAN_0050基因的细胞不含有核酸酶毒素,不能伤害MXAN_0049基因缺失细胞,二者可以共存,菌落融合。MXAN_0044或t6ss基因缺失细胞不再输出MXAN_0050核酸酶毒素,它们也可以与MXAN_0049基因缺失细胞共存,菌落融合。同源的五对核酸酶毒素与免疫蛋白在黄色粘球菌的菌落融合不兼容中独立发挥作用。只有两个菌株包含完全一样的五种免疫蛋白才会认为彼此是同类菌株,二者的菌落相遇时融合。若两种不同的免疫蛋白缺失突变株相遇时,由于各自缺少免疫蛋白,被相应的核酸酶毒素杀死,两种细胞互相残杀,菌落不融合,形成界线。基于五对同源的核酸酶毒素与免疫蛋白,在黄色粘球菌DK1622中组合形成25个亲缘辨别密钥,可产生32种不兼容型。若任何一个亲缘辨别相关基因发生突变,都会产生新的不兼容型。而菌落融合不兼容的存在又使得不兼容的菌株可以共存,这样,群体中的遗传多样性大大提升。面对变化的环境,多样性的群体适应能力也会提高。最终,种群被保存。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

黄色粘球菌论文参考文献

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标签：分子伴侣GroEL;  基因重复;  协同调控;  粘细菌;